Es hat sich im Kapitel 5.3.1 gezeigt, dass eine Vierpuls-DEER-Messung an homogenen L¨osungen mit optisch angeregtem Anthracen und MTSL gute Ergebnisse liefert. Im Folgenden wird diese Messmethode auf ein mit An-thracen und Nitroxid markiertes Modellmolek¨ul angewandt.
Um eine schmale Abstandsverteilung zu erzielen, sollte das Modellmolek¨ul m¨oglichst starr sein, einfach zu handhaben und strukturell bekannt sein. Die-se Eigenschaften findet man in Polyprolinhelices wieder (Details siehe Kapitel 3.3.1). Ein synthetisches Peptid, mit der Sequenz APPPPPPC, wurde von der Firma Centic Biotec synthetisiert. Die zu markierenden Aminos¨auren sind Alanin und Cystein (Details zur Peptidspinmarkierung siehe Kapitel 6.5.2).
Um die Abst¨ande zwischen den markierten Resdiuen abzusch¨atzen, muss zu-erst ein 3D-Strukturmodell des Peptids zu-erstellt werden (siehe Kapitel 6.2).
Mit diesen Koordinaten k¨onnen ¨uber das Programm MMM von Polyhach et al. [29] die Rotamere der Spinmarker berechnet werden und eine Abstands-verteilung vorhergesagt werden. Das Spinmarkieren des N-Terminus (Ala-nin) erfolgt ¨uber Anthracen- bzw. MTSL-Derivate, deren Rotamerbibliothe-ken nicht zur Verf¨ugung stehen. Alternativ wurden deshalb MTSL-Rotamere zur Absch¨atzung verwendet. Als Struktmodell wurde eine PolyprolinII-Helix (PPII) verwendet. In Abbildung 5.28 ist eine Darstellung zu sehen, die ein Kugel-Stab-Modell des markierten Peptids mit berechneten Spinmarkerpo-sitionen zeigt. Die vorhergesagte Abstandsverteilung zwischen den Spinmar-kern weist einen mittleren Abstand von 2,3 nm und eine Standardabweichung von 0,5 nm auf.
DEER-Messungen
Um zu zeigen, dass das Modellsystem sich ewartungsgem¨aß verh¨alt und die neu etablierte Spinmarkierung des N-Terminus funktioniert, wurde ein dop-pelt nitroxidmarkiertes Peptid hergestellt. Der N-Terminus wurde mit dem kommerziell erh¨altlichen 1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrroline-3-carboxylate N-Hydroxysuccinimide Ester (Toronto Research Chemicals), im Folgenden Tem-pyo Ester genannt (Struktur siehe Abbildung 5.29), und das Cystein mit MTSL markiert (Spinmarkierungsdetails siehe Kapitel 6.5.2). In Abbildung 5.30 sind zwei DEER-Messungen an dieser Probe in unterschiedlichen L¨ osungs-mitteln gezeigt.
90 5. OPTISCH ADRESSIERBARE SPINMARKER
Abbildung 5.28: Darstellung des Modellpeptids AP6C (in Pink) mit ange-brachten MTSL-Marker an Alanin und Cystein. Die Rotamere der Spinmar-ker wurden mit dem ProgrammMMM berechnet und sind als graue Wolken dargestellt. Die Wahrscheinlichkeit der Markerposition ist ¨uber die Gr¨oße der roten Kreise gegeben.
Abbildung 5.29: Strukturformel des Nitroxid-Spinmarkers f¨ur N-Terminale Markierung 1-Oxyl-2,2,-5,5-tetramethylpyrroline-3-carboxylate N-Hydroxysuccinimide Ester.
5.5 NITROXID-TRIPLETT-DEER AM MODELLSYSTEM 91
(a) DEER-Kurven nach Korrektur mit einem Hintergrund dreidimensional homogen verteilter Spins. Der jeweilige Fit entsteht durch eine Tikhonov-Abstandsanalyse. aus der Tikhonov-Anpassung mit einem Regularisierungsparamterαvon 1000.
Abbildung 5.30: DEER-Messungen und resultierende Abstandsverteilungen des doppelt nitroxidmarkierten Peptids AP6C in den L¨osungsmitteln Wasser (schwarze Linie) und Ethanol-d6 (rote Linie), jeweils 0,4 mM Konzentration, Messparameter siehe Kapitel 6.6.1.
