der Philipps-Universität Marburg Institut für Virologie
Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. Hans-Dieter Klenk
Untersuchungen zur Rolle des VP24 im
Vermehrungszyklus des Marburgvirus
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Humanbiologie (Dr. rer. physiol.)
dem Fachbereich Humanmedizin der Philipps-Universität Marburg
vorgelegt von
Sandra Bamberg aus Koblenz
am Institut für Virologie des Medizinischen Zentrums für Hygiene und Infektionsbiologie unter der Leitung von Prof. Dr. Hans-Dieter Klenk durchgeführt.
Angenommen vom Fachbereich Humanmedizin der Philipps-Universität Marburg am
Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs.
Dekan: Herr Prof. Dr. Bernhard Maisch Referent: Herr Prof. Dr. Hans-Dieter Klenk Koreferent: Herr Prof. Dr. Jacob
Inhaltsverzeichnis 1
1 Einleitung
7
1.1 Taxonomie und Epidemiologie der Filoviren 7
1.2 Klinik und Pathogenese der MARV-Infektion 10
1.3 Morphologie des Marburgvirus 12
1.4 Genomstruktur des Marburgvirus 13
1.5 Die viralen Proteine 13
1.6 Der Replikationszyklus des Marburgvirus 17
1.7 Die Funktion der Matrixproteine bei Mononegavirales und Retroviren 18
1.8 RNA Interferenz (RNAi) 19
1.9 Fragestellung 21
2 Material
22
2.1 Chemikalien 22 2.2 Verbrauchsmaterialien 24 2.3 Kits 25 2.4 Geräte 252.5 Puffer und Lösungen 27
2.5.1 Puffer 27
2.5.2 Lösungen 31
2.6 Wachstumsmedien 32
2.6.1 Wachstumsmedien für Bakterien 32
2.6.2 Wachstumsmedien für Säugerzellen 32
2.7 Nukleinsäuren und Nukleotide 33
2.7.1 Nukleinsäuren als Größenmarker 33
2.7.2 Sonstige Nukleinsäuren und Nukleotide 33
2.7.3 siRNA-Sequenzen 33
2.7.4 DNA-Oligonukleotide (Primer) 34
2.8.1 Vektoren 35
2.8.2 Rekombinante Plasmide 35
2.9 Proteine 36
2.9.1 Enzyme 36
2.9.2 Antikörper 37
2.9.3 Proteine, Peptide und Aminosäuren 38
2.10 Radioaktiv markierte Substanzen 38
2.11 Zellen und Viren 38
2.11.1 Prokaryotische Zellen 38
2.11.2 Eukaryotische Zellen 38
2.11.3 Viren 38
3 Methoden
39
3.1 Molekularbiologische Methoden 39
3.1.1 Isolierung und Reinigung von DNA 39
3.1.1.1 Reinigung von DNA-Fragmenten >100 bp 39
3.1.1.2 Isolierung von DNA aus Agarosegelen 39
3.1.1.3 Ethanolfällung 39
3.1.2 Analyse von DNA 40
3.1.2.1 Elektrophoretische Auftrennung 40
3.1.2.1.1 Präparative DNA-Agarosegele 40
3.1.2.1.2 Analytische DNA-Agarosegele 40
3.1.2.2 Quantifizierung von DNA 40
3.1.2.3 Sequenzanalyse mit dem ABI PrismTM 377 DNA Sequencer 41
3.1.3 Klonierung und Mutagenese von DNA 42
3.1.3.1 Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen 42
3.1.3.2 Dephosphorylierung linearisierter DNA 43
3.1.3.3 Amplifikation spezifischer DNA-Sequenzen mittels Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
3.1.3.4 Ligation von DNA-Fragmenten in linearisierte Vektoren 45 3.1.3.5 Ortsgerichtete Mutagenese von Plasmid-DNA 46 3.1.3.6 Transformation von Bakterien mit Plasmid-DNA 47
3.1.4 Vervielfältigung von DNA 47
3.1.4.1 Plasmidpräparation im kleinen Maßstab (Miniprep) 47 3.1.4.2 Plasmidpräparation im großen Maßstab (Maxiprep) 47
3.1.5 Reinigung und Analyse von RNA 48
3.1.5.1 Reinigung von viraler RNA aus Zellkulturüberstand 48
3.1.5.2 Quantifizierung von RNA und siRNAs 48
3.1.6 Real-time RT-PCR Analyse mittels SYBR Green dye I 48
3.2 Zellbiologische Methoden 49
3.2.1 Kultivierung von HeLa-, HEK293- und Vero-Zellen 49 3.2.2 Transfektion von HEK293-Zellen mit Lipofectamine PlusTM 50
3.2.3 Zellernte für Flotationsanalysen und Triton X-114 Phasen Partitionierung
51
3.2.4 Ernte und Aufreinigung von Zellkulturüberstand zur Analyse freigesetzter Proteine in Form von virusähnlichen Partikeln (VLPs)
51
3.2.5 Transfektion von Vero-Zellen mit LipofectamineTM 2000 52
3.2.6 Transfektion von siRNAs in MARV-infizierte Vero-Zellen 52 3.2.7 Ernte von Vero-Zellen sowie Zellkulturüberständen nach
siRNA-Behandlung
53
3.2.8 Das Vaccinia-Virus-Expressionssystem 54
3.2.8.1 Infektion und Transfektion von HeLa-Zellen 54 3.2.8.2 Fixierung von Zellen durch Paraformaldehyd und Permeabilisierung
mittels Triton X-100
54
3.3 Biochemische und immunologische Methoden 55
3.3.1 Elektrophoretische Auftrennung von Proteinen und deren Visualisierung
55
3.3.1.2 Coomassie-Färbung 56
3.3.1.3 Autoradiographie 56
3.3.1.4 Elektrotransfer von Proteinen (Western Blot) 56 3.3.1.5 Entfernung von gebundenen Antikörpern von bereits analysierten
PVDF-Membranen
58
3.3.2 Indirekte Immunfluoreszenzanalyse 58
3.3.3 In vitro Translation 59
3.3.4 Immunpräzipitation 60
3.3.5 Behandlung von VLPs mit Proteinase K 61
3.3.6 Untersuchungen zur Membranassoziation von Proteinen 62 3.3.6.1 Flotationsanalyse im nichtlinearen Saccharose-Gradienten 62
3.3.6.2 Charakterisierung der Membranassoziation 62
3.3.6.3 Triton X-114 Phasenpartitionierung 63
3.3.7 Bakterielle Expression und Reinigung von GST-Fusionsproteinen 64 3.3.7.1 Klonierung und bakterielle Expression von GST-VP24 64 3.3.7.2 Kopplung des GST-VP24 an Glutathion-Sepharose 65 3.3.8 Immunisierung von Kaninchen und Meerschweinchen 65
3.3.8.1 Präparation des GST-VP24-Fusionsproteins 65
3.3.8.2 Immunisierung 66
3.3.8.3 Aufbereitung der Seren und Antikörpernachweis 66
3.3.9 Affinitätsreinigung des VP24-Antikörpers 67
4 Ergebnisse
68
4.1 Immunfluoreszenzanalysen zur intrazellulären Lokalisation von VP24
68
4.1.1 Klonierung Epitop-markierter VP24-Mutanten 68
4.1.2 Immunfluoreszenzanalysen der Epitop-markierten VP24-Mutanten 70 4.1.3 Herstellung und Aufreinigung von VP24-spezifischen Antikörpern 71
4.2 Untersuchungen zur Membranassoziation von VP24 73 4.2.1 Interaktion von VP24 mit zellulären Membranen 73
4.2.2 Charakterisierung der Membraninteraktion 75
4.2.3 Membranassoziation von VP24 in Anwesenheit von VP40 oder GP 76 4.2.3 Untersuchungen zur Membranintegration des VP24 77
4.3 Bildung von virusähnlichen Partikeln (VLPs) 79
4.3.1 Bildung von VLPs durch Einzelexpression von VP40, GP und VP24 80 4.3.2 Koexpression von VP24, VP40 und GP in äquivalenten Mengen zur
Virusinfektion
82
4.3.2.1 Einfluss des VP24 auf die Expression von VP40 und GP 82 4.3.2.2 Expression von VP24, VP40 und GP in äquivalenten Mengen zur
MARV-Infektion
83
4.3.3 Rekrutierung von VP24 in von VP40 bzw. GP gebildete VLPs 84 4.3.4 Einfluss des VP24 auf die Bildung von virusähnlichen Partikeln 85 4.3.5 Einfluss des Late-Domain-Motivs PPPY des MARV-VP40 auf den
Einbau von VP24
87
4.3.6 Einbau von NP in die VLPs 89
4.4 Interaktion des VP24 mit viralen Proteinen 90
4.4.1 Lokalisation des VP24 in MARV-infizierten Vero-Zellen 90 4.4.2 Interaktion von VP24 und NP in der Immunfluoreszenzanalyse 92
4.4.3 Interaktion von VP24 und VP40 94
4.4.3.1 Koimmunpräzipitation von VP24 und VP40 94
4.4.3.2 Kolokalisation von VP24 und VP40 in der Immunfluoreszenzanalyse 95 4.5 Abschalten der MARV VP24-Expression durch RNAi 97 4.5.1 Auswahl geeigneter siRNA-Sequenzen aus der Ziel-mRNA-Sequenz 97 4.5.2 Abschalten der transienten VP24-Expression durch siRNAs 98 4.5.3 Abschalten der VP24-Expression in der Virusinfektion durch RNAi 100 4.5.4 Freisetzung reifer Viruspartikel von siRNA-behandelten Zellen 103
5 Diskussion
105
6 Zusammenfassung
113
7 Literaturverzeichnis
114
8
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
127
9 Abkürzungsverzeichnis
129
10
Veröffentlichungen, Vorträge und Posterpräsentationen
131
11 Curriculum
Vitae
133
12
Verzeichnis der akademischen Lehrer
134
13 Danksagung
135
1 Einleitung
1.1 Taxonomie und Epidemiologie der Filoviren
Das Marburgvirus (MARV) und das Ebolavirus (EBOV) bilden aufgrund ihrer fadenförmigen Gestalt (lat.: filum = der Faden) sowie serologischer, biochemischer und molekularbiologischer Eigenschaften die Familie der Filoviridae (Kiley et al., 1982). Hierbei handelt es sich um hochpathogene Erreger, die sowohl bei menschlichen als auch nichtmenschlichen Primaten schwere, oft tödliche Erkrankungen mit hämorrhagischer Diathese verursachen.
Aufgrund ihres nichtsegmentierten, negativsträngigen RNA-Genoms (NNS-RNA) bilden die Filoviren gemeinsam mit den Virusfamilien der Rhabodoviridae, Paramyxoviridae und Bornaviridae die Ordnung der Mononegavirales (Abbildung 1). Sequenzvergleiche der Genome der Mononegavirales zeigten, dass die Filoviridae den Paramyxoviridae evolutiv am nächsten stehen (Mühlberger et al., 1992; Sanchez et al., 1992).
Erstmals wurde 1967 eine von Filoviren ausgelöste Epidemie beschrieben (Siegert, 1967), die zeitgleich in Marburg, Frankfurt a.M. und Belgrad auftrat. Bei den infizierten Personen handelte es sich hauptsächlich um Laborarbeiter und Tierpfleger, die Kontakt zu Blut oder Organen von grünen Meerkatzen (Cercopithecus aethiops) hatten, welche zuvor aus Uganda importiert worden waren. Das neu entdeckte Marburgvirus erhielt den Namen der Stadt, in der es identifiziert wurde.
Abbildung 1: Taxonomie der Filoviren.
In Anlehnung an van Regenmortel et al. (2000), ICTVdB Management (2003)
Mononegavirales
Paramyxoviridae Filoviridae Bornaviridae
Rhabdoviridae Ordnung Familie Genus Spezies Marburgvirus (MARV) Ebolavirus (EBOV) Marburgvirus Ivory Coast Ebolavirus (CIEBOV) Reston Ebolavirus (REBOV) Sudan Ebolavirus (SEBOV) Zaire Ebolavirus (ZEBOV)
Das Ebolavirus trat erstmals im Jahre 1976 während zweier annähernd zeitgleich verlaufender, aber voneinander unabhängiger Epidemien in Zaire und Sudan in Erscheinung. Mehrere hundert Menschen erkrankten an einem schweren hämorr-hagischen Fieber. Das Virus wurde nach einem Fluss, der sich in der Nähe der Epi-demiegebiete befindet, benannt (Johnson et al., 1977; Murphy et al., 1978). Morpho-logisch war das neuentdeckte EBOV dem MARV sehr ähnlich, ließ sich jedoch sero-logisch unterscheiden. (Bowen et al., 1977; Pattyn et al., 1977). Nach 1967 bzw. 1976 kam es gelegentlich zu kleineren Ausbrüchen durch MARV und EBOV (Tabelle 1).
Virus Genus Jahr Ort
humane Krankheitsfälle (Todesfälle) Isolat Marburg 1967 Deutschland / Jugoslawien 32 (7) Rataycak / Popp 1975 Zimbabwe 3 (1) Ozolin 1980 Kenia 2 (1) Musoke 1987 Kenia 1 (1) Ravn
seit 1998 Republik Kongo >90 (>50) ?
Ebola Sudan 1976 Sudan 284 (141) Boniface
Zaire 1976 Zaire 318 (280) Mayinga
Zaire 1977 Zaire 1 (1) Bonduni
Sudan 1979 Sudan 34 (22) Maleo
Reston 1989 USA 4 (0) Philippines
Reston 1992 Philippinen 0 Philippines
Reston 1992 Italien 0 Siena
Zaire 1994 Gabun 49 (29) Gabon
Ivory Coast 1994 Elfenbeinküste 1 (0) Cote d’Ivoire
Zaire 1995 Zaire 315 (243) Kikwit
Zaire 1996 Gabun 31 (21) Gabon
Zaire 1996 Gabun 60 (45) Gabon
Reston 1996 USA 0 Pennsylvania
Sudan 2000-1 Uganda 425 (224) ?
Zaire 2001-2 Gabun/Kongo 122 (110) ?
Zaire 2003 Republik Kongo 143 (128) ?
Zaire 2003-4 Republik Kongo 35 (29) ?
Sudan 2004 Süd-Sudan 25 (6) ?
Tabelle 1: Ausbrüche von Filovirus-Infektionen.
In Anlehnung an Feldmann et al., 1996b; WHO 1978a, 1978b, 1992, 1996, 1997, 1999, 2000, 2001, 2002, 2003a, 2003b, 2004a, 2004b; CDC, 1996. DRC = Demokratische Republik Kongo.
1995 erfolgte ein weiterer größerer Ausbruch von hämorrhagischem Fieber in Kikwit (Zaire), ausgelöst vom Subtyp Zaire des Ebolavirus, bei dem von 315 infizierten Menschen 244 starben (CDC, 1995).
Ein neuer EBOV-Subtyp wurde 1989 in Reston (Virginia/USA) aus Cynomogolus-Affen (Macaca fascicularis) isoliert, die von den Philippinen in die USA importiert worden waren (Jahrling et al., 1990). Dieses als Reston Ebolavirus (REBOV) bezeichnete Virus scheint nicht oder nur schwach humanpathogen zu sein. Es konnten bisher nur symptomlose Infektionen beim Menschen nachgewiesen werden. Für Affen ist REBOV jedoch hochpathogen.
Seit Ende 1998 traten gehäuft Fälle von MARV-Infektionen im östlichen Teil der Demokratischen Republik Kongo (ehemaliges Zaire) um die Stadt Durba auf (Bertherat et al., 1999; WHO, 1999). Die hier dokumentierten Fälle scheinen auf den Aufenthalt der infizierten Personen in einer nahegelegenen Goldmine zurückzugehen. Im Gegensatz zu den bisher beobachteten, sporadisch in verschiedenen Regionen aufgetretenen MARV-Infektionen sind sie in Durba seit 1998 regelmäßig dokumentiert. Der natürliche Wirt der Filoviren ist trotz intensiver Untersuchungen bis heute unbekannt. Zwar spielen Affen bei der Verbreitung der Viren oft eine entscheidende Rolle, doch können sie als das Reservoir der Viren nahezu ausgeschlossen werden, da experimentell infizierte Affen ausnahmslos an der Infektion versterben (Fisher-Hoch et al., 1992; Fisher-Hoch and McCormick, 1999; Ryabchikova et al., 1999; Simpson, 1977). Sie stellen wahrscheinlich nur einen Zwischenwirt in der Infektionskette von Filovirusinfektionen dar. Als ein möglicher Wirt werden u.a. Fledermäuse betrachtet, da diese nach einer Infektion das Virus mit dem Kot ausscheiden, jedoch keine Anzeichen einer Erkrankung aufweisen (Swanepoel et al., 1996). Auch Arthropoden können nicht ausgeschlossen werden, da gezeigt werden konnte, dass MARV in Mosquitos der Spezies Aedes aegypti mehrere Wochen persistieren kann (Monath et al., 1999; Kunz et al., 1968), jedoch scheint dieser Übertragungsweg aufgrund des seltenen Auftretens von filoviralem hämorrhagischen Fieber als eher unwahrscheinlich.
Umfangreiche serologische Studien haben ergeben, dass Filoviren in Teilen Zentralafrikas, dem sogenannten Ebola-Gürtel, häufiger vertreten sind als die seltenen bekannt gewordenen Ausbrüche vermuten lassen. Bei bis zu 10 % der untersuchten Personen konnten Antikörper gegen eines der bekannten Filoviren nachgewiesen werden (Slenczka et al., 1984; Hughes et al., 1986). Dieses Ergebnis legt nahe, dass Filovirusinfektionen unter Umständen klinisch inapparent verlaufen können und somit unerkannt bleiben. Untersuchungen im Rahmen des EBOV-Ausbruchs in Gabun 1996 bestätigten, dass es asymptomatische Verläufe der EBOV-Erkrankung geben kann (Baize et al., 1999; Leroy et al., 2000).
Serologische Studien auf anderen Kontinenten ergaben, dass auch hier eine gewisser Prozentsatz der untersuchten Seren von Menschen, die keine Anamnese für hämorrhagische Fieber hatten, Filovirus-spezifische Antikörper besaßen (Becker et al., 1992). Mögliche Erklärungen für diese Ergebnisse wären, dass es sich hierbei um unspezifische Kreuzreaktionen der Antikörper handelt, oder dass Filoviren mit niedrigem pathogenen Potential in weiten Teilen der Welt kursieren.
Die Übertragung der Filoviren von Mensch zu Mensch erfolgt über kontaminierte Körperflüssigkeiten wie Blut, Speichel und Sperma. Als Eintrittspforten in den Körper dienen kleine Haut- und Schleimhautläsionen (Simpson et al., 1977). Daher gehören zu den am meisten gefährdeten Personen während einer Epidemie v.a. das Pflegepersonal und die nächsten Angehörigen der Erkrankten. Um eine Eindämmung von Epidemien zu erreichen, ist der besondere Schutz dieser Personen beim Umgang mit Erkrankten absolut erforderlich. Umstritten ist, inwieweit Filoviren über Aerosole übertragen werden können. Eine aerogene Übertragung konnte bei MARV bisher nur im Tierexperiment nachgewiesen werden, gilt aber unter natürlichen Bedingungen als unwahrscheinlich (Pokhodiaev et al., 1991). Auch im Falle des EBOV ist eine aerogene Übertragung prinzipiell möglich. Sie konnte z. B. während des EBOV Reston Ausbruchs bei Affen nicht völlig ausgeschlossen werden, wurde beim Menschen jedoch nicht nachgewiesen (Johnson et al., 1995; Jaax et al., 1995).
1.2 Klinik und Pathogenese der MARV-Infektion
MARV verursacht beim Menschen und bei nichtmenschlichen Primaten ein schweres hämorrhagisches Fieber. Nach einer Inkubationszeit von fünf bis neun Tagen beginnt die Krankheit plötzlich mit schwerem Krankheitsgefühl, hohem Fieber, Kopf- und Gliederschmerzen sowie Erbrechen und wässriger, nichtblutiger Diarrhoe (Martini et al., 1968b). Teilweise kommt es schon im Anfangsstadium zu neurologischen Begleit-symptomen, wie Verwirrtheitszuständen und Bewusstseinstrübungen bis hin zur Bewusstlosigkeit. In der ersten Krankheitswoche entwickelt sich ein charakteristisches makulopapulöses Exanthem, das nach Abklingen in eine Hautschuppung übergeht. Daneben werden Konjunktividen und Lymphknotenschwellungen beschrieben. Im Verlauf der Krankheit tritt ein obligatorischer Thrombozytenabfall ein, welcher mit der hämorrhagischen Diathese (Blutungen der Nasenschleimhaut, des Gaumens und des gesamten Gastrointestinaltrakts) korreliert. Der Verlauf der Erkrankung wird vom Ausmaß der Hämorrhagien bestimmt. Bei letal endenden Fällen tritt der Tod zwischen dem achten und zehnten Krankheitstag aufgrund von hämorrhagischem Schock, Verbrauchskoagulopathie und Multiorganversagen ein. Die Letalitätsrate betrug während des Ausbruches 1967 in Marburg ca. 25 %, in Durba ca. 50%. Hierbei muss
berücksichtigt werden, dass die Letalitätsrate entscheidend von der medizinischen Betreuung der erkrankten Personen und deren allgemeinen Gesundheitszustand abhängt und daher in Entwicklungsländern, wo eine intensivmedizinische Betreuung nicht möglich ist, höher liegt. Bei Überlebenden dauert die Krankheit 12 bis 22 Tage an (Martini et al., 1968b; Stille and Böhme, 1971). Die Rekonvaleszenz dauert fünf Wochen und länger und ist gekennzeichnet durch Erschöpfung, Gewichtsverlust und Amnesie in Bezug auf die akute Krankheitsphase. MARV kann bis drei Monate nach der Infektion in der Samenflüssigkeit nachgewiesen werden (Martini et al., 1968a). Es wird angenommen, dass die Viren nach der Infektion zunächst in die lokalen Lymphknoten transportiert werden und dass die primären Ziele der Virusinfektion Zellen des monozytären phagozytischen Systems (MPS) sind (Feldmann et al., 1996a; Ströher et al., 2001). Die Virusausbreitung durch infizierte Monozyten erfolgt über das lymphatische System und das Blutgefäßsystem. Im Frühstadium sind vor allem die Lymphknoten, Milz und Leber betroffen (Feldmann et al., 1996b; Peters et al., 1996). Im Spätstadium der Infektion findet man histopathologisch in fast allen Organen Nekrosen, besonders ausgeprägt treten sie in Leber, Niere und Lunge auf (Rippey et al., 1984; Zaki and Peters, 1997). Eine erhöhte Durchlässigkeit der Endothelien scheint für die Schock-Symptomatik und das Auftreten von Hämorrhagien im terminalen Stadium der Infektion verantwortlich zu sein. Dabei ist interessant, dass infizierte Makrophagen mit einer erhöhten Ausschüttung von Zytokinen reagieren (Ströher et al., 2001), darunter der Tumor Nekrose Faktor α (TNFα), der als Auslöser der Schock-Symptomatik gilt. Die Ausschüttung von TNFα erhöht vermutlich die Permeabilität der Endothelien, ohne das eine direkte Infektion der Endothelzellen vorliegen muss (Schnittler et al., 1993; Strieter et al., 1993; Feldmann et al., 1996a). Ablagerungen von Fibrin und Fibrinspaltprodukten in den Nierentubuli weisen auf eine generelle Störung der Blutgerinnung hin (Martini et al., 1971).
Eine kausale Therapie gegen MARV existiert bisher nicht. Die Behandlung beschränkt sich, sofern möglich, auf eine intensivmedizinische symptomatische Therapie des hämorrhagischen Schocks und der Verbrauchskoagulopathie. Der Einsatz von Rekonvaleszentenserum scheint jedoch einen positiven Einfluss auf den Krankheitsverlauf zu haben (Mupapa et al., 1999). Bei EBOV-Infektionen zeigen Inhibitoren der S-Adenosylhomocystein-Hydrolase im Tierversuch einen guten therapeutischen Effekt (Bray et al., 2000; Bray et al., 2002; Huggins et al., 1999). Ferner zeigte die Behandlung von EBOV-infizierten Makaken mit einem rekombinanten Inhibitor des Gewebefaktors VIIa (rNAPc2) einen positiven Effekt auf den Krankheitsverlauf der Tiere. Die Anzahl überlebender Tiere stieg von 0 auf 33 % (Geisbert et al., 2003).
Die Prävention beschränkt sich vor allem auf Hygienemaßnahmen und Absonderung infizierter Personen zur Unterbrechung der Infektionskette. Eine Impfung ist zur Zeit nicht verfügbar und auch schwierig einsetzbar, da man aufgrund fehlender Informationen über den eigentlichen Wirtsorganismus die gefährdete und damit zu impfende Population nicht eingrenzen kann. Allerdings gibt es für das EBOV im Tiermodell erste Erfolge mit DNA-Vaccinen bzw. rekombinanten Adenoviren (Baize et al. 2001; Sullivan et al., 2000).
1.3 Morphologie des Marburgvirus
Marburgvirus-Partikel zeigen ein pleomorphes Erscheinungsbild. Sie sind fadenförmig, manchmal verzweigt, zirkularisiert oder in Form eines U oder einer 6 gebogen (Feldmann et al., 1993; 1999). Der Durchmesser der Partikel beträgt 80 nm, ihre Länge ist variabel und liegt durchschnittlich bei 1µm, kann aber bis zu 14 µm betragen. In die das Virion umgebende Hüllmembran sind Spikes von ungefähr 7 nm Länge eingelagert. Abbildung 2 zeigt den schematischen Aufbau (A) sowie die elektronenmikroskopische Aufnahme (B) eines MARV-Partikels.
MARV besteht aus sieben Strukturproteinen. Im Zentrum der Viruspartikel liegt das Nukleokapsid, oder auch Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex, welches aus dem viralen RNA-Genom (vRNA) und den Proteinen NP, VP35, VP30 und L besteht. Im
Oberflächenprotein GP Ribonukleoproteinkomplex (vRNA, NP, VP35, VP30 und L) Matrix VP40 und VP24 1 µm 80 nm
A
B
Abbildung 2: Struktur des Marburgvirus.
A: Schematische Darstellung eines MARV-Partikels. B: Elektronenmikroskopische
Aufnahme des MARV, Negativkontrastierung mit Phosphorwolframsäure. Vergrößerung: 50000fach. Zur Verfügung gestellt von Dr. Larissa Kolesnikova
Matrixraum zwischen dem RNP-Komplex und der Hüllmembran liegen die Proteine VP40 und VP24 (Becker et al., 1998; Kiley et al., 1988). In die Hüllmembran, die von Membranen der Wirtszelle abstammt, ist das einzige Oberflächenprotein GP in Form von Homotrimeren eingelagert (Feldmann et al., 1991).
1.4 Genomstruktur des Marburgvirus
Das MBGV besitzt ein einzelsträngiges, nichtsegmentiertes RNA-Genom negativer Polarität, dessen Länge 19,1 kb beträgt. Die genomische RNA per se ist nicht infektiös. Sie enthält sieben offene Leserahmen, die für die viralen Strukturproteine kodieren (Abbildung 3).
Am 3’- und 5’-Ende der RNA befinden sich nichttranskribierte Bereiche, der 3’-Leader und der 5’-Trailer, deren Enden komplementär zueinander sind und möglicherweise stabile Sekundärstrukturen bilden können (Peters, 1996). Leader und Trailer enthalten Signale zur Initiation der Replikation und der Enkapsidierung des Genoms durch das NP (Mühlberger et al., 1996; 1998). Die offenen Leserahmen der einzelnen Gene sind von nichttranslatierten Sequenzen flankiert, die hochkonservierte Signale für Transkriptionsstart und -stop enthalten (Mühlberger et al., 1996). Zwischen den einzelnen Genen befinden sich intergenische Sequenzen, die nicht transkribiert werden. Zwischen VP30 und VP24 überlappen die intergenischen Sequenzen (Feldmann et al., 1992).
1.5 Die viralen Proteine
NP Das Nukleoprotein ist das Produkt des ersten Gens und umfasst 695
Aminosäuren bei einem Molekulargewicht von 94 kD. Es enkapsidiert die virale RNA und spielt eine zentrale Rolle bei Replikation und Transkription (Becker et al., 1998; Mühlberger et al., 1998; Kolesnikova et al., 2000; Mavrakis et al., 2003).
Abbildung 3: Genomstruktur des Marburgvirus.
Ausgehend vom 3’ Leader werden auf der genomischen RNA die Proteine NP, VP35, VP40, GP, VP30, VP24 und L kodiert, gefolgt von dem 5’ Trailer. Zwischen den einzelnen Gene befinden sich nichttranskribierte intergenische Sequenzen, die zwischen VP30 und VP24 überlappen. Trailer Leader L NP VP35 VP40' GP VP24 3’ VP30 5’
Anhand von Hydrophobizitätsplots läßt sich NP in eine hydrophile Carboxy (C)-terminale und eine hydrophobe Amino (N)-(C)-terminale Domäne einteilen. Der N-Terminus zeigt Sequenzhomologien zu den Nukleoproteinen anderer NNS-RNA-Viren (Sanchez et al., 1992), während der saure C-Terminus hochvariabel ist. Das NP zeigt eine starke Phosphorylierung und liegt in virusinfizierten Zellen als phosphoryliertes (94 kD) und nicht-phosphoryliertes NP (92 kD) vor. Jedoch wird nur die phosphorylierte Form des NP in Virionen eingebaut (Becker et al., 1994), was eine entscheidende Rolle dieser posttranslationalen Modifikation im MARV-Vermehrungszyklus vermuten lässt. Die Phosphorylierung findet in der C-terminalen Domäne an Serin- und Threoninresten statt und umfasst sieben Regionen (I-VII) (Lötfering et al., 1999).
VP35 Das VP35 interagiert mit NP und L, wirkt als Kofaktor der RNA-abhängigen
RNA-Polymerase L und wird, trotz seiner vergleichsweise schwachen Phos-phorylierung, als Analogon der P-Proteine der Rhabdo- und Paramyxoviridae angesehen (Becker et al., 1998; Mühlberger et al., 1998; 1999). VP35 (35 kD) wird, wie das P-Protein der Rhabdo- und Paramyxoviridae, vom zweiten Gen des Genoms kodiert und spielt eine essentielle Rolle bei der viralen Transkription und Replikation (Mühlberger et al., 1998). Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass VP35 des EBOV ein Typ I Interferonantagonist ist und so die unspezifischen zellulären Abwehr-mechanismen gegen eine Virusinfektion schwächt (Basler et al., 2000, 2003a).
VP40 VP40, das im Virion neben dem NP mengenmäßig am stärksten vertretene
Protein der Filoviren (Elliot et al., 1985) besteht aus 303 AS. Es läuft in der SDS-PAGE als Doppelbande bei 37 und 39 kD, wobei es sich bei der größeren Form wahrscheinlich um eine posttranslationale Modifizierung handelt, die jedoch bisher nicht näher beschrieben ist. Bei VP40 handelt es sich um ein Analogon der M-Proteine anderer Mononegavirales. Salz-Dissoziationsuntersuchungen zeigten, dass VP40 zwischen Nukleokapsid und Virushülle lokalisiert ist (Becker er al., 1998; Elliott et al., 1985). Untersuchungen zur Membranassoziation des VP40 ergaben, dass es stark mit Membranen interagiert und sich als peripheres Membranprotein verhält (Ruigrok et al., 2000; Kolesnikova et al., 2002). VP40 assoziiert sehr schnell zu 80 % mit Membranen und nur ein kleiner Teil assoziiert mit den Nukleokapsiden (Kolesnikova et al., 2002; Geisbert et al., 1995). Durch Röntgen-Kristallographie konnte die Struktur des EBOV-VP40 aufgeklärt werden. Dabei zeigte sich, dass der C-Terminus des EBOV-VP40, der für eine Membranbindung notwendig ist, hydrophobe Bereiche enthält, die wahrscheinlich für die Interaktion mit der Lipidmembran verantwortlich sind (Dessen et al., 2000a; 2000b). MARV-VP40 ist in diesem Bereich stark homolog. Für das VP40 des MARV ist
gezeigt, dass es mit multivesikulären Membranstrukturen des späten endosomalen Kompartiments, sog. „multivesicular bodies“ (MVB), interagiert (Kolesnikova et al., 2002; 2004a). Außerdem ist es in der Lage, bei solitärer Expression, seine Freisetzung als virusähnliche Partikel („virus-like partikles“, VLPs) zu vermitteln (Timmins et al., 2001; Swenson et al., 2004; Kolesnikova et al., 2004b), wobei für EBOV gezeigt wurde, dass ein prolinreiches Motiv PTAPPEY am N-Terminus des Proteins, eine sog. Late-Domain, für diesen Vorgang essentiell ist (Licata et al., 2003; Martin-Serrano et al., 2004). MARV-VP40 besitzt im N-Terminus ebenfalls das Motiv einer Late-Domain (PPPY), deren Funktion jedoch bisher nicht näher untersucht ist.
GP GP ist als einziges Oberflächenprotein des MARV als Homotrimer in die Virushülle inseriert (Feldmann et al., 1991). Es besteht aus 681 AS und wird in eine C-terminal gelegene cytoplasmatische Domäne (11 AS), eine Transmembrandomäne (29 AS) und eine N-terminale luminale Domäne (643 AS) gegliedert. Es wird als klassisches Typ-I-Membranprotein in einem einzigen offenen Leserahmen kodiert (Will et al., 1993), während für die Expression des Volle-Länge EBOV-GP ein RNA-Editing benötigt wird (Sanchez et al., 1996; Volchkov et al., 1995). Der hydrophobe N-Terminus dient als Signalpeptid und wird nach Synthese und Translokation ins endoplasmatische Retikulum abgespalten (Will et al., 1993). GP wird stark N- und O-glykosyliert, wobei die fast fehlende Sialylierung auffällt (Geyer et al., 1992). Stattdessen besitzt GP endständig Galaktosereste. Weitere posttranslationale Modifikationen sind Acylierung und Phosphorylierung (Funke et al., 1995; Sänger et al., 2002). Im Trans-Golgi-Netzwerk wird GP von der Prohormonkonvertase Furin gespalten (Volchkov et al., 2000a), was eventuell zu einer Aktivierung einer Fusionsdomäne führt (Weissenhorn et al., 1998). Die beiden entstehenden Fragmente bleiben über Disulfidbrücken miteinander verbunden. GP1 (luminale Domäne) stellt sich
im SDS-Gel bei 170 kD dar, GP2 (Membrananker und cytoplasmatischer Anteil) bei 45
kD. Untersuchungen zum vektoriellen Transport des GP in polarisierten Zellen ergaben, dass GP während der Virusinfektion zum größten Teil an die apikale Membran transportiert wird, während die Virusfreisetzung ausschließlich basolateral stattfindet. Man nimmt an, dass für den vektoriellen Transport und die Virusfreisetzung andere Faktoren als das GP eine Rolle spielen (Sänger et al., 2001).
VP30 VP30 besteht aus 281 AS (33 kD), ist stark phosphoryliert und Bestandteil des
Nukleokapsidkomplexes. (Becker et al., 1998; Mühlberger et al., 1998; Modrof et al., 2002). Es stellt in der Ordnung der Mononegavirales eine Besonderheit dar, da es als viertes Nukleokapsidprotein nur bei der Familie der Filoviridae vorkommt. Das bei den
Pneumovirinae ebenfalls als viertes Nukleokapsidprotein gefundene M2-Protein (Huang et al. 1985; Collins et al., 1996; Garcia et al., 1993) stellt aufgrund der unterschiedlichen Lokalisation seines Gens auf dem Virusgenom vermutlich kein Analogon zum VP30 dar. Die Funktion des MARV-VP30 ist bislang unbekannt. In einem artifiziellen Replikations- und Transkriptionssystem (Mühlberger et. al., 1999) konnte gezeigt werden, dass das EBOV-VP30 essentiell für die virale Transkription jedoch nicht für die Replikation ist. MARV-VP30 war für keinen der beiden Vorgänge notwendig. Allerdings ist es im artifiziellen EBOV-System möglich, EBOV-VP30 funktionell durch MARV-VP30 zu ersetzen (Mühlberger et al., 1999). VP30 ist außerdem in der Lage mit NP zu interagieren (Becker et al., 1998).
VP24 VP24 (253 AS, 28 kD) ist wie das VP40 im Matrixraum der Virionen zwischen
dem Nukleokapsid und der Hüllmembran lokalisiert und wird als ein zweites Matrixprotein angesehen (Becker et al., 1998; Elliott et al., 1985). VP24 stellt ebenso wie das VP30 eine Besonderheit in der Ordnung der Mononegavirales dar, da kein anderer Vertreter dieser Ordnung ein entsprechendes Protein besitzt. Die Funktion des VP24 ist unbekannt. Bisher konnte eine Interaktion mit der zytoplasmatischen Domäne des GP und mit negativ geladenen Membranen gezeigt werden (Sänger et al., 1998; Bamberg, 2000). Für EBOV wurde postuliert, dass VP24 für die Bildung von Nukleokapsiden notwendig ist (Huang et al., 2002). Außerdem ist EBOV-VP24 nach solitärer Expression teilweise membran-assoziiert und scheint zur Bildung von virusähnlichen Partikeln in der Lage zu sein, allerdings in wesentlich geringerem Maße als VP40 (Han et al., 2003). Des Weiteren wird VP24 als Pathogenitätsfaktor in der filoviralen Infektion diskutiert. EBOV erzeugt zunächst keine letalen Infektionen im Meerschweinchen, während es nach mehreren Passagen zum Auftreten von hochpathogenen Varianten kommt. Sequenzanalysen der an Meerschweinchen adaptierten EBOV-Varianten ergaben, dass diese Mutationen im VP24-Gen besaßen, die zu AS-Austauschen führten. Es wird angenommen, dass diese Mutationen sowohl für die Adaptation als auch Veränderungen in der Virulenz verantwortlich sind (Volchkov et al., 2000b). Außerdem wird vermutet, dass EBOV-VP24 die IFNβ-vermittelte Induktion von ISRE-Reportergenen inhibieren kann und somit die Siganlkaskade der Interferonantwort bei Virusinfektionen beeinflusst (Basler and Palese, 2003). Für MARV sind ähnliche Mechanismen bisher jedoch nicht beschrieben.
L Das L-Protein umfasst 2331 AS (220 kD) und ist somit das größte Protein des MARV. Es handelt sich bei diesem Protein um den katalytischen Teil der RNA-abhängigen RNA-Polymerase. Es zeigt Homologien zu den L-Proteinen anderer
Mononegavirales, insbesondere der Paramyxoviren, und weist drei bei den Mononegavirales konservierte Polymerase-Motive auf (Mühlberger et al., 1992; Volchkov et al., 1999; Poch et al., 1990).
1.6 Der Replikationszyklus des Marburgvirus
Der Eintritt des Virus in die Zelle wird durch das einzige Oberflächenprotein GP vermittelt, welches die zentrale Rolle bei der Erkennung von zellulären Rezeptoren spielt. Bisher ist nur der Asialoglykoprotein-Rezeptor als möglicher Rezeptorkandidat für die Infektion von Hepatozyten beschrieben (Becker et al., 1995). Der Folat- rezeptor-α wurde als Kofaktor für den Eintritt von EBOV beschrieben (Chan et al., 2001), wobei jedoch gezeigt werden konnte, dass er beim Eintritt in primäre Zelllinien keine Rolle spielt (Simmons et al., 2003b; Sinn et al., 2003). Die C-Typ Lektine DC-SIGN und DC-DC-SIGNR, welche unter anderem auf Makrophagen und dentritischen Zellen exprimiert werden, wurden ebenfalls als mögliche Kofaktoren der EBOV-Infektion beschrieben (Simmons et al., 2003a; Lin et al., 2003). Die Aufnahme der Viren erfolgt durch rezeptorvermittelte Endozytose (Mar’iankova et al., 1993). Nach Fusion der Virushülle mit der endosomalen Membran kommt es zur Freisetzung der Nukleokapside in das Zytoplasma der Zelle, wo Transkription (Synthese virusspezifischer mRNA) und Replikation (Vervielfältigung des Virusgenoms) der viralen RNA stattfindet. Zunächst werden monocistronische, polyadenylierte, nicht-enkapsidierte mRNAs der einzelnen Strukturproteine synthetisiert (Feldmann et al., 1992; Sanchez et al., 1993; Mühlberger et al., 1996). Diese Transkripte enthalten lange, nicht-translatierte Bereiche, die regulatorische Funktionen bei der Proteinsynthese ausüben (Mühlberger et al., 1996; Weik et al., 2002). Die mRNAs werden von der zellulären Translationsmaschinerie in Proteine übersetzt. Wie die Transkription findet die Replikation nur an enkapsidierter RNA statt. Dabei wird die genomische (-)-Strang RNA zunächst vollständig in antigenomische (+)-Strang RNA umgeschrieben, welche dann als Matrize zur Synthese neuer, viraler Genome dient. Sowohl Genom als auch Antigenom liegen in enkapsidierter Form vor. Welcher molekulare Mechanismus für den Wechsel zwischen Transkription und Replikation verantwortlich ist, ist bisher nicht bekannt. Die neusynthetisierten Nukleokapside erscheinen etwa zehn bis zwölf Stunden nach Infektion in typischen intrazytoplasmatischen Einschlusskörpern, welche vermutlich die Syntheseorte der Nukleokapside darstellen (Kolesnikova et al., 2000). Reife Nukleokapsidkomplexe wandern zur Zelloberfläche und nehmen über die Matrixproteine Kontakt zu den Ausschleusungspunkten an der Plasmamembran auf, in die das GP eingelagert ist. Die Freisetzung von MARV-Partikeln erfolgt etwa 22 Stunden nach Infektion.
1.7 Die Funktion der Matrixproteine bei Mononegavirales und
Retroviren
Der Zusammenbau umhüllter Viren umfasst vier wesentliche Schritte (Lenard et al., 1996):
1.) Enkapsidierung der genomischen RNA und Bildung der viralen Ribonukleoprotein (RNP)-Komplexe (Nukleokapside).
2.) Reifung der RNP-Komplexe und Transport zu den Orten der Viruszusammensetzung.
3.) Umhüllung der reifen RNP-Komplexe durch Zellmembranbereiche, in denen virale Glykoproteine angereichert sind.
4.) Abschnürung und Freisetzung der reifen Viruspartikel von der Zelle.
Die Matrixproteine der Mononegavirales und die MA-Proteine der Retroviren zeigen einige Gemeinsamkeiten. Sie sind mengenmäßig mit am häufigsten in den Virionen vertreten und binden an Membranen. Diese Bindung kann jedoch unterschiedlich stark ausgeprägt sein. So liegt zum Beispiel das M-Protein von VSV zu 90 % in löslicher Form und zu 10 % in membrangebundener Form vor (Chong et al., 1993a), während das VP40 des MARV zu 80 % Membranbindung aufweist (Kolesnikova et al., 2002). Für den Zusammenbau der Virionen ist die Interaktion zwischen den Oberflächenproteinen und den zytoplasmatischen viralen Komponenten von zentraler Bedeutung. Bei den negativsträngigen RNA-Viren wird diese Interaktion durch die Matrixproteine vermittelt. Viele Matrixproteine sind in der Lage, spezifisch mit den viralen Oberflächenproteinen zu interagieren. Für das Rabies-Virus (Rhabdoviridae) und das Sendai-Virus (Paramyxoviridae) wurde eine Interaktion der entsprechenden Matrixproteine einerseits mit dem viralen Nukleokapsid und andererseits mit der zytoplasmatischen Domäne der viralen Oberflächenproteine gezeigt (Sanderson et al., 1993; Mebatsion et al., 1999).
Die solitäre Expression von Matrixproteinen führt, auch in Abwesenheit anderer viraler Proteine, zur Abschnürung von sog. virusähnlichen Partikeln (VLPs), die strukturell reifen Viruspartikeln ähneln (Gonzales et al., 1993; Justice et al., 1995; Coronel et al., 1999; Timmins et al., 2001). Eine Koexpression mit viralen Glykoproteinen führt zu einer gemeinsamen Freisetzung in Form der VLPs (Swenson et al., 2004; Schmitt et al., 2002).
Die Matrixproteine der Filoviridae sowie der Rhabdo- und Retroviridae enthalten sogenannte Late-Domain-Motive, von denen bekannt ist, dass sie eine wesentliche Rolle bei der Abschnürung viraler Partikel spielen. Late-Domain-Motive zeichnen sich durch hoch konservierte kurze Peptidsequenzen aus, die der Protein-Protein
Interaktion dienen. Bisher sind verschiedene Late-Domain-Motive bekannt: u.a. PTAP, PPxY und Yxxθ (Freed, 2002; Pelchen-Matthews et al., 2004), wobei x für jede beliebige AS und θ für große hydrophobe AS-Reste steht. Entdeckt wurden diese Motive aufgrund der Beobachtung, dass C-terminale Deletionen beim HIV-1 gag-Protein zu Virionen führen, welche sich nicht von der Plasmamembran ablösen können, sondern durch einen schmalen Faden mit ihr verbunden bleiben (Gottlinger et al., 1991). Die Funktion dieser Late-Domain-Motive scheint in der Interaktion mit Wirtszellproteinen zu liegen. So konnte für das Motiv PTAPPEY des EBOV-VP40 eine Interaktion mit der Ubiquitin-Ligase Nedd4 und Tsg101 gezeigt werden, welche beide in der Sortierung von Proteinen in den endosomalen Stoffwechselweg eine Rolle spielen. Die Mutation oder Deletion dieser Late-Domain-Motive führt zu einer drastischen Reduktion der Freisetzung von VLPs bzw. reifer Viruspartikel von infizierten Zellen (Harty et al., 1999; Licata et al., 2003; Gottwein et al., 2003).
1.8 RNA Interferenz (RNAi)
Der Begriff der RNA Interferenz (RNAi) beschreibt den Gebrauch von doppelsträngiger RNA, mir deren Hilfe sequenzspezifisch mRNAs abgebaut werden können und somit die Expression des entsprechenden Gens unterdrückt werden kann. RNAi ist eines mehrerer sogenannter „post-transcriptional gene silencing“ (PTGS) Phänomene, die bisher in Pflanzen, Pilzen und tierischen Zellen beobachtet wurden (Elbashir et al., 2001, Hammond et al., 2001, Tuschl, 2001, Cogoni and Macino, 2000).
Der RNAi-Mechanismus
Durch das Einbringen von sogenannten „small interfering RNAs“ (siRNAs), kurzen, doppelsträngigen Nukleotidfragmenten mit einer Länge von 21 bp, kann in Säugerzellen die Expression von Proteinen durch spezifischen Abbau ihrer mRNA verhindert werden (Elbashir et al., 2001). Die siRNAs weisen dabei 3’-Überhänge von zwei Nukleotiden auf. Diese siRNAs werden im Folgenden von dem sogenannten „RNA-induced silencing complex“, kurz RISC, erkannt und gebunden. Für die Aktivierung von RISC ist zunächst eine ATP-abhängige Entwindung der siRNA notwendig, der dann die Basenpaarung der gebundenen siRNA mit der homologen mRNA-Zielsequenz folgt. Der aktivierte RISC-Komplex ist nun in der Lage die mRNA zu spalten und somit die Expression des entsprechenden Proteins zu verhindern.
Anwendung der RNAi-Technologie
In der kurzen Zeit nach ihrer Entdeckung haben sich in sehr vielen Bereichen der biomedizinischen Grundlagenforschung Anwendungsmöglichkeiten für die
RNAi-Technologie ergeben. Es besteht die Möglichkeit durch Einführung der siRNAs in Säugerzellen die Expression spezifischer Proteine posttranskriptionell abzuschalten, ohne das Wirtsgenom zu beeinflussen (z.B. durch knock-out Mutanten). Besondere Bedeutung gewinnt der RNAi-Mechanismus in der antiviralen Therapie. Hier konnte bereits eine Replikationsinhibition verschiedener Viren durch siRNAs gezeigt werden (Saksela, 2003). Bisher ist es jedoch beim Menschen noch nicht möglich siRNAs therapeutisch zur Bekämpfung von viralen Infektionen einzusetzen, da sich die Moleküle schnell im Körper abbauen, und nur schwer in Zellen einzubringen und auf ein spezielles Zielgewebe auszurichten sind. Jedoch konnten Influenza-spezifische siRNAs mithilfe von Polymeren in die Lungen infizierter Mäuse gebracht werden, wodurch die Zahl der Grippeviren bei den Tieren um mehr als das Tausendfache gesenkt werden konnte (Ge et al., 2004).
Abbildung 4: Der RNAi-Mechanismus. (Hannon, 2002)
Die siRNAs werden von einer Multikomponenten-Nuklease, RISC (grün), erkannt. Es wird vermutet, dass RISC zunächst von einer latenten Form, welche die doppelsträngige siRNA enthält, in eine aktive Form, RISC*, durch Entwinden der siRNAs überführt werden muss (ATP-abhängig). RISC* nutzt dann die entwundene siRNA, um an das entsprechende Substrat (mRNA) zu binden und dieses abzubauen.
Aktivierung durch ATP mRNA-Zielsequenz RISC RISC* m7G siRNAs
1.9 Fragestellung
Für das VP24 des MARV ist bisher keine Funktion bekannt. Durch Salz-Dissoziationsstudien konnte gezeigt werden, dass es in den Viruspartikeln wie das Matrixprotein VP40 zwischen dem RNP-Komplex und der Hüllmembran lokalisiert ist (Becker et al., 1998; Elliot et al., 1985). Es wird daher als zweites Matrixprotein der Filoviren angesehen, was eine Besonderheit in der Ordnung der Mononegavirales darstellt, da hier üblicherweise nur ein Matrixprotein vorhanden ist. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der näheren Charakterisierung des MARV-VP24.
Hierbei stand zunächst die Fragestellung im Mittelpunkt, ob VP24 in der Lage ist, mit zellulären Membranen zu interagieren und ob es die Bildung von virusähnlichen Partikeln (VLPs) induziert. Es konnte bereits mithilfe von Liposomen und in vitro translatiertem VP24 eine Tendenz zur Interaktion mit negativ geladenen Membranen gezeigt werden (Bamberg, 2000), die jedoch in einem zellulären Hintergrund näher untersucht werden sollte. Des Weiteren galt es, die intrazelluläre Lokalisation von singulär exprimiertem VP24 sowie von VP24 im Hintergrund einer MARV-Infektion durch Immunfluoreszenzanalysen aufzudecken. Ferner stand die Untersuchung von möglichen Interaktionen mit anderen viralen Proteinen im Vordergrund.
Um die Funktion des VP24 in der Replikation und Morphogenese während der Virusinfektion zu untersuchen, wurde der Einsatz der RNAi-Technologie gewählt. Hierbei sollte die Proteinexpression von VP24 mithilfe der RNA Interferenz abgeschaltet und die Auswirkungen der vermindertenn VP24-Expression auf andere virale Proteine sowie die Ausschleusung reifer Partikel untersucht werden.
2 Material
2.1 Chemikalien
Aceton Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Agarose, ultrarein BRL, Neu-Isenburg
Agarose, NA Amersham Pharmacia Biotech Europe
GmbH, Freiburg
Alconox Sigma-Aldrich, Deisenhofen
6-Amino-n-Capronsäure Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Ammoniumchlorid Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Ammoniumhydrogenkarbonat Merck Eurolab GmbH, Darmstadt Ammoniumpersulfat (APS) Biorad, Richmond (USA)
Ampicillin (Natriumsalz) Serva, Heidelberg
Bacto-Agar Difco Lab., Detroit (USA)
Borsäure Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Bovines Serumalbumin (BSA) Serva, Heidelberg Bromphenolblau (BPB) Serva, Heidelberg
Calciumchlorid (CaCl2) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
CompleteTM (Proteasen-Inhibitor-Cocktail) Roche, Mannheim Coomassie Brillant Blue R250 Serva, Heidelberg
DAPI (4’, 6-Diamidino-2-phenylindol) Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Dextranblau Amersham Pharmacia Biotech Europe
GmbH, Freiburg
Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt Dinatriumcarbonat (Na2CO3) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Dinatriummethylendiamintetraacetat (EDTA)
Roth, Karlsruhe
Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Dithiothreitol (DTT) Biorad, Richmond (USA)
Essigsäure (HAc) Riedel-de-Haën, Seelze Ethanol (abs.) EtOH Riedel-de-Haën, Seelze
Ethidiumbromid Roche, Mannheim
Ethylacetat Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Fluoprep bioMérieux, Nürtingen
Freundsches Adjuvants, komplett Sigma-Aldrich, Deisenhofen Freundsches Adjuvants, inkomplett Sigma-Aldrich, Deisenhofen
L-Glutamin 200 mM (100×) Gibco BRL, Karlsruhe
Glycerol BRL, Neu-Isenburg
Glycin Riedel-de-Haën, Seelze
Glycogen (20 µg / µl) Roche, Mannheim
Harnstoff (ultrarein) BRL, Neu-Isenburg
Hefeextrakt Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Isopropanol Merck Eurolab GmbH, Darmstadt Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid
(IPTG)
Roth, Karlsruhe
Kaliumchlorid (KCl) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt Kaliumhydrogenphosphat (KH2PO4) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Lipofectin-Reagenz Invitrogen, Karlsruhe LipofectamineTM 2000 Invitrogen, Karlsruhe
LipofectamineTM Invitrogen, Karlsruhe
Magermilchpulver Töpfer, Dietmannsried
Magnesiumchloridhexahydrat (MgCl2 × 6H2O) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Magnesiumsulfat (MgSO4) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
β-Mercaptoethanol Serva, Heidelberg
Methanol (MeOH) Riedel-de-Haën, Seelze
Natriumacetat Merck Eurolab GmbH, Darmstadt Natriumazid (NaN3) J.T. Baker B.V., Deventer (Holland)
Natriumchlorid (NaCl) Roth, Karlsruhe
Natriumdodecylsulfat (SDS) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt Natriumfluorid (NaF) Sigma-Aldrich, Deisenhofen Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Natriumhydroxid (NaOH) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt Natrium-o-Vanadat (NaV) Sigma-Aldrich, Deisenhofen
N(onidet)P40 Amersham Pharmacia Biotech Europe
GmbH, Freiburg
Paraformaldehyd (PFA) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt Penicillin/Streptomycin 5000 IU/ml Gibco BRL, Karlsruhe
Pepton Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) Roche, Mannheim
Polyacrylamid-Lösung (29:1) Biorad, Richmond (USA)
rotiphorese Gel 30 Roth, Karlsruhe
Saccharose Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Salzsäure (HCl) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Stickstoff (99,996 %) Messer-Griesheim, Siegen SuperSignal Ultra® West Dura Extended
Duration Substrate
Pierce, Rockford (USA) SuperSignal® West Femto Maximum
Sensitivity Substrate
Pierce, Rockford (USA)
Tetracyclin Serva, Heidelberg N, N, N´, N´, -
Tetramethylethylethylendiamin (TEMED)
Biorad, Richmond (USA) Trishydroxymethylaminomethan (Tris-Base) Roth, Karlsruhe
Triton X-100 Serva, Heidelberg
Triton X-114 Serva, Heidelberg
Tween 20 Serva, Heidelberg
Wasser, nukleasefrei Ambion, Austin (USA)
2.2 Verbrauchsmaterialien
9 cm Zellkulturschalen Greiner, Nürtingen 6 well-, 12 well-, 24 well-Zellkulturplatten Greiner, Nürtingen
75 cm2 Zellkulturflaschen Costar, Cambridge (USA) 162 cm2 Zellkulturflaschen Costar, Cambridge (USA)
Bio-Image Screen: Imaging plate 2040S Fuji, Kanagawa (Japan) Blottingpapier GB 002 (Whatman 3MM) Whatman, New Jersey (USA)
Gefrierfolie Krups, Solingen
Gewebekulturröhrchen Greiner, Nürtingen
Immobilon™ P, PVDF-Membran Millipore, Eschborn
Kapillarspitzen 200 µl Biozym Diagnostik, Hess. Oldendorf Nitrocelluloseacetatfolie (NTA) Schleicher & Schuell, Dassel
Objektträger Menzel GmbH, Braunschweig
Parafilm Pechiney Plastic Packaging, Neenah (USA)
PCR-tubes, 0,2 ml Biozym, Hess. Oldendorf
Petrischalen Greiner, Nürtingen
Pipetten 2 + 10 ml, Cellstar® bio-one Greiner, Nürtingen
Pipettenspitzen, oberflächenoptimiert Nerbe Plus, Winsen/Luhe Polypropylen-Reaktionsgefäße (15 ml, 50 ml) Greiner, Solingen
Polaroidfilm 667 Professional Polaroid, Cambridge (USA) Reaktionsgefäße 1,5 / 2 ml Eppendorf, Hamburg Präzisions-Küvetten aus Quarzglas Hellma, Müllheim
Röntgenfilme (BiomaxTM MR) Kodak, Rochester (USA)
Feather-Skalpell PfM AG, Köln
Ultraclear™-Zentrifugenröhrchen SW41 Beckmann, Palo Alto (USA) Zellschaber, greiner bio-one Greiner, Nürtingen
2.3 Kits
ABI Prism™ Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit
Perkin Elmer Cetus, Norwalk (USA) DIG Glycan Differentiation Kit Roche, Mannheim
E.Z.N.A.® Plasmid Miniprep Kit I Peqlab, Erlangen
Gene Amp™ PCR Reagent Kit Perkin Elmer Cetus, Norwalk (USA) HiSpeed Plasmid Maxi Kit Qiagen, Hilden
QIAamp® Viral RNA Mini Kit Qiagen, Hilden
QIAfilter® Plasmid Maxi Kit Qiagen, Hilden QIAprep® Spin Miniprep Kit Qiagen, Hilden
QIAquick® Gel Extraction Kit Qiagen, Hilden
QIAquick® PCR Purification Kit Qiagen, Hilden
QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit
Stratagene, Heidelberg
RNeasy®Mini Kit Qiagen, Hilden
SuperScriptTM One-Step RT-PCR with
Platinum Taq
Invitrogen, Karlsruhe
SYBR Green I Dye Invitrogen, Karlsruhe TNT® T7 Quick Coupled
Transcription/Translation Kit
Promega GmbH, Mannheim Z-Competent E.coli Transformation Kit™
and Buffer Set
Zymo Research, Orange (USA)
2.4 Geräte
Biofuge A Heraeus Sepatech GmbH, Osterode
Biofuge 13 Heraeus Sepatech GmbH, Osterode
Bio-Imager Analyser BAS-1000 Fuji, Kanagawa (Japan)
Branson Sonifier 450 Heinemann, Schwäbisch Gmünd
Brutschrank 6000 Heraeus Instruments, Hanau
DNA Thermal Cycler TC1 Perkin-Elmer Cetus, Norwalk (USA) Elektronenmikroskop Zeiss 109 Zeiss, Jena
Eppendorf Kühlzentrifuge 5417R Eppendorf, Hamburg Eppendorf Reference Pipetten
(0,1-2,5 µl; 0,5-10 µl; 10-100 µl; 100-1.000 µl)
Eppendorf, Hamburg Eppendorf Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg Eppendorf-Tischzentrifuge 5145 Eppendorf, Hamburg
Fastblot B34 Biometra, Göttingen
Feinwaage Sartorius, Göttingen
Fluoreszenzmikroskop Zeiss, Jena
Geiger-Müller-Zähler Berthold, Wildbad
GelDoc 2000 Biorad, Richmond (USA)
Genequant II DNA / RNA Calculator Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Freiburg
Horizontalschüttler HS 250 Basis IKA Labortechnik, Staufen
J2 21 Zentrifuge Beckmann, Palo Alto (USA)
Keutz®-Gel-Trocken-Rahmen von Keutz, Reiskirchen
Keutz®-Minigelkammer von Keutz, Reiskirchen
Kippschüttler von Keutz, Reiskirchen
Krups Vakupack plus Krups, Solingen
LightCycler Roche, Mannheim
MegaBACETM 1000 Amersham Pharmacia Biotech Europe
GmbH, Freiburg
Megafuge 1.0R Heraeus Instruments, Hanau
Metallblockthermostat TCS Lab Tech Barkey, Bielefeld Microcomputer Electrophoresis, Power
supply Consort
von Kreutz, Reiskirchen
Mikrowellengerät Bosch
Minifuge RF Heraeus Sepatech GmbH, Osterode
Optimax 2010 Protec Medizintechnik GmbH,
pH-Meter CG 832 Schott Laborgeräte
pipetus® akku Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt Polaroid MP4 Land Camera Polaroid, Cambridge (USA)
Primus Thermocycler MWG Biotech AG, Ebersberg Protean II Gelkammer Biorad, Richmond (USA)
Rotavapor Büchi, Schweiz
Sicherheitswerkbank Heraeus Instruments, Hanau
Spot Kamera, Version 3.1.2 Diagnostic Instruments, Michigan (USA)
Überkopfrotierer Heidolph, Schwabach
UV-Durchflußphotometer Uvicord® SII Amersham Pharmacia Biotech Europe
GmbH, Freiburg
UV-Schirm 302 nm Bachofer, Reutlingen
Vakuum-Geltrockner von Keutz, Reiskirchen Vakuum-Zentrifuge (Speed-vac) von Keutz, Reiskirchen
Waage Sartorius, Göttingen
Wasserbad mwg lauda MT
2.5 Puffer
und
Lösungen
2.5.1 Puffer
Blockierungs-Puffer für Immunfluoreszenzen 2 % 5 % 0,2 % 0,05 % BSA Glycerol Tween 20 NaN3 in PBSdef. Blockierungspuffer für Western Blots 10 g ad 100 ml Magermilchpulver PBSdef 6x DNA-Probenpuffer 0,25 % 40 % 10 % Bromphenolblau Saccharose GlycerolGlycin-Puffer, sauer 100 mM Glycin, pH 2,5
Karbonatpuffer I Karbonatpuffer II Karbonatpuffer pH11 100 mM 100 mM Na2CO3 NaHCO3
Mischung von I+II 20:1 KoIP-Puffer (∅ BSA) (Koimmunpräzipitations-Puffer) 20 mM 100 mM 5 mM 1 % Tris/HCl, pH 7,6 NaCl EDTA NP40 Lysispuffer für Flotationen 10 mM 250 mM 1 mM 1 mM 200 µM Tris/HCl, pH 7,5 Saccharose EDTA PMSF Natrium-o-Vanadat PBSdef, pH 7.5 (Phosphatpuffer deficient) 8 g 0,2 g 1,15 g 0,2 g ad 1 l NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 dH2O 10× Proteingellaufpuffer 10 g 30 g 250 g ad 1 l SDS Tris-Base Glycin dH2O 4× Proteinprobenpuffer 10 ml 10 ml 15 ml 12,5 ml 1,25 ml ad 50 ml Glycin ß-Mercaptoethanol 40 % SDS 3 M Tris-Base gesättigte BPB-Lösung in dH2O dH2O 4× Probenpuffer für Sequenzgele 500 µl 100 µl 50 mg / ml deionisiertes Formamid 25 mM EDTA, pH 8,0 Dextranblau
Saccharoselösungen für Flotationen (90 %, 45 %, 10 %) X % 10 mM 1 mM Saccