Entwicklung optisch schaltbarer Spinmarker f¨ ur die Elektronen-
spinresonanzspektroskopie
Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
an der Universit¨ at Konstanz
vorgelegt von
Silvia Domingo K¨ ohler aus Lindau (Bodensee)
Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Chemie
Tag der m¨ undlichen Pr¨ ufung: 14. September 2012 1. Referent: Dr. Malte Drescher
2. Referent: Prof. Dr. Gunnar Jeschke
Konstanzer Online-Publikations-System (KOPS) URL: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:352-209057
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 5
2 Stand der Forschung 9
2.1 Mobilit¨atsmessungen in der Spinmarker-ESR-Spektroskopie . . 11
2.2 Abstandsmessungen in der ESR-Spektroskopie . . . 13
2.2.1 Das Vierpuls-DEER-Experiment . . . 13
2.3 ESR an Triplett-Systemen . . . 20
3 Analyse von Abstandsverteilungen 27 3.1 Numerische Simulationen . . . 28
3.2 Untersuchung mittels MD-Simulationen . . . 30
3.3 Anwendung auf experimentelle Daten . . . 33
3.3.1 Die Polyprolinhelix als Modellsystem . . . 33
3.4 Fazit . . . 36
4 Nitroxid-Nitroxid-Abstandsmessungen zur Aufkl¨arung intra- zellul¨arer, mechanischer Energie¨ubertragung 41 4.1 TonB in gramnegativen Bakterien . . . 42
4.2 CD-Messungen an TonB-Fragmenten . . . 45
4.3 ESR-Abstandsmessungen an TonB-Fragmenten . . . 46
4.4 Fazit . . . 54
5 Singulett-Triplett-Systeme als optisch adressierbare Spinmar- ker 59 5.1 Auswahl des Triplettsystems . . . 59
5.2 Charakterisierung des Triplettzustandes von Anthracen . . . . 60
5.3 Nitroxid-Triplett-DEER . . . 73
5.3.1 Verbesserung der Sensitivit¨at . . . 78
5.4 LaserIMD . . . 84
5.5 Nitroxid-Triplett-Abstandsmessungen an einem Modellsystem 89 5.6 Fazit . . . 97
1
6 Experimentelle Details 101
6.1 MD-Simulationen . . . 101
6.2 Rotamerberechungen . . . 102
6.3 Lichtquellen . . . 102
6.3.1 Die Quecksilberhochdrucklampe LAX1000 . . . 103
6.3.2 Der Excimer Laser ExciStarXS 500 . . . 104
6.3.3 Synchronisation Laser/Spektrometer . . . 105
6.4 Lichteinkopplung in den ESR-Resonator . . . 107
6.5 Probenpr¨aparation . . . 111
6.5.1 Sauerstofffreie Proben . . . 111
6.5.2 Peptidspinmarkierung . . . 112
6.6 Messparameter der ESR-Experimente . . . 116
6.6.1 DEER-Messungen . . . 116
6.6.2 Relaxationsmessungen . . . 117
6.6.3 Messungen des EDFS . . . 118
6.6.4 Cw-ESR-Messungen . . . 119
7 Zusammenfassung 123
Die Praxis sollte das Ergebnis des Nachdenkens sein, nicht umgekehrt.
Hermann Hesse
Kapitel 1 Einleitung
Der wichtigste Schritt auf dem Weg zum Verst¨andnis der Funktion biologi- scher Makromolek¨ule wie Proteine, DNA und RNA ist die Aufkl¨arung ih- rer Struktur. Die verbreitetsten Methoden zur Strukturaufkl¨arung sind zum einen die R¨ontgenstrukturanalyse und zum anderen NMR (Nuclear Magne- tic Resonance)-Spektroskopie. Ist eine Anwendung dieser Methoden nicht m¨oglich, beispielsweise weil das zu untersuchende Molek¨ul zu groß ist, sich nicht kristallisieren l¨asst, mehrere Konformationen parallel existieren oder die relevante Konformation nur in komplexer Umgebung vorliegt, stehen nur noch wenige Informationen zur Verf¨ugung.
Aufgrund entscheidender technischer und methodischer Entwicklungen hat in solchen F¨allen Elektronenspinresonanzspektroskopie (ESR-Spektroskopie) insbesondere in Kombination mit ortsspezifischer Spinmarkierung an Bedeu- tung gewonnen. Eine besondere Rolle spielen dabei Messungen von Abstands- verteilungen im Nanometerbereich zwischen gezielt eingebrachten Spinmar- kern. Mit modernen gepulsten ESR-Methoden ist ein Abstandsbereich zwi- schen 1,5 nm und 10 nm zug¨anglich.
Das Interesse wendet sich nun gr¨oßeren und komplexeren Systemen zu, bei denen die zur Verf¨ugung stehenden ESR-Methoden an ihre Grenzen stoßen.
Hier setzt die vorliegende Arbeit an.
Zum einen wird die Auswertung experimenteller Daten der ESR-Abstands- messungen durch die Flexibilit¨at des Linkers, mit dem der Spinmarker an- gebunden ist, erschwert. Um die Flexibilit¨at des Linkers ber¨ucksichtigen zu k¨onnen, auch wenn kein Strukturmodell des zu untersuchenden Molek¨uls vor- liegt, wird ein neuer modellbasierter Ansatz zur Analyse von Abstandsver- teilungen vorgestellt. Dieser Ansatz wird zur L¨osung einer biophysikalischen Fragestellung auf dem Gebiet des intrazellul¨aren mechanischen Energietrans-
5
6 1. EINLEITUNG fers angewandt. Zum anderen sind eine Ausdehnung des zug¨anglichen Ab- standsbereichs und eine erh¨ohte Selektivit¨at zur Untersuchung komplexer Systeme w¨unschenswert.
Der Fokus dieser Arbeit liegt auf dem Gebiet der Entwicklung eines neu- artigen Spinmarkers, der optisch adressierbar ist. Dieser basiert auf einem Singulett-Triplett-System und kann zur Erweiterung des zug¨anglichen Ab- standsbereichs und zur Erh¨ohung der Selektivit¨at genutzt werden.
Es gibt mehr Dinge im Himmel und auf Erden, als Eure Schulweisheit sich tr¨aumt.
William Shakespeare
Kapitel 2
Stand der Forschung
ESR (Elektronenspinresonanz)-Spektroskopie hat mit der Einf¨uhrung der ortsspezifischen Spinmarkierung vor einigen Jahren ein v¨ollig neues Feld f¨ur sich er¨offnet [1] [2]. Durch Bindung paramagnetischer Zentren an diamagne- tische Makromolek¨ule kann deren Dynamik und Struktur selbst in komplexer Umgebungen untersucht werden [3] [4].
F¨ur ortsspezifische Spinmarkierung werden meist Nitroxide verwendet [5] [6].
Ein Nitroxidmarker ist ein stabiles Radikal der generellen Form ·O-NR1R2, dessen freies Elektron zwischen Stickstoff und Sauerstoff delokalisiert ist. Die am h¨aufigsten verbreitete Methode f¨ur das Spinmarkieren ist die kovalente Bindung an die Thiolgruppe der Aminos¨aure Cystein, wie z.B. mittels MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetra-methylpyrroline-3-methyl-methanethiosulfonate). F¨ur ein m¨ogliches Protokoll sei hier auf Kapitel 6.5.2 verwiesen. Nitroxide haben sich als kleine Molek¨ule in der Vergangenheit bew¨ahrt, da sie einen gerin- gen Einfluss auf die Konformation des zu untersuchenden Systems zeigen [7]
[8]. Die schematische Darstellung eines gebundenen MTSL-Markers an eine Aminos¨aurensequenz wird in Abbildung 2.1 gezeigt. Mehrere Einfachbindun- gen im Linker zwischen Nitroxid und Cystein f¨uhren zu einer rotatorischen Freiheit, die zur Flexibilit¨at des Systems beitr¨agt.
Gerade in Verbindung mit Hochfeld-ESR-Methoden sind Metallzentren, z. B.
Gd3+, als Spinmarker interessant [9] oder Metalloproteine als Ansatzpunkt verschiedener ESR-Techniken [10].
Uber Spinmarker-ESR-Spektroskopie kann mittels diverser Techniken unter¨ anderem Aufschluss ¨uber Mobilit¨at des Spinmarkers und Abst¨ande zwischen weiteren paramagnetischen Zentren erzielt werden. Auf diese beiden Aspekte wird in den Kapiteln 2.1 und 2.2 detaillierter eingegangen.
9
10 2. STAND DER FORSCHUNG
Abbildung 2.1: Schematische Darstellung der Bindung eines MTSL-Markers an eine Aminos¨aurensequenz mit eingezeichneten Rotationsfreiheitsgraden des Linkers (modifiziert aus [11]).
Der Grundgedanke dieser Doktorarbeit ist die Entwicklung eines optisch adressierbaren Spinmarkers. Die optische Schaltbarkeit k¨onnte durch ein Sin- gulett-Triplett-System gew¨ahrleistet werden. Die Kombination eines schalt- baren Markers mit einem stabilen Radikal, wie z.B. einem Nitroxid, er¨offnet v¨ollig neue M¨oglichkeiten, da das komplette Triplettspektrum durch den Ein- schaltprozess aktiviert und nicht durch einen Mikrowellenpuls mit endlicher Anregungsbandbreite limitiert ist. Da die Unterscheidung der Marker dann nicht mehr spektral erfolgen m¨usste, k¨onnen die k¨urzest m¨oglichen Mikro- wellenpulse verwendet werden. Zudem k¨onnte bei einer einzigen Mikrowel- lenfrequenz gearbeitet werden, was technische und spektroskopische Vorteile bietet. Diese ¨Uberlegungen erlauben den Schluss, dass erhebliche Verbesse- rung in der Modulationstiefe und des Signal-zu-Rausch-Verh¨altnisses erzielt werden k¨onnten, und so den zug¨anglichen Abstandsmessbereich f¨ur ESR- Experimente erweitern k¨onnte.
Das Kapitel 2.3 befasst sich darum mit einem kurzen ¨Uberblick ¨uber ESR an Triplett-Systemen.
2.1 MOBILIT ¨ATSMESSUNGEN 11
2.1 Mobilit¨ atsmessungen in der Spinmarker- ESR-Spektroskopie
Das cw (continuous wave)-ESR-Spektrum eines Nitroxids zeichnet sich durch drei Linien aus, die aus der Hyperfeinwechselwirkung zwischen dem Elektron und dem Kernspin I = 1 des 14N-Stickstoffs entsteht. Aufgrund anisotroper Zeeman- und Hyperfeinwechselwirkung ist das ESR-Signal der Nitroxide von der Orientierung des Molek¨uls bez¨uglich des ¨außeren Magnetfeldes abh¨angig.
Rotatorische Bewegungen des Molek¨uls k¨onnen spektral unterschieden wer- den. Abbildung 2.2 zeigt Simulationen von sechs Nitroxidspektren f¨ur isotro- pe Rotation verschiedener Rotationskorrelationszeitenτcorr, die sich in einem Intervall zwischen Piko- und Mikrosekunden bewegen. Die Simulation er- folgte mit einem Matlab-basierten Programm (EasySpin [12]). Je gr¨oßer der Wert der Rotationskorrelationszeit, desto langsamer rotiert der Spinmarker.
Aufgrund der Detektion mittels Lock-in-Technik ist in cw-ESR-Spektren oft, und auch in dieser Arbeit, die erste Ableitung des Absorptionssignals abgebil- det. Ist ein Spinmarker an ein Makromolek¨ul gebunden, spielen verschiedene Komponenten der Rotationsbewegungen eine Rolle: Zum einen die Bewegung des Nitroxids selbst durch Linkerflexibilit¨aten (siehe auch Abbildung 2.1) und zum anderen Konformations¨anderungen und Rotation des Makromo- lek¨uls. ¨Uber die Auswertung dieser Spektren kann zun¨achst die Bindung des Spinmarkers am Makromolek¨ul ¨uberpr¨uft werden. Hierf¨ur vergleicht man die Spektren bzw. die Rotationskorrelationszeiten mit denen des freien Markers im gleichen L¨osungsmittel.
12 2. STAND DER FORSCHUNG
(a) Isotroper Grenzfall durch sehr schnelle Rotation (garlic).
(b) Schnelle Rotationτcorr= 100 ps (garlic).
(c) Schnelle Rotation τcorr = 1 ns (garlic).
(d) Langsames Taumelnτcorr= 3 ns (chili).
(e) Langsames Taumeln τcorr = 10 ns (chili).
(f) Starrer Grenzfall sehr langsamer Rotation (pepper).
Abbildung 2.2: Simulierte ESR-Spektren f¨ur Nitroxide im X-Band f¨ur verschiedene Rotationskorrelationszeiten τcorr. Die verwendeten EasySpin- Funktionen sind ebenfalls angegeben [12].
2.2 ABSTANDSMESSUNGEN 13
2.2 Abstandsmessungen in der ESR-Spektroskopie
Um Abst¨ande zwischen paramagnetischen Zentren messen zu k¨onnen, wird oft DEER (Double Electron Electron Resonance) oder synonym PELDOR (Pulsed Electron Double Resonance) verwendet. Milov et al. f¨uhrten ein Dreipuls-Experiment bei zwei Frequenzen in die gepulste Elektronenspinreso- nanzspektroskopie ein [13], die Vierpuls-Sequenz erm¨oglicht totzeitfreie Ex- perimente, die k¨urzere Abst¨ande zug¨anglich machen [14] [15] [16].
Gepulste Methoden zur Abstandsbestimmung sind auch bei nur einer Fre- quenz m¨oglich, z.B. mit Relaxation Induced Dipolar Modulation Enhance- ment, kurz RIDME [17]. Allerdings bietet diese Technik bei Messungen zwi- schen gleichen Spinmarkern keinen Vorteil gegen¨uber DEER.
Im Folgenden wird das Vierpuls-DEER-Experiment detaillierter erkl¨art, da diese Methode im Rahmen dieser Arbeit Anwendung gefunden hat.
2.2.1 Das Vierpuls-DEER-Experiment
Die am weitesten verbreitete Methode f¨ur Abstandsmessungen in der ESR- Spektroskopie bildet die Zweifrequenz-Methode DEER. Der zug¨angliche Ab- standsbereich liegt zwischen 1,8 nm und 6 nm f¨ur Membranproteine und bis zu 10 nm f¨ur deuterierte Proteine [16] [18]. Zudem k¨onnen Orientierungsstu- dien von paramagnetischen Zentren durchgef¨uhrt werden [19].
Der Methode liegt die Dipol-Dipol-Wechselwirkung zwischen zwei Elektro- nenspins zugrunde. H¨aufig wird f¨ur Abstandsmessungen ein diamagnetisches System durch ortsspezifische Spinmarkierung [20] mit einem Nitroxid verse- hen. Bei Systemen mit paramagnetischen Zentren, z.B. Metalloproteinen [10], k¨onnen direkt, sonst durch Einf¨uhrung eines weiteren Spins intramolekulare Abstandsmessungen durchgef¨uhrt werden. Anhand eines nitroxidmarkierten Systems wird im Weiteren das DEER-Experiment kurz dargestellt. F¨ur de- tailliertere Informationen sei auf die einschl¨agige Literatur verwiesen [16] [21].
Der Dipol-Dipol-Wechselwirkungsterm, der zum Spin-Hamiltonian beitr¨agt, lautet [14]:
Hˆdd= ˆSATDSˆB = 1 r3 · µ0
4π¯h ·gAgBµ2B
SˆASˆB− 3 r2
SˆA~r SˆB~r
, (2.1)
wobei A und B die wechselwirkenden Spins unterscheiden und~rden Verbin-
14 2. STAND DER FORSCHUNG dungsvektor zwischen den beiden darstellt.
F¨ur Spins in einem ¨außeren Magnetfeld erh¨alt man die Wechselwirkungsener- gie:
E = µ0µAµB 4π
1 r3
1−3 cos2Θ, (2.2) wobei Θ den Winkel zwischen der Verbindungsachse zwischen den beiden Spins und der Richtung des externen Magnetfeldes bezeichnet (siehe Abbil- dung 2.3).
Die Dipol-Dipol-Wechselwirkungsenergie ist proportional zu 1/r3und abh¨an- gig von Θ. Um ¨uber die Messung der Dipol-Dipol-Wechselwirkung eine Ab- standsinformation zu extrahieren, muss die Winkelabh¨angigkeit kontrolliert werden. L¨osung hierf¨ur ist, die Experimente in gefrorener Glasmatrix durch- zuf¨uhren, in der Molek¨ulorientierungen mit sin Θ gewichtet auftreten und nicht ausgemittelt werden. Die Dipol-Dipol-Wechselwirkung kann unter an- derem ¨uber das Vierpuls-DEER-Experiment bestimmt werden. Grundlegend ist, dass man A- und B-Spins unterscheiden kann, und dass die Wechsel- wirkungsenergie ¨uber einen Flip der B-Spins und die damit einhergehende Anderung des Magnetfeldes am Ort des Spins A bestimmt werden kann (sie-¨ he Abbildung 2.3).
(a) Lokales Feld, das durch einen B- Spin erzeugt wird.
(b) Invertiertes lokales Feld, das durch einen B-Spin erzeugt wird.
Abbildung 2.3: Dipole in einem ¨außeren Magnetfeld. Invertierung des lokalen Feldes eines Dipols.
2.2 ABSTANDSMESSUNGEN 15 Die Unterscheidung der addressierten Spins erfolgt ¨uber die Hyperfeinwech- selwirkung. Abbildung 2.4 zeigt einen Echo-detektierten Feldsweep (EDFS) eines Nitroxids im X-Band. Anregungen unterschiedlicher Bereiche (vgl. Ab- bildung 2.4 kleines Bild) erm¨oglichen es, A-Spins und B-Spins zu unterschei- den. Dies kann ¨uber ein Zweifrequenz-Experiment realisiert werden. In der Abbildung 2.4 sind die sogenannte Beobachterfrequenz νobs f¨ur A-Spins und die Pumpfrequenzνpump f¨ur B-Spins markiert. Zudem sind exemplarisch ein π-Pumppuls der L¨ange τπ = 12 ns und ein π-Observerpuls der L¨ange τπ
= 32 ns im Frequenzraum mit einem f¨ur Nitroxide im X-Band typischen Frequenzabstand von ∆ν = 70 MHz dargestellt. L¨ange und spektrale Positi- on der Pulse werden so gew¨ahlt, dass die spektrale ¨Uberlappung minimiert wird. So k¨onnen unerw¨unschte Magnetisierungspfade, die zu Signalartefakten f¨uhren, ausgeschlossen werden [22].
Abbildung 2.4: Echo-detektierter Feldsweep an einem Nitroxid in glasartiger Matrix (schwarze Linie), Messparameter siehe Kapitel 6.6.3. Die Nitroxid- molek¨ulorientierungen bez¨uglich des ¨außeren Magnetfeldes sind f¨ur die drei Peaks im Spektrum eingezeichnet. Mit Pfeilen markiert sind die Positionen an die die Beobachter- bzw. Pumppulssequenz angesetzt wird. Kleines Bild: Ein 32 ns und ein 12 ns Rechteckpuls dargestellt im Frequenzraum, mit 70 MHz Abstand zueinander.
16 2. STAND DER FORSCHUNG Eine schematische Darstellung der zum Experiment geh¨orenden Pulssequenz findet sich in Abbildung 2.5. Auf der Beobachterfrequenz folgt nach einer Hahn-Echo-Sequenz ein refokussierender Puls. Die Intensit¨at des refokussier- ten Echos wird ¨uber ein Integrationsfenster aufgenommen. Auf der Pumpfre- quenz invertiert ein π-Puls die B-Spins und ¨andert so das Magnetfeld am Ort der A-Spins (siehe Abbildung 2.3), und moduliert, bedingt durch die Dipol-Dipol-Wechselwirkung, die Echointensit¨at. Die Echoamplitude wird als Funktion der Pumppulseinstrahlunsposition t’ gemessen.
Abbildung 2.5: Vierpuls-DEER-Pulssequenz. Die Frequenz f¨ur die Beobach- tersequenz ist mit νobs bezeichnet, die der Pumpsequenz mitνpump.
Umτ1undτ2f¨ur die zu messende Probe zu optimieren, wird eineT2-Messung durchgef¨uhrt (Abbildung 2.6). Die Echointensit¨at wird in Abh¨angigkeit vom Pulsabstand τ aufgenommen.
Abbildung 2.6: Schematische Pulssequenz f¨ur eine T2-Messung.
Eine f¨ur Nitroxide typischeT2-Messung ist in Graphik 2.7 abgebildet. Die ex- perimentellen Daten zeigen nicht nur den Echozerfall aufgrundT2-Relaxation, sondern auch Modulationen bedingt durch die Kopplung mit Deuterium- und Protonen-Kernspins. In einem solchen Fall kann die Zeitkonstante ¨uber ei- ne einh¨ullende Exponentialfunktion (wie in Abbildung 2.7 gezeigt) der Form:
2.2 ABSTANDSMESSUNGEN 17
V(τ) = V(0)e(−2τ /T2) (2.3) ermittelt werden [23]. Die Frequenz der Kernmodulationen kann ¨uber Divi- sion der experimentellen Daten durch eine angepasste Exponentialfunktion und anschließender Fouriertransformation bestimmt werden. F¨ur Deuterium- bzw. Protonen-Kernspins zeigt sich eine Frequenz von etwa 2 MHz bzw.
14 MHz im X-Band [24].
0 2 0 0 0 4 0 0 0 6 0 0 0 8 0 0 0
2t [ n s ]
Abbildung 2.7: Schwarz: T2-Messung an MTSL in einer Probe: 5 mM Anthracen-d10 und 0,2 mM MTSL in Toluol-d8, Messparameter siehe Ka- pitel 6.6.2. Rot: Fit gem¨aß Gleichung 2.3, T2 = 1935 ns.
Anhand der T2-Messung k¨onnen die Pulsabst¨ande τ1 und τ2 des DEER- Experiments optimiert werden. τ1 wird auf ein Kernmodulationsmaximum gesetzt und τ2 ist durch T2 limitiert. Die Wiederholrate des Experiments, invers zur sogenannten ’Shot Repetition Time’ (SRT), h¨angt von der Rela- xationszeitT1ab, also der Zeit, in der die Probe wieder ins thermodynamische Gleichgewicht zur¨uckrelaxiert.
Ein exemplarisches Ergebnis einer DEER-Messung an einem doppelt spin- markierten Modellsystem findet sich in Abbildung 2.8 a). Die DEER-Kurve enth¨alt auch Beitr¨age, die aus intermolekularen Wechselwirkungen herr¨uhren.
Um intramolekulare Abstandsinformationen zu extrahieren, muss die DEER- Kurve um diesen Hintergrund korrigiert werden. Das Echosignal V(t) setzt sich wie folgt zusammen:
18 2. STAND DER FORSCHUNG
V(t) = F(t)B(t), (2.4)
wobei F(t) als Formfaktor bezeichnet wird (Beitr¨age von Spinpaaren im glei- chen Nanoobjekt) und B(t) die Hintergrundfunktion (Beitr¨age von Wechsel- wirkungen benachbarter Nanoobjekte) darstellt [25]. F¨ur den Fall homogen verteilter Nanoobjekte ist dieser Hintergrundbeitrag durch die Funktion:
B(t) =e(−ktD/3) (2.5)
gegeben, wobeiDdie Dimension der Spinverteilung undkdie Spinkonzentra- tion darstellt. Der intermolekulare Beitrag kann auch experimentell bestimmt werden, in dem man eine DEER-Messung an einfachmarkierten Varianten des zu untersuchenden Systems durchf¨uhrt (Details hierzu siehe [26]).
Aufgrund der endlichen Anregungsbandbreite des Pumppulses (siehe kleines Bild in 2.4) wird nur ein Teil des Spektrums angeregt und der Formfaktor F(t) f¨allt auf einen von Null verschiedenen Wert 1-λ ab, siehe Abbildung 2.8 b), wobei λ die Modulationstiefe bezeichnet. F¨ur einen Pumppuls der L¨ange 12 ns ist f¨ur ein doppelt nitroxidmarkiertes Nanoobjekt ein Wert von λ = 0,49 zu erwarten [27].
Um aus dem Formfaktor bzw. der dipolaren Entwicklung die Abstandsinfor- mation zu extrahieren, muss eine genaue Datenanalyse vorgenommen wer- den. Die Verbindung zwischen Abstand und Dipol-Dipol-Wechselwirkung ist nicht direkt, sondern h¨angt zudem vom Winkel Θ ab. Ein definierter Abstand resultiert in einer einzigen Modulationsfrequenz und kann direkt ¨uber die Fouriertransformation der experimentellen Daten bestimmt werden. Durch die Orientierungsabh¨angigkeit resultiert die Fouriertransformation in einem Pake-Pattern, wie es simuliert in Abbildung 2.9 zu sehen ist. Der Weg von der DEER-Messung (die aus einer Abstandsverteilung resultiert) zur Ab- standsbestimung ist hingegen nicht eindeutig, da alle Beitr¨age, wie z.B. das Rauschen, ausgewertet werden. Die Berechnung einer Abstandsverteilung aus dem Formfaktor erfordert ein gutes Signal-zu-Rausch-Verh¨altnis und stellt ein (leicht) unterbestimmtes Problem dar. Zur L¨osung kann die Tikhonov- Regularisierung herangezogen werden [28]. ¨Uber einen Regularisierungspara- meter α wird die Gl¨attung der Abstandsverteilung beeinflusst. Das richtige Verh¨altnis zwischen zu starker und zu schwacher Gl¨attung ist nicht bekannt, und wird ¨uber ein L-Kurven-Kriterium bestimmt (f¨ur Details siehe [25]). In Abbildung 2.8 c) ist das Ergebnis der Abstandsanalyse per Tikhonov-Regula- risierung zu sehen.
2.2 ABSTANDSMESSUNGEN 19 Alternativ kann eine Analyse ¨uber einen modellbasierten Ansatz durchgef¨uhrt werden. Hier wird z.B. eine gaussf¨ormige Abstandverteilung zugrunde gelegt und das Maximum der resultierenden Kurve als
”mittlerer Abstand“ ausge- wertet. Der Vorteil liegt darin, dass die Gausskurve nur durch zwei Parameter definiert wird. Hier sei auf Kapitel 3 verwiesen.
Um von der gewonnenen Abstandsverteilung auf die Struktur des Makro- molek¨uls schließen zu k¨onnen, sollte eine Analyse der Spinmarkerflexibilit¨at vorgenommen werden. F¨ur Proteine stehen hierf¨ur Rotamer-Bibliotheken zur Verf¨ugung, in Abh¨angigkeit benachbarter Aminos¨auren [29]. F¨ur diese Ana- lyse ist ein Strukturmodell des Proteins notwendig.
0 , 0 0 , 5 1 , 0 1 , 5 2 , 0 2 , 5 3 , 0 3 , 5
0 , 7 0 0 , 7 5 0 , 8 0 0 , 8 5 0 , 9 0 0 , 9 5 1 , 0 0
V(t)/V(0)
t ' [ms ]
(a) Normierte Echoamplitude als Funk- tion von t’ (schwarze Kurve). Rot: Hin- tergrundfunktion, die von dreidimensio- nal homogen verteilten Spins ausgeht.
0 , 0 0 , 5 1 , 0 1 , 5 2 , 0 2 , 5 3 , 0 3 , 5
0 , 7 5 0 , 8 0 0 , 8 5 0 , 9 0 0 , 9 5 1 , 0 0
Diploare Entwicklung
t ' [ms ]
l
(b) Echoamplitude nach Division durch die Hintergrundfunktion. Bester Tikhonov-Fit laut L-Kurven-Kriterium (α= 100) in rot dargestellt.
1 , 5 2 , 0 2 , 5 3 , 0 3 , 5 4 , 0 4 , 5 5 , 0 5 , 5 6 , 0
0 , 0 0 0 0 , 0 0 1 0 , 0 0 2 0 , 0 0 3 0 , 0 0 4 0 , 0 0 5 0 , 0 0 6
p(r)
r [ n m ]
(c) Aus der Tikhonov-Anpassung resul- tierende Abstandsverteilung f¨ur einenα- Parameter von 100.
Abbildung 2.8: Messergebnis und Auswertung eines DEER-Experiments an einem doppelt nitroxidmarkierten Polyprolinpeptid (AP6C) in D2O, Mess- parameter siehe Kapitel 6.6.1.
20 2. STAND DER FORSCHUNG
Abbildung 2.9: Simuliertes Pake-Pattern. Θ bezeichnet den Winkel zwischen Spin-Spin-Verbindungsvektor und ¨außerem Magnetfeld (aus [14] entnom- men).
Das große Interesse an ESR-Abstandsmessungen f¨uhrt zu Bestrebungen die- se Methode weiterzuentwickeln. Ein Ansatzpunkt, den viele Arbeitsgruppen verfolgen, ist die Entwicklung neuartiger Spinmarker [9] [30] [31] [32] [33].
Z. B. zeigt der Trend, Messungen in der lebenden Zelle durchzuf¨uhren, dass Nitroxide hier nicht immer die beste Wahl darstellen, da die Zellumgebung den Spinmarker reduziert [34].
2.3 ESR an Triplett-Systemen
Molekulare Zust¨ande, in welchen zwei ungepaarte Elektronen zu S = 1 kop- peln werden Triplettzust¨ande genannt. Durch Anlegen eines starken ¨außeren Magnetfeldes wird eine Aufspaltung in mS = 0 und ±1 induziert. Die Si- tuation im Nullfeld (ohne magnetisches Feld) ist in Abbildung 2.10 in einem Jablonski-Diagramm dargestellt. Vom GrundzustandS0 k¨onnen Molek¨ule in angeregte Singulettzust¨ande gehoben werden (in der Abbildung ist der erste angeregte SingulettzustandS1, ohne Schwingungszust¨ande, zu sehen). Durch Fluoreszenz kann das Molek¨ul wieder in den Grundzustand fallen, oder es fin- det ein strahlungsloser Prozess in einen Triplettzustand statt, das sogenannte Inter System Crossing (ISC) (die Abbildung zeigt den energetisch niedrigsten Triplettzustand).
2.3 ESR AN TRIPLETT-SYSTEMEN 21 In Abbildung 2.10 ist die Entartung des Triplettzustandes aufgehoben. Grund hierf¨ur ist die Dipol-Dipol-Wechselwirkung zwischen den beiden ungepaarten Elektronen [35] [36] [37].
Abbildung 2.10: Jablonski-Diagramm f¨ur ein Singulett-Triplett-System.
Um den Spin-Hamiltonian f¨ur ESR an Triplett-Systemen aufstellen zu k¨onnen, m¨ussen vor allem zwei Wechselwirkungen ber¨ucksichtigt werden: die Zeeman- und die Spin-Spin-Wechselwirkung. Der Hamilton-Operator hat dann die Form [35]:
Hˆ =gβH·(S1+S2) +g2β2
(S1S2
r3 − 3(S1~r)(S2~r) r5
)
, (2.6)
wobei ~r den Abstandsvektor zwischen den beiden Elektronen darstellt. Die Kopplung von S1 und S2 resultiert in einem Gesamtspin ˆS. Die dipolare Wechselwirkung kann mittels eines effektiven Hamiltonians der Form:
HˆD= ˆS·D·S,ˆ (2.7) ausgedr¨uckt werden (vgl. Gleichung 2.1), wobeiD den Nullfeldaufspaltungs- Tensor bezeichnet. In einem Hauptachsensystem, welches D diagonalisiert, kann Gleichung 2.7 umgeschrieben werden in:
22 2. STAND DER FORSCHUNG
HˆD =D
Sz2− 1 3Sˆ2
+E(Sx2−Sy2), (2.8) wobeiD und E als Nullfeldaufspaltungsparameter bezeichnet werden (siehe auch Abbildung 2.10) und die Form haben:
D = 1
2(X+Y)−Z (2.9)
E = −1
2(X−Y) (2.10)
und X, Y und Z die Triplett-Energieniveaus im Nullfeld bezeichnen. Gr¨oße und Vorzeichen von D und E h¨angen von der Symmetrie des Molek¨uls ab. Eine detailliertere Darstellung dieses Zusammenhangs kann bei [38] in Kapitel 19 nachgelesen werden. In Abbildung 2.11 a)-c) ist die Zeeman- Aufspaltung der Triplett-Energieniveaus f¨ur D = 2184,3 MHz und E = -253,8 MHz in Abh¨angigkeit der Molek¨ulorientierung bez¨uglich des ¨auße- ren Magnetfeldes zu sehen mit den zugeh¨origen Niveau¨uberg¨angen f¨ur ESR im X-Band. F¨ur jede Orientierung finden sich zwei ¨Uberg¨ange mit ∆m =
±1 (siehe hierf¨ur [39]). Die Simulationen wurden mit dem Matlab-basierten Programm EasySpin durchgef¨uhrt. Die Nullfeldaufspaltungsparameter ent- sprechen einem Molek¨ul, das inx-Richtung gestreckt und scheibenf¨ormig ist.
Ein ESR-Absorptionsspektrum f¨ur eine Pulverprobe wurde berechnet und abgebildet, siehe Abb. 2.11 d). Die Markierung der Peaks f¨ur die kanoni- schen Orientierungen des Molek¨uls erfolgt nach der Festlegung: ¨Uberg¨ange
|−1i ↔ |0i sind mit ’1’ abgek¨urzt, |0i ↔ |+1i mit ’2’.
2.3 ESR AN TRIPLETT-SYSTEMEN 23
Abbildung 2.11: EasySpin-Simulationen f¨ur D > 0 und E < 0. Abbil- dungen a)-c): Zeeman-Aufspaltung f¨ur die drei kanonischen Orientierun- gen des Molek¨uls im Verh¨altnis zum ¨außeren Magnetfeld B. In rot sind die erlaubten ESR- ¨Uberg¨ange mit ∆m ± 1 f¨ur eine Mikrowellenfrequenz von ν = 9.3531 GHz eingezeichnet. d) entsprechend simuliertes ESR- Absorptionsspektrum einer Pulverprobe.
Die ersten ESR-Experimente an dem Singulett-Triplett-Molek¨ul Naphtalen wurden schon 1958 von Hutchison et al. ver¨offentlicht [40]. Die Kombination eines optisch aktiven Molek¨uls mit ESR-Spektroskopie fand schnell Anwen- dung, z.B. f¨ur ODMR (Optically Detected Magnetic Resonance) [41] [42].
Untersuchungen an Singulett-Triplett-Molek¨ulen im Zusammenhang mit bio- logischen Systemen sind ebenfalls bekannt [43] [44].
Die physikalischen Modelle unterscheiden sich von der Realit¨at wie die geographischen Karten von der Erdoberfl¨ache.
L´eon Brillouin
Kapitel 3
Analyse von
Abstandsverteilungen
ESR ist eine wirkungsvolle Methode, wenn es um die Untersuchung ungeord- neter Systeme geht [45]. Man erh¨alt Abstandsverteilungen im Bereich von 0,5 nm bis 10 nm; speziell mittels der Doppel-Elektron-Elektron-Resonanz (DEER)-Technik [13] [21] [46] wurden in den letzten Jahren große Erfol- ge erzielt. Inter- und intramolekulare Abst¨ande angebrachter Spinmarker k¨onnen ¨uber die Dipol-Dipol-Wechselwirkung extrahiert werden, siehe dazu Kapitel 2.2. F¨ur flexible Systeme oder lange Linker der gebundenen Mar- ker k¨onnen breite Abstandsverteilungen das Resultat sein. Deren Analyse kann modellbasiert oder ¨uber modellfreie Ans¨atze [47] [48], wie beispiels- weise die Tikhonov-Regularisierung, erfolgen. Ist die Struktur oder ein Mo- dell des Systems bekannt, z. B. mit Hilfe der Kristallographie, k¨onnen die Abstandsverteilungen auch ¨uber Rotamer-Bibliotheken ausgewertet werden [25] [29]. Modellbasierte Ans¨atze [46] [49] greifen oft auf eine gaussf¨ormi- ge Abstandsverteilung zur¨uck. Das Maximum der Abstandsverteilung (der wahrscheinlichste Abstand) wird dem Abstand der wahrscheinlichsten Spin- markerpositionen gleichgestellt.
Im folgenden Kapitel wird diese Vorgehensweise untersucht und es wird sich zeigen, dass sie problematisch, wenn nicht sogar fehlerhaft ist. Es wird eine alternative Analysemethode vorgestellt, basierend auf der Riceverteilung. Die Verwendung der Riceverteilung ist in anderen Disziplinen der Wissenschaft verbreitet, darunter Kristallographie [50] [51], Einzelmolek¨ulfluoreszenz-Spek- troskopie [52] [53] oder Magnetresonanzbildgebung [54] [55].
27
28 3. ANALYSE VON ABSTANDSVERTEILUNGEN
Abbildung 3.1: Schematische Darstellung zweier statistisch positionierter Va- riablen, die dreidimensional gaussverteilt sind. Die Zentren der Verteilungen sind durch den Abstand µ voneinander getrennt. Beide Verteilungen haben dieselbe Standardabweichung σ inx-,y- und z-Richtung [56].
3.1 Numerische Simulationen
Um die Problematik bei der Untersuchung von Abstandsverteilungen, die aus Abstandsmessungen zwischen Spinmarkern resultieren, darzustellen, geht man im einfachsten Fall von zwei gaussverteilten Spinmarkerpositionen aus.
Die Spinmarkerpositionen sind gaussverteilt in drei Dimensionen (x,yundz), mit einer Standardabweichung σ um zwei Mittelpunkte mit einem definier- ten Abstand µ (siehe Abbildung 3.1). Die resultierende Verteilung zwischen beiden Markern p(r) mit r = (∆x2 + ∆y2 + ∆z2)1/2 entspricht nicht ei- ner Gaussverteilung sondern einer Riceverteilung [57]. Dar¨uberhinaus weist die Abstandsverteilung ein Maximum auf, welches dem wahrscheinlichsten Abstand entspricht, aber von µ abweicht. Die Abweichung wird f¨ur kleine µ/σ-Verh¨altnisse gr¨oßer. Analog dazu gilt, dass das Maximum einer gauss- f¨ormigen Abstandsverteilung bei Abst¨anden auftritt, die gr¨oßer sind als der Abstand zwischen den wahrscheinlichsten Spinmarkerpositionen.
Die Abstandsverteilungp(r) kann mathematisch mittels einer Riceverteilung inn Dimensionen beschrieben werden, die wie folgt definiert ist:
p(r) = µ σ2
r µ
!π2
exp −(r2+µ2) 2σ2
!
I1
2(n−2)
rµ σ2
, (3.1)
3.1 NUMERISCHE SIMULATIONEN 29 mit der modifizierten Bessel-Funktion I. F¨ur drei Dimensionen entspricht dies:
p3D(r) =
s2 π
r
σriceµexp −µ2+r2 2σ2rice
!
sinh rµ σrice2
!
, (3.2)
mit σrice =√
2σ [57].
Die Auswirkung auf die Verteilung f¨ur eine Erh¨ohung der Standardabwei- chung σ sieht man in Abbildung 3.2. Hier werden numerisch simulierte Ab- st¨ande zwischen gaussverteilten Markerpositionen mit den zugeh¨origen Fits laut Gleichung 3.2 gezeigt. F¨ur große Werte von µ/σ, z.B. µ/σ = 10 (Ab- bildung 3.2 schwarze Kurve), ist die Verteilung ann¨ahernd gaussverteilt und das Maximum entspricht dem Abstand µ gut. F¨ur kleiner werdende Werte von µ/σ (Abbildung 3.2 Kurven gr¨un und blau), wird die Verteilung breiter und die Position des Maximums weicht stark von µab.
0 1 2 3 4
r
Abbildung 3.2: Numerische Simulation der Abstandsverteilungp(r) zwischen zwei gaussverteilten Positionen in drei Dimensionen (siehe dazu Abbildung 3.1). Der Abstand zwischen den Zentren der zwei Gaussverteilungen be- tr¨agt µ = 1 (rote Linie). Die Standardabweichungen wurden variiert: σ = 0,1 (schwarz), σ = 0,3 (gr¨un) und σ = 0,5 (blau).
Das bedeutet, dass f¨ur experimentell erlangte, schmale Abstandsverteilungen das Maximum der Verteilung oder das Zentrum der angepassten Gausskurve gut mit dem Abstand der wahrscheinlichsten Spinmarkerposition ¨uberein- stimmt, f¨ur breite Abstandsverteilungen aber eine starke Abweichung re- sultiert. Dieser Sachverhalt ist in Abbildung 3.3 zusammengefasst. Gezeigt
30 3. ANALYSE VON ABSTANDSVERTEILUNGEN werden die Anpassungen von Gauss- und Riceverteilungen an numerisch ge- nerierte Spinmarkerpositionen in drei Dimensionen. Die Standardabweichung wurde konstant aufσ= 0,5 festgelegt. F¨ur kleineµ/σ-Werte f¨uhrt der Fit mit einer Gausskurve zu erheblichen Abweichungen vom Abstand µ. In diesem Bereich empfiehlt sich der Gebrauch einer Gaussverteilung also nicht und das Abstandsergebnis weicht stark ab. Die Anpassung mit einer Riceverteilung entspricht f¨ur gaussf¨ormig verteilte Spinmarkerpositionen der analytischen L¨osung und liefert damit f¨ur alle Werte vonµ/σ den korrekten Abstand.
0 , 5 1 , 0 1 , 5 2 , 0 2 , 5 3 , 0 3 , 5 4 , 0 4 , 5
0 , 5 1 , 0 1 , 5 2 , 0 2 , 5 3 , 0 3 , 5 4 , 0 4 , 5
FitergebnisseµG, µR
S i m u l a t i o n s p a r a m e t e r µ
Abbildung 3.3: Vergleich verschiedener Fitmodelle. F¨ur jeden festgesetzten Abstand µ zwischen den Zentren der gaussverteilten Variablen mit einer Standardabweichung von σ = 0,5. Ein Histogramm der Abst¨ande zwischen beiden dreidimensionalen Gaussverteilungen wurde simuliert (wie f¨ur Abbil- dung 3.2). Eine Rice- und eine Gaussverteilung wurde an diese Histogramme angepasst. Die zugeh¨origen Fit-Ergebnisseµisind aufgetragen (gr¨une Kreise:
Gauss, rote Kreise: Rice). Die Ursprungsgerade (schwarze Linie) entspricht dem Simulationsparamter µ.
3.2 Untersuchung mittels MD-Simulationen
Um die aus Kapitel 3.1 gewonnenen Erkenntnisse auf ein realistischeres Pro- blem anzuwenden, wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Thomas Exner Mo- lekulardynamik (MD)-Simulationen durchgef¨uhrt. Auf die Details der MD- Simulationen wird in Kapitel 6.1 eingegangen.
Eine doppelstr¨angige DNA aus 12 Nukleotiden, doppelt mit dem Nitroxid- marker R5 (siehe Abbildung 3.4) markiert, wurde als Modellsystem heran- gezogen.
3.2 UNTERSUCHUNG MITTELS MD-SIMULATIONEN 31 Mit dem MD-ProgrammAMBER 10 wurde die DNA folgender Sequenz ge- neriert [58]:
5’ AAGCAAAAGCAA 3’ TTCGTTTTCGTT
Die unterstrichenen Cytosine wurden mit dem Spinmarker R5 (siehe Abbil- dung 3.4) versehen, wodurch sich ein Anfangsabstand zwischen den Sauer- stoffatomen der Marker von 1,7 nm ergibt. Die Anfangsstruktur der markier- ten DNA ist in Abbildung 3.5 zu sehen.
Abbildung 3.4: Struktur des phosphorothiolate-substituierten Nitroxidspin- markers R5 [56].
Abbildung 3.5: Darstellung einer markierten doppelstr¨angigen DNA. Die bei- den Spinmarker (im Kalottenmodell gezeichnet) sind an das jeweils vierte Nukleotid der Einzelstr¨ange gebunden. Der Abstand zwischen den Markern ist ¨uber den Abstand der Sauerstoffatome der Nitroxide berechnet (mit einem schwarzen Pfeil gekennzeichnet) [56].
32 3. ANALYSE VON ABSTANDSVERTEILUNGEN F¨ur die Analyse der Markerpositionen mittels MD-Simulationen, wird die Distanz der Sauerstoffatome der Marker gemessen, da sich das ungepaarte Elektron haupts¨achlich im π-Orbital entlang der N-O-Bindung aufh¨alt. Zur Analyse der MD-Daten wurde alle 2 ps ein Schnappschuss aufgenommen und der Sauerstoff-Sauerstoff-Abstand der Spinmarker gemessen. Die 5 ns- Zeitfolge dieses Abstandes f¨ur einen der unabh¨angigen MD-Rechnungen ist in Abbildung 3.6 dargestellt. Die hohe Flexibilit¨at des Spinmarkers manifestiert sich in Abst¨anden zwischen 0,5 nm und 3 nm.
Abbildung 3.6: Zeitfolge des Sauerstoff-Sauerstoff-Abstandes der Nitroxid- marker ¨uber einen Zeitraum von 5 ns f¨ur eine MD-Simulation.
Die Strukturergebnisse der Schnappsch¨usse wurden verwendet, um gemittel- te Koordinaten aller Atome zu berechnen. Aus diesen Koordinaten konn- te der Abstand der wahrscheinlichsten Sauerstoff-Sauerstoff-Positionen der Spinmarker und deren Standardabweichung gewonnen werden.
Diese Rechnungen k¨onnen zu einer Abstandsverteilungp(r) zusammengefasst werden, die in Abbildung 3.7 in schwarz eingezeichnet ist. Zudem kann die mittlere Position der Sauerstoffatome herangezogen werden, um eine Stan- dardabweichung σi, sowie den Abstand µ der wahrscheinlichsten Spinmar- kerposition auszurechnen. Das Ergebnis istσ1 = 0,27 nm bzw.σ2 = 0,26 nm f¨ur die zwei Marker mit einem Abstand von µ = 1,24 nm.
3.3 ANWENDUNG AUF EXPERIMENTELLE DATEN 33 An die Abstandsverteilung aus Abbildung 3.7 wurde eine Gausskurve (µG = 1,33 nm, σG = 0,38 nm) und eine Ricekurve (µR = 1,20 nm,σR = 0,40 nm) angepasst. Aus dem Vergleich der Ergebnisse l¨asst sich schließen, dass eine Riceverteilung die wahrscheinlichste Spinmarkerposition sehr gut wiedergibt, w¨ahrend die Ergebnisse aus der Gaussverteilung vom MD-Resultat abwei- chen.
0 , 0 0 , 5 1 , 0 1 , 5 2 , 0 2 , 5 3 , 0
0
2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0
µG
Anzahl
r [ n m ]
µR
Abbildung 3.7: Verteilung der Sauerstoff-Sauerstoff-Abst¨ande zwischen den Spinmarkern, die durch MD-Simulationen berechnet wurden (schwarze Li- nie). Angepasster Rice- (gr¨une Linie) und Gauss-Fit (rote Linie) mit resul- tierenden Abst¨andenµR und µG.
3.3 Anwendung auf experimentelle Daten
Bleibt zu zeigen, dass die hier besprochene Analysemethode auch f¨ur expe- rimentelle Daten bessere Ergebnisse liefert. Hierf¨ur wurde ein Modellsystem herangezogen, welches ein vergleichsweise starres St¨abchen bildet: eine Poly- prolinhelix.
3.3.1 Die Polyprolinhelix als Modellsystem
An ein Modellsystem f¨ur ESR-Abstandsmessungen sind diverse Bedingungen gekn¨upft. Es sollte ein System sein, das in der Literatur eingehend untersucht
34 3. ANALYSE VON ABSTANDSVERTEILUNGEN worden ist, um dessen Charakteristiken zu kennen. F¨ur eine klare Abstands- verteilung, sollte das System eine m¨oglichst geringe Flexibilit¨at besitzen.
Polyprolinpeptide bilden eine vergleichweise starre helikale Konformation.
Sowohl in der Natur vorkommende (z.B. Kollagen [59]) wie auch synthe- tische Polyprolinsysteme wurden in der Literatur eingehend untersucht [60]
[61] [62] [63]. Auch Abstandsmessung mittels FRET sind bekannt [64] [65]. Es existieren Arbeiten, die zeigen, dass eine Polyprolinhelix-Konformation einge- nommen werden kann, obwohl auch andere Aminos¨auren, wie z.B. Glutamin und Alanin, in der Sequenz vorhanden sind [66].
Die Polyprolinhelix ist in zwei verschiedenen Konformationen bekannt, abh¨an- gig von der L¨osungsmittelmatrix. Stabilisiert durch Wasserstoffbr¨uckenbin- dungen bildet ein Polyprolinpeptid in w¨assriger L¨osung eine PolyprolinII (PPII)-Struktur. Die Helix wird durch die Strukturparameter Φ, Ψ und ω definiert [62]. F¨ur eine PPII-Helix sind diese Φ = -75°, Ψ = 145° und ω = 180°(trans-Konformation). Diese Parameter sind f¨ur eine linksh¨andige Helix charakteristisch, bei der eine Umdrehung von n = 3 Aminos¨auren gebildet wird und pro Residuum eine H¨ohe von h = 3,1 ˚A angesetzt ist.
Abbildung 3.8: Polyprolinstruktur im ’stick’-Modell f¨ur ein Peptid P12. a:
PPII-Helix, b: PPI-Helix (aus [60] entnommen).
Diese Struktur ist exemplarisch in Abbildung 3.8a dargestellt. Die zweite Struktur definiert sich ¨uber die Parameter Φ = -75°, Ψ = 160° und ω = 0° (cis-Konformation), n = 3,3 und h = 1,9 ˚A, genannt PPI-Helix (siehe Ab- bildung 3.8b). Diese Helix zeichnet sich durch eine kompaktere Struktur und Rechtsh¨andigkeit aus. Eine Konformations¨anderung von einer PPII- zu einer PPI-Helix kann ¨uber eine trans/cis-Isomerisierung durch einen L¨osungsmit- teltausch induziert werden. Die PPI-Struktur stabilisiert sich in hydrophober Umgebung, so z.B. in aliphatischen Alkoholen wie 1-Propanol oder Methanol.
Dieser Prozess kann bis zu einigen Tagen dauern [63]. Der Strukturwechsel
3.3 ANWENDUNG AUF EXPERIMENTELLE DATEN 35 wird beg¨unstigt, je l¨anger die Peptidkette ist. Zudem kann die Stabilisierung durch die Ladung der Termini beeinflusst werden [60].
Die Polyprolinhelix soll als Modellsystem f¨ur konventionelle und neu entwi- ckelte Abstandsmessungen im Rahmen dieser Arbeit dienen.
0 , 0 0 , 5 1 , 0 1 , 5 2 , 0 2 , 5 3 , 0 3 , 5
0 , 6 0 0 , 6 5 0 , 7 0 0 , 7 5 0 , 8 0 0 , 8 5 0 , 9 0 0 , 9 5 1 , 0 0
Dipolare Entwicklung
t ' [ms ]
Abbildung 3.9: Normierte Vierpuls-DEER-Messung am spinmarkierten Mo- dellsystem Polyprolinhelix nach Hintergrundkorrektur, Messparameter sie- he Kapitel 6.6.1. Die rote Linie zeigt eine Anpassung berechnet ¨uber eine Tikhonov-Regularisierung. Die resultierende Abstandsverteilung ist der Ab- bildung 3.10 zu entnehmen.
Das synthetische Peptid Ac-CP13C-NH2 bildet in w¨assriger L¨osung eine Poly- prolinII-Helix (PPII) [60]. Die Cysteine werden mit dem Nitroxid MTSL markiert (Spinmarkierung siehe 6.5.2). In Abbildung 3.9 ist das Ergebnis ei- ner Vierpuls-DEER-Messung nach einer Hintergrundkorrektur zu sehen. Die rote Linie zeigt eine Anpassung durch die modellfreie Methode der Tikhonov- Regularisierung an die experimentellen Daten. Die resultierende Abstands- verteilung ist Abbildung 3.10 zu entnehmen. An diese Abstandsverteilung wurde eine Rice- und eine Gaussverteilung angepasst. Die sich daraus erge- benden Abst¨ande weichen stark voneinander ab (µR = 4,04 nm und µG = 4,20 nm, mitσR = 0,82 nm und σG = 0,80 nm).
36 3. ANALYSE VON ABSTANDSVERTEILUNGEN
2 , 0 2 , 5 3 , 0 3 , 5 4 , 0 4 , 5 5 , 0 5 , 5 6 , 0 6 , 5 7 , 0
µG
r [ n m ]
µR
Abbildung 3.10: Experimentell erhaltene Abstandsverteilung (schwarze Punkte) des Modellsystems, die mittels einer Tikhonov-Regularisierung be- stimmt wurde (siehe Abbildung 3.9). Eine Riceverteilung (gr¨une Linie, exakt unter der roten Linie) und eine Gaussverteilung (rote Linie) wurden ange- passt, woraus sich die Abst¨ande µR = 4,04 nm und µG = 4,20 nm ergeben.
3.4 Fazit
Es gibt einen Unterschied zwischen dem wahrscheinlichsten Spinmarkerab- stand und dem Abstand zwischen den wahrscheinlichsten Spinmarkerpositio- nen. Dieser Unterschied ist signifikant f¨urµ/σ <4 (siehe Abbildung 3.3) und f¨uhrt zu einem falschen Abstandsergebnis, wenn man den wahrscheinlichsten Spinmarkerabstand w¨ahlt. Dieser Sachverhalt wird bei folgendem Gedanken- experiment klar: reduziert man den Abstandµzwischen zwei gaussverteilten Spinmarkerpositionen (siehe Abbildung 3.1) auf µ = 0 nm (mit σ > 0 nm) und berechnet nun alle m¨oglichen Abst¨ande zwischen den Spinmarkerpo- sitionen, bekommt man eine Abstandsverteilung p(r) mit r ≥ 0 nm. Der wahrscheinlichste Spinmarkerabstand ist gr¨oßer als 0 und damit gr¨oßer als µ.
F¨ur den Fall, dass Rotamer-Bibliotheken oder MD-Simulationen nicht verf¨ug- bar sind, wird hier eine alternative Herangehensweise f¨ur eine modellbasierte Analyse vorgeschlagen: die Riceverteilung. Viele Anwender der Spinmarker- ESR-Methode verwenden den Nitroxidmarker MTSL, mit einer Linkerl¨ange von etwa 0,5 nm, was in einem doppeltmarkierten System zu einer Mar-
3.4 FAZIT 37 kerflexibilit¨at von ca. 1 nm f¨uhrt. Das heißt f¨ur Abstandsverteilungen mit µ < 3 nm gilt µ/σ < 3, so dass der wahrscheinlichste Spinmarkerabstand nicht dem Abstand zwischen den wahrscheinlichsten Spinmarkerpositionen entspricht. Hierf¨ur das Maximum der Abstandsverteilung zu w¨ahlen, kann zu falschen Ergebnissen f¨uhren. Dies wurde in Kapitel 3.1 anhand von nume- risch generierten Abstandsverteilungen gezeigt. In Kapitel 3.2 ist die St¨arke der Riceverteilung gegen¨uber der Gaussverteilung mittels MD-Simulationen klar hervorgegangen und auch die Anwendung auf experimentelle Daten in Kaitel 3.3 zeigt deutliche Unterschiede zwischen Rice- und Gaussverteilung.
Die Riceverteilung wurde durch Prof. Dr. Gunnar Jeschke als modellbasierte Analysemethode in das Auswerteprogramm DeerAnalysis 2011 aufgenom- men [67], welches das verbreitetste Programm zur Auswertung von DEER- Abstandsmessungen darstellt.
I will lay me down like a bridge over troubled water.
Simon and Garfunkel
Kapitel 4
Nitroxid-Nitroxid-
Abstandsmessungen zur Aufkl¨ arung intrazellul¨ arer, mechanischer
Energie¨ ubertragung
In diesem Kapitel wird gezeigt, wie Nitroxid-Nitroxid-Abstandsmessungen zur L¨osung einer biophysikalischen Fragestellung beitragen k¨onnen. Es han- delt sich dabei um die Beteiligung eines Proteins namens TonB am Ener- giehaushalt gramnegativer Bakterien. TonB ist ein 239 Aminos¨auren langes Protein, dessen N-Terminus (32 Residuen) in der inneren Membran veran- kert ist, w¨ahrend sich der Rest zwischen den Membranen aufh¨alt. Bislang ist eine komplette Strukturaufl¨osung dieses Proteins misslungen. Eine der zentralen Fragen in diesem Zusammenhang bezieht sich darauf, ob TonB eine Polyprolinhelix-Struktur aufweist und ob es lang genug ist, die inne- re und ¨außere Membran der Zelle zu verbinden. Antworten auf die offenen Fragen bez¨uglich dieses Systems k¨onnten ESR-Abstandsmessungen zusam- men mit den in Kapitel 3 etablierten Analysemethoden, sowie CD (Circular Dichroism)-Messungen geben.
Die Arbeiten zu diesem Kapitel wurden in Kooperation mit Prof. Dr. Wolf- ram Welte vom Fachbereich Biologie der Universit¨at Konstanz durchgef¨uhrt.
41
42 4. NITROXID-NITROXID-ABSTANDSMESSUNGEN
Abbildung 4.1: Schematische Darstellung des Proteins TonB und der Mem- branen gramnegativer Bakterien.
4.1 TonB in gramnegativen Bakterien
Gramnegative Bakterien (z.B. Escherichia coli) zeichnen sich durch das Vor- handensein zweier Membrane aus, die das Zellinnere von der Umgebung tren- nen (eine schematische Darstellung findet sich in Abbildung 4.1). Das Bakte- rium ist nur durch die Aufnahme von Siderophoren und anderen N¨ahrstoffen
¨uberlebensf¨ahig. Diese m¨ussen von außen in das Zellinnere gelangen. TonB spielt dabei erwiesenermaßen eine entscheidende Rolle [68]. Der Transport durch die ¨außere Membran (Outer Membrane: OM) ist nur durch sogenannte Membranrezeptoren (Outer Membrane Receptor: OMR) m¨oglich, wobei je- der Rezeptor spezialisiert ist auf die Aufnahme ausgew¨ahlter Molek¨ule [69].
Zahlenm¨aßig ¨ubertreffen die Rezeptoren TonB mit einem molaren Verh¨alt- nis von 12,5 [70]. Die Rezeptoren besitzen eine r¨ohrenartige Struktur in der Membran, in deren Inneren eine Korkdom¨ane die R¨ohre verschließt (Ab- bildung 4.2). F¨ur den Transport der N¨ahrstoffe durch den Rezeptor muss die Korkdom¨ane entfernt oder entfaltet werden, wozu Energie notwendig ist.
Diese Energie liegt in Form eines Protonengradienten ausschließlich zwischen Periplasma (Membranzwischenraum) und Zytoplasma (Zellineres) vor. Seit vielen Jahren bearbeiten Wissenschaftler die Fragestellung, wie Energie von der inneren, zytoplasmatischen Membran ¨uber das Periplasma an die ¨außere Membran ¨ubertragen werden kann [71] [72]. Die komplexbildenden Proteine ExbB, ExbD und TonB [73] [74] spielen dabei eine wichtige Rolle. Es ist be- kannt, dass der C-Terminus des TonB-Proteins ¨uber eineβ-Faltblattstruktur an die sogenannte TonB-Box des Rezeptors binden kann, sobald Liganden an den Rezeptor andocken (siehe Abbildung 4.2). Die TonB-Box wird von den
4.1 TONB IN GRAMNEGATIVEN BAKTERIEN 43 letzten ca. 7 Residuen des N-Terminus des Rezeptors gebildet, gefolgt von der Korkdom¨ane. Spinmarker-ESR-Messungen zeigen die leichte Zug¨anglichkeit der TonB-Box f¨ur die Wechselwirkung mit TonB [75]. ¨Uber die TonB-Box k¨onnte TonB einen Einfluss auf die Struktur der Korkdom¨ane und damit auf den Molek¨ultransport haben.
Abbildung 4.2: Komplex aus Außenmembranrezeptor FhuA und TonB. Die FhuA-Korkdom¨ane ist in gr¨un dargestellt (Residuen 19-160), die verbleiben- den Residuen (8-18 und 161-725) in blau. TonB ist in gelb gezeichnet (Resi- duen 158-235). Die Ansichtsebene ist senkrecht zur Außenmembran gew¨ahlt.
β-Faltblattstrukturen sind als flache Pfeile gezeichnet, helikale Strukturen als flache Spiralen [76].
Verschiedene Modelle, wie es zu einer Energie¨ubertragung des Protonengra- dienten zur ¨außeren Membran kommen kann, wurden bereits vorgeschlagen.
Das ’shuttle model’ legt eine energetisierte Konformation von TonB zugrun- de, die aus der Wechselwirkung mit dem Proteinkomplex ExbB/ExbD und dem Protonengradienten zustande kommt. Diese ’geladene Feder’ trennt sich von der inneren Membran und wandert ¨uber das Periplasma zum Rezeptor und ¨ubertr¨agt dort Energie [71].
Ein anderes Modell arbeitet mit der ¨Ahnlichkeit der Proteine ExbB und ExbD mit den Motorproteinen MotA und MotB im Flagellenmotor [77].
ExbB und ExbD k¨onnen mittels des Protonengradientens ein Drehmoment
44 4. NITROXID-NITROXID-ABSTANDSMESSUNGEN auf TonB aus¨uben, welches sich dann, gebunden an den Rezeptor, windet und die Korkdom¨ane entfaltet und so den Weg f¨ur die Siderophore freigibt.
Diese Hypothese ist unter dem Namen ’propeller model’ bekannt [72]. Zwei Varianten dieses Modells sind in Abbildung 4.3 dargestellt.
Abbildung 4.3: Schematische Darstellung des Propellermodellansatzes. Ein TonB-Dimer mit a) einem einzigen Komplex des Trimers aus ExbB/ExbD oder b) zwei Komplexen aus ExbB/ExbD [72].
Gumbart et al. [78] untersuchten mittels MD-Simulationen das Herausziehen der Korkdom¨ane aus dem Rezeptor, indem sie eine ziehende Kraft auf den gebundenen C-Terminus von TonB senkrecht zur Membran, anwandten.
Die dieser Arbeit zugrundeliegende und von Wolfram Welte entwickelte Ar- beitshypothese basiert auf der Tatsache, dass TonB einen prolinreichen Mit- telteil von ca. 100 Aminos¨auren besitzt. Mit einem Prolinanteil von 33 % ist dieser Abschnitt der Sequenz ¨uberdurchschnittlich prolinreich. Eine pro- linreiche Sequenz in w¨assriger Umgebung l¨asst auf eine PolyprolinII-Helix- Struktur (PPII) schließen (siehe auch Kapitel 3.3.1). Die PPII-Konformation ist auch noch mit einem gewissen Anteil anderer Aminos¨auren [66] [62] sta- bil. Der Prozess k¨onnte wie folgt aussehen: der Komplex aus ExbB/ExbD
¨ubt mittels Protonengradientens ein st¨andiges Drehmoment auf das TonB- Protein aus. Sobald TonB an die TonB-Box des Rezeptors gebunden wird, f¨uhrt die Fixierung an beiden Enden des Proteins dazu, dass die Drehung ei- ne Konformations¨anderung von PPII zu PPI induziert. Die Verk¨urzung des Proteins k¨onnte dann die Korkdom¨ane aus der Rezeptorr¨ohre ziehen. In die- sem Fall w¨are im Gegensatz zum Propellermodell nur ein TonB-Monomer beteiligt.
4.2 CD-MESSUNGEN AN TONB-FRAGMENTEN 45 Ein entscheidender Anhaltspunkt zur St¨utzung der letztgenannten Modelle stellt die L¨ange des TonB-Proteins dar. Ist es lang und ausgestreckt genug, die 15-20 nm [79] zwischen den beiden Membranen zu ¨uberbr¨ucken? NMR- Arbeiten deuten bereits eine ausgestreckte Konformation an [80] [81]. Aller- dings liefern die NMR-Daten nur kurzreichweitige Abstandsinformationen.
Kristallisationsversuche des kompletten TonB-Proteins waren bislang verge- bens.
CD-Messungen und ESR-Abstandsmessungen sind ideale Methoden, um In- formationen ¨uber Struktur und L¨ange des Proteins zu bekommen [82].
4.2 CD-Messungen an TonB-Fragmenten
Mittels CD-Messungen k¨onnen Informationen ¨uber die Sekund¨arstruktur von Makromolek¨ulen erzielt werden. Der Unterschied zwischen der Absorption von links- und rechtspolarisiertem Licht f¨uhrt zu Spektren, deren Verlauf f¨ur bestimmte Sekund¨arstrukturen, wie z.B. einer PPII-Helix, typisch sein kann.
Die Experimente wurden an einem Jasco J-715-Spektrometer durchgef¨uhrt.
Die Proben wurden in einer Quarzflachzelle (ca. 150µl Probenvolumen, 1 mm Lichtweg) bei Raumtemperatur gemessen. Eine Korrektur des Hintergrund- signals ist mit dem jeweiligen reinen L¨osungsmittel durchgef¨uhrt worden.
Ein synthetisches Polyprolinpeptid (Sequenz CP13C), welches eine PPII- Helix bildet, wurde als Referenz herangezogen (siehe hierf¨ur Kapitel 3.3.1) [60]. F¨ur eine Konzentration von 30 µM in deuteriertem Wasser bei Raum- temperatur erh¨alt man ein Spektrum, wie es in Abbildung 4.4 a) zu finden ist. Der charakteristische Verlauf der molaren Elliptizit¨at mit einem Mini- mum bei λ = 205 nm ist eindeutig zu erkennen.
Der exprimierte und aufgereinigte prolinreiche Part des TonB-Proteins (Re- siduen 56-126, siehe auch Abbildung 4.5), wurde in deuteriertem Wasser zu einer Konzentration von ca. 150 µM gel¨ost. In Abbildung 4.4 b) ist das Er- gebnis der CD-Messung zu sehen. Das Spektrum zeigt ein starkes Minimum der molaren Elliptizit¨at beiλ= 205 nm, was verglichen mit der Referenz ein deutliches Indiz f¨ur eine PPII-Struktur ist.
Langreichweitige Strukturinformationen k¨onnen ESR-Abstandsmessungen lie- fern.
46 4. NITROXID-NITROXID-ABSTANDSMESSUNGEN
1 8 0 1 9 0 2 0 0 2 1 0 2 2 0 2 3 0 2 4 0 2 5 0 2 6 0 2 7 0
- 1 8 0 0 0 - 1 6 0 0 0 - 1 4 0 0 0 - 1 2 0 0 0 - 1 0 0 0 0 - 8 0 0 0 - 6 0 0 0 - 4 0 0 0 - 2 0 0 0
Molare Elliptizität [deg cm2 dmol-1]
W e l l e n l ä n g e [ n m ]
(a) 30µM Refernzpeptid CP13C in D2O.
1 8 0 1 9 0 2 0 0 2 1 0 2 2 0 2 3 0 2 4 0 2 5 0 2 6 0
- 2 5 0 0 0 0 0 - 2 0 0 0 0 0 0 - 1 5 0 0 0 0 0 - 1 0 0 0 0 0 0 - 5 0 0 0 0 0
0
Molare Elliptizität [deg cm2 dmol-1]
W e l l e n l ä n g e [ n m ]
(b) 150 µM des prolinreichen TonB- Segments in D2O. Der Wildtyp zeigt das Charakteristikum einer PPII-Helix- Struktur bei 205 nm.
Abbildung 4.4: CD-Spektren bei Raumtemperatur.
4.3 ESR-Abstandsmessungen an TonB-Fragmenten
Um langreichweitige Informationen ¨uber die Konformation des prolinreichen Segments von TonB zu bekommen, wurden ESR-Abstandsmessungen durch- gef¨uhrt. In Abbildung 4.5 ist die gesamte Aminos¨aurensequenz des Proteins zu sehen [83]. Das f¨ur die ESR-Messungen verwendete 70 Residuen lange, pro- linreiche Fragment wurde in orange unterlegt. Durch ortsspezifische Cystein- Mutagenese (rot markierte Aminos¨auren in Abbildung 4.5) und Derivati- sierung mit dem Spinmarker MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetra-methylpyrroline-3- methyl-methanethiosulfonate)(siehe Kapitel 6.5.2) sind sechs doppelt spin- markierte TonB-Mutanten hergestellt worden: TonB 59/69, TonB 59/76, TonB 69/76, TonB 69/84, TonB 88/106, und TonB 106/120. Die beiden angegebenen Zahlen entsprechen den Positionen der Residuen im nativen TonB, die durch Cysteine ersetzt wurden.
Die Bindung des Spinmarkers kann ¨uber cw-(continuous wave)-ESR-Messungen bei Raumtemperatur ¨uberpr¨uft werden, siehe dazu Kapitel 2.1. In Abbildung 4.6 ist das cw-Spektrum freien MTSLs in deuteriertem Wasser und die spek- trale Simulation zu sehen.
Einer der Simulationsparameter ist die Rotationskorrelationszeit τcorr. Sie gibt Aufschluss dar¨uber, wie schnell der Spinmarker rotiert. Die rotatorische Diffusion ist einerseits von der Viskosit¨at des Mediums, andererseits vom
4.3 ESR AN TONB-FRAGMENTEN 47
Abbildung 4.5: TonB Aminos¨aurensequenz. In orange unterlegt ist das 70 Aminos¨auren lange, prolinreiche Segment, das f¨ur die ESR-Messungen her- angezogen wurde. Rot markierte Residuen stellen die Angriffspunkte der Mu- tagenese dar.
3 3 0 0 3 3 2 0 3 3 4 0 3 3 6 0 3 3 8 0 3 4 0 0 3 4 2 0
B [ G ]
Abbildung 4.6: Cw-ESR-Messung an MTSL in D2O, Messparameter siehe Kapitel 6.6.4. Kreise stehen f¨ur die experimentellen Daten, die rote Linie f¨ur die spektrale Simulation mittels EasySpin [12] (Parameter: gx=2,00906, gy=2,00687, gz=2,003, Ax=18 MHz, Ay=18 MHz, Az=100 MHz, intrinsische Linienbreite bestimmt bei voller Breite auf halber H¨ohe = 1,3 G, τcorr = 4,55·10−11 ns, isotrope Rotation).
48 4. NITROXID-NITROXID-ABSTANDSMESSUNGEN hydrodynamischen Radius des Molek¨uls abh¨angig. Ob der Spinmarker am Protein gebunden ist, kann aus dem Vergleich der Rotationskorrelationszei- ten von freiem MTSL mit der Proteinprobe erhalten werden. Ist der Marker gar nicht oder nur ein Anteil gebunden, erh¨alt man die gleiche Rotations- korrelationszeit wie f¨ur freies MTSL, bzw. l¨asst sich das Spektrum nur mit mindestens zwei Komponenten unterschiedlicher Korrelationszeiten anpas- sen. Alle Spektren der sechs TonB-Mutanten in deuteriertem Wasser (siehe Abbildung 4.7) lassen sich gut mit einem Parametersatz beschreiben. Die darausfolgenden Rotationskorrelationszeiten sind um etwa eine Gr¨oßenord- nung l¨anger als f¨ur freies MTSL, was auf eine Bindung des Markers an das Protein schließen l¨asst.
Uber cw-ESR-Messungen bei tiefen Temperaturen k¨¨ onnen Spinmarkerabst¨an- de zwischen 0,5 nm und 1,5 nm gemessen werden [15]. Zu diesem Zweck zieht man einzelmarkierte Proben heran, und vergleicht das Spektrum mit einer doppeltmarkierten Variante bei gleichen Messbedingungen. Ist eine spektrale Verbreiterung des Doppelmutanten erkennbar, l¨asst sich dies auf Abst¨ande unter 1,5 nm zur¨uckf¨uhren (f¨ur Details siehe [15]). Dies kann bei Aggre- gation oder Kollaps des Proteins geschehen. TonB wurde an Position 59 (TonB 59) mit MTSL einfach spinmarkiert. In Abbildung 4.8 ist exempla- risch der Vergleich mit der Doppelmutante TonB 59/69 zu finden. Die Pro- ben werden in fl¨ussigem Stickstoff schockgefroren und bei einer Temperatur von 120 K gemessen. Da sich alle Proben in einem L¨osungsmittelgemisch aus D2O/Glycerin-d8 50/50 Volumenprozent befinden, f¨uhrt die Schockge- frierung zu einer Glasmatrix und damit zu einem Einfangen der statistischen Orientierungen der Molek¨ule. Eine spektrale Verbreiterung wurde bei keiner Probe beobachtet. So k¨onnen Abst¨ande unter 1,5 nm ausgeschlossen werden.
Die einfach spinmarkierte Probe TonB 59 eignet sich ebenfalls, um den Hin- tergrund der intermolekularen Wechselwirkung f¨ur die DEER-Messungen der Doppelmutanten experimentell zu bestimmen. Die verwendete Pulssequenz f¨ur die Vierpuls-DEER-Messung (siehe Kapitel 2.2.1) ist folgendermaßen auf- gebaut:π/2(νobs)−τ1−π(νobs)−t0−π(νpump)−(τ1+τ2−t0)−π(νobs)−τ2−Echo.
In Abbildung 4.9 ist das Ergebnis der Vierpuls-DEER-Messung zu sehen. Die einzelmarkierten Proteine weisen eine dreidimensional homogene Spinvertei- lung auf, wie durch die Anpassung mit dem entsprechenden Modell nach Gleichung 2.5 gezeigt ist.
4.3 ESR AN TONB-FRAGMENTEN 49
3 3 0 0 3 3 2 0 3 3 4 0 3 3 6 0 3 3 8 0 3 4 0 0 3 4 2 0
B [ G ]
(a) TonB 59/69, Linienbreite = 1,4 G, τcorr = 8,55·10−10 s.
3 3 0 0 3 3 2 0 3 3 4 0 3 3 6 0 3 3 8 0 3 4 0 0 3 4 2 0
B [ G ]
(b) TonB 69/84, Linienbreite = 1,7 G, τcorr= 7,94·10−10 s.
3 3 0 0 3 3 2 0 3 3 4 0 3 3 6 0 3 3 8 0 3 4 0 0 3 4 2 0
B [ G ]
(c) TonB 88/106, Linienbreite = 1,1 G, τcorr = 8,89·10−10 s.
3 3 0 0 3 3 2 0 3 3 4 0 3 3 6 0 3 3 8 0 3 4 0 0 3 4 2 0
B [ G ]
(d) TonB 106/120, Linienbreite = 1,7 G, τcorr= 6,43·10−10 s.
3 3 0 0 3 3 2 0 3 3 4 0 3 3 6 0 3 3 8 0 3 4 0 0 3 4 2 0
B [ G ]
(e) TonB 59/76, Linienbreite = 1,2 G,τcorr
= 7,69·10−10s.
3 3 0 0 3 3 2 0 3 3 4 0 3 3 6 0 3 3 8 0 3 4 0 0 3 4 2 0
B [ G ]
(f) TonB 69/76, Linienbreite = 1,2 G,τcorr
= 9,89·10−10s.
Abbildung 4.7: Cw-ESR-Messungen an sechs doppelt spinmarkierten TonB- Mutanten in D2O, Messparameter siehe Kapitel 6.6.4. Kreise stehen f¨ur die experimentellen Daten, rote Linien f¨ur die Simulation (Parameter: gx
= 2,00906, gy = 2,00687, gz = 2,003, Ax = 18 MHz, Ay = 18 MHz, Az
= 100 MHz, intrinsische Linienbreite bestimmt bei voller Breite auf halber H¨ohe).