Die bisherigen optischen Experimente wurden in einer Toluol-Matrix durch-gef¨uhrt, was sich als sehr gutes L¨osungsmittel f¨ur Experimente solcherart erwiesen hat. Im Fall der Peptidexperimente ist dies nicht mehr m¨oglich, da das Peptid in Toluol kollabiert und keine PPII-Konformation mehr ein-nimmt, wie sich durch DEER-Kontrollmessungen gezeigt hat (hier nicht ge-zeigt). Die DEER-Messungen wurden zum einen in Wasser durchgef¨uhrt: in diesem L¨osungsmittel ist bekannt, dass das Peptid eine PPII-Konformation einnimmt und zum anderen in deuteriertem Ethanol: um zu zeigen, dass die helikale Struktur beibehalten wird. Es handelt sich um Messungen an dersel-ben Probe. Nach der Peptidspinmarkierung wurde die Probe in Ethanol-d6 aufgenommen und nach einem lyophilisierenden Schritt in protoniertem, ge-reinigtem Wasser gel¨ost. Die Konzentration wurde aus dem Vergleich der Suszeptibilit¨at mit einer Referenzprobe ermittelt (0,5 mM Tempyo Ester in Wasser). Die unterschiedliche Modulationstiefe bei gleichem Parameterset l¨asst auf eine Instabilit¨at der Peptidspinmarkierung w¨ahrend der Lyophili-sierung schließen. Die Spinmarkierungseffizienz ist noch nicht optimiert, da man f¨ur einen Pumppuls von 12 ns L¨ange eine Modulationstiefe von 0,49 erwartet, w¨ahrend es hier bestenfalls nur die H¨alfte ist.
Die Messungen und berechneten Abstandsverteilungen zeigen, dass die Pep-tidstruktur in Ethanol erhalten bleibt. Der resultierende mittlere Abstand betr¨agt rund 2,6 nm und liegt damit 0,3 nm ¨uber der theoretischen
Vor-92 5. OPTISCH ADRESSIERBARE SPINMARKER hersage. Aufgrund des l¨angeren Linkers des Nitroxidderivats am N-Terminus war dies zu erwarten.
In den bisherigen Untersuchungen wurde reines Anthracen optisch angeregt.
Um das Anthracen an ein Molek¨ul zu binden, ist ein Linker notwendig. Na-heliegend war das Molek¨ul 9-Carboxyanthracene MTSEA Amide (siehe Ab-bildung 5.31), dessen Linker dem des Spinmarkers MTSL entspricht, an die Aminos¨aure Cystein gebunden werden kann und kommerziell bei Toronto Research Chemicals erh¨altlich ist. In Abbildung 5.34 ist die UV-Absorption dieses Molek¨uls in Ethanol (gr¨une Kurve) gezeigt. Der Vergleich mit reinem Anthracen (schwarze Kurve) zeigt eine bathochrome Verschiebung von etwa 10 nm. Die Beeinflussung der elektronischen Eigenschaften des Triplettsys-tems durch diesen Linker ließen keine ESR-Messungen unter Lichtanregung zu. In Abbildung 5.32 sind die Strukturen zweier Anthracenderivate zu se-hen, die als Testmolek¨ule fungierten. Beide Molek¨ule wurden bei der Firma MCAT in Auftrag gegeben. Die Untersuchungen an diesen Molek¨ulen sollte zeigen, ob eine Methylengruppe das aromatische System weniger beinflusst.
Das Derivat 5.32a) zeigte keine guten Ergebnisse, w¨ahrend hingegen die Me-thylengruppe an der Stelle 2 des Aromaten vielversprechende Messungen lieferte.
Abbildung 5.31: Strukturformel f¨ur den Marker 9-Carboxyanthracene MTSEA Amide.
5.5 NITROXID-TRIPLETT-DEER AM MODELLSYSTEM 93
(a) 2-(9-Anthracenyl-methoxy)-essigs¨aure.
(b) 2-(2-Anthracenylmethoxy)-essigs¨aure.
Abbildung 5.32: Strukturformeln zweier Anthracenderivate.
Abbildung 5.33: Strukturformel des Anthracen-Spinmarkers f¨ur N-Terminale Markierung Anthracen-NHS 2-(2-Anthracenylmethoxy)-essigs¨ aure-NHS-ester.
Nach dem Vorbild des Tempyo Ester-Markers (siehe Abbildung 5.29) f¨ur N-Terminale Spinmarkierung wurde ein Anthracenderivat bei MCAT in Auftrag gegeben (siehe Abbildung 5.33).
Der Marker 2-(2-Anthracenylmethoxy)-essigs¨aure-NHS-ester wird im Folgen-den als Anthracen-NHS bezeichnet. In Abbildung 5.34 ist eine vergleichende UV-Messung gezeigt. Die Absorbanz sowohl von Anthracen als auch Anthra-cen-NHS wurde bei einer Konzentration von 0,1 mM in Ethanol gemesssen.
Das intensit¨atsschw¨achere, verbreiterte und leicht bathochrom verschobene Absorptionsspektrum des Markers ist wahrscheinlich auf eine geringe Beein-flussung des π-Systems zur¨uckzuf¨uhren. Nichtsdestotrotz kann bei der La-serwellenl¨ange von 351 nm ¨uber eine gute Absorption des Markers verf¨ugt werden.
94 5. OPTISCH ADRESSIERBARE SPINMARKER
3 0 0 3 2 0 3 4 0 3 6 0 3 8 0 4 0 0
- 0 , 2 0 , 0 0 , 2 0 , 4 0 , 6 0 , 8
Extinktion W e l l e n l ä n g e [ n m ]
3 5 1 n m
Abbildung 5.34: UV-Absorptionsmessung bei Raumtemperatur. 0,1 mM An-thracen in Ethanol (schwarze Linie), 0,1 mM AnAn-thracen-NHS in Ethanol (rote Linie), 0,1 mM Carboxyanthracen in Ethanol (gr¨une Linie). Die Mes-sungen wurden mit einer reinen Ethanol-Probe hintergrundkorrigiert. In blau ist die Emissionslinie des Lasers ExciStarXS 500 markiert.
Die Peptidspinmarkierungsgprozedur kann dem Kapitel 6.5.2 entnommen werden.
Das Peptid mit anthracenmarkiertem N-Terminus und MTSL-markiertem Cystein kann nun analog zu den Messungen als Modellystem f¨ur Kapitel 5.3.1 behandelt werden. Die Beobachterpulssequenz der Vierpuls-DEER-Messung adressiert den ’2y’- ¨Ubergang des Anthracenspektrums, und der Pumppuls das Maximum des Nitroxidspektrums (siehe Abbildung 5.35). Deutlich er-kennbar ist die um etwa einen Faktor 10 geringere Triplettsignalintensit¨at im Vergleich zu reinem Anthracen. Zudem ist die Probe in Ethanol nach etwa 2 Stunden signifikant, und nach maximal 8 Stunden komplett
” aus-gebleicht“. Langzeitmessungen m¨ussen in einem zweidimensionalen Aufnah-memodus aufgesetzt werden, um den richtigen Zeitpunkt des Bleichens zu beobachten (siehe Kapitel 5.4).
5.5 NITROXID-TRIPLETT-DEER AM MODELLSYSTEM 95
Abbildung 5.35: EDFS des Anthracen-NHS/MTSL markierten Peptids in Ethanol-d6, Messparameter siehe Kapitel 6.6.3. In rot markiert sind die spek-tralen Positionen, an denen die Pump- bzw. Observerpulssequenz mit ∆ν = 652 MHz angelegt wird.
Abbildung 5.36 zeigt die Vierpuls-DEER-Messergebnisse f¨ur ein einfach An-thracen-NHS- und ein doppelt Anthracen-NHS/MTSL markiertes Peptid.
Das Signal-zu-Rausch-Verh¨altnis ist nicht sehr gut, da aufgrund des Ausblei-chens keine l¨angere Akkumulation als 8 Stunden m¨oglich ist. Die Triplett-echointensit¨at ist klein, da weit außerhalb der Resonatorfrequenz gemessen wird, weshalb eine l¨angere DEER-Kurve unter diesen Bedingungen nicht messbar ist, obwohl die T2-Zeit mit der reinen Anthracens vergleichbar ist.
Die Konzentration der Proben kann ¨uber Raumtemperatur-cw-Messungen bzw. UV-Absorptionsmessungen ermittelt werden. F¨ur den Einzelmutanten resultiert eine Anthracen-NHS-Konzentration von 5,5 mM, f¨ur den Doppel-mutanten von 5,2 mM. Die MTSL-Konzentration im DoppelDoppel-mutanten kann
¨uber die Suszeptibilit¨at einer Referenzprobe aus 0,5 mM MTSL in Ethanol-d6 berechnet werden. Es resultiert eine Konzentration von 1,3 mM. Wenn man davon ausgeht, dass der Standardspinmarkierungsprozess der Cysteinmodi-fikation zu 100% gebundenen MTSL-Molek¨ulen f¨uhrt, dann bedeutet dies einen etwa 4-fachen ¨Uberschuss an freiem Anthracen-NHS in der L¨osung.
Die Spinmarkierung des N-Terminus und die anschließende Aufreinigung des Peptids erweist sich als noch nicht komplett optimiert, wie schon die Modu-lationstiefe f¨ur die doppelt nitroxidmarkierten Peptide vermuten ließ.
96 5. OPTISCH ADRESSIERBARE SPINMARKER Die Messung des einfach spinmarkierten Peptids wurde als experimentel-ler Hintergrund f¨ur die Messung des doppelt spinmarkierten verwendet. Die resultierende Kurve der dipolaren Entwicklung wurde mit einer Tikhonov-Regularisierung ausgewertet und in eine Abstandsverteilung umgerechnet.
Der wahrscheinlichste Abstand zwischen den Spinmarkern betr¨agt 2,4 nm und liegt damit 0,1 nm ¨uber dem mittels Rotamer-Bibliotheken vorhergesag-ten Abstand.
(a) Normierte DEER-Kurven f¨ur ein einfach Anthracen-NHS-markiertes Peptid in Ethanol-d6 (rote Linie) und eines Anthracen-NHS/MTSL markier-ten Peptids in Ethanol-d6 (schwarze Linie).
(b) DEER-Kurve des doppelt markier-ten Peptids nach Hintergrundkorrek-tur. Als Hintergrundfunktion wurden die experimentellen Daten des ein-zel markierten Peptids (rote Kurve in a) verwendet, an die ein Polynom zweiten Grades angepasst wurde. Der eingezeichnte Fit resultiert aus einer Tikhonov-Berechnung mit
Abbildung 5.36: DEER-Messungen und Auswertung des spinmarkierten Po-lyprolinpeptids. Messparameter siehe Kapitel 6.6.1.
5.6 FAZIT 97
5.6 Fazit
In diesem Kapitel wird das Potential f¨ur eine v¨ollig neue Herangehensweise an die Spinmarker-ESR-Methode aufgezeigt: ein Singulett-Triplett-System als Spinmarker.
Das aromatische Molek¨ul Anthracen zeigt hervorragende Eigenschaften, wie eine hohe Triplettquantenausbeute, einen hohen Absorptionskoeffizienten im gew¨unschten Wellenl¨angenbereich und es kann als klein bezeichnet werden, sodass die St¨orung des Makromolek¨uls gering gehalten wird. Eine vollst¨ andi-ge Charakterisierung mittels UV- und ESR-Spektroskopie wurde durchandi-gef¨uhrt.
Die Besetzungssituation der Triplettniveaus nach einer Laserpulseinstrahlung konnte durch zeitaufgel¨oste Messungen bestimmt werden. Das mS = 0 Ni-veau wird nach dem Intersystemcrossing am st¨arksten populiert. Es zeigt sich außerdem eine recht lange Anthracen-Triplettlebenszeit von ca. 220 ms bei T = 50 K.
Ein ESR-Experiment zur Bestimmung von intramolekularen Abst¨anden, ba-sierend auf der Dipol-Dipol-Wechselwirkung zwischen Nitroxid und Triplett, konnte verwirklicht werden. Vierpuls-DEER-Messungen sind erfolgreich an einem homogenen Gemisch aus Anthracen und einem Nitroxid durchgef¨uhrt worden. Die optische Anregung erfolgte einerseits unter kontinuierlicher Licht-einstrahlung mittels einer Quecksilberhochdrucklampe und andererseits zeit-aufgel¨ost ¨uber einen Excimer Laser. Aus dem Vergleich zwischen Messungen mit und ohne Lichteinstrahlung konnte deutlich die Dipol-Dipol-Kopplung zwischen dem Triplettsystem und dem Nitroxid gezeigt werden.
Eine neu eingef¨uhrte Spinmarkierungsstrategie zum Markieren des N-Termi-nus eines Modellpeptids erm¨oglichte Messungen des optisch adressierten Spin-markers Anthracen-NHS an einem Modellsystem. Vierpuls-DEER-Messungen an einem doppelt Anthracen-NHS/Nitroxid markierten Polyprolinpeptids wa-ren erfolgreich und die sich ergebende Abstandsverteilung passt gut mit den Vorhersagen ¨uberein, die ¨uber Berechnungen der Rotamere gewonnen wur-den. Allerdings sind noch Optimierungen an der Spinmarkierungseffizienz und an der Aufreinigung des Peptids vorzunehmen.
Ein neuartiges Experiment zur Abstandsmessung unter Verwendung eines durch Laser addressierten Spinmarkers wird vorgeschlagen. Dieses LaserIMD-Experiment verwendet zum zeitlich kontrollierten Spinflip einen Laserpuls, der das komplette Triplettspektrum anregt und zur Wechselwirkung mit z. B.
einem Nitroxid beitragen l¨asst. Die erwarteten Verbesserungen im Signal-zu-Rausch-Verh¨altnis k¨onnten den maximal zug¨anglichen Abstand von 10 nm auf 16 nm im Vergleich zu herk¨ommlichen gepulsten ESR-Methoden erh¨ohen.
Aufgrund der langen Triplettlebenszeit von Anthracen und der starken Be-setzung von mS = 0 konnten keine abschließenden experimentellen
Ergebnis-98 5. OPTISCH ADRESSIERBARE SPINMARKER se erzielt werden. Die Anwendung auf ein geeigneteres Triplettsystem sollte schnell zielf¨uhrend sein.
You don‘t have to be a scientist to do experiments.
Jeffrey Lewis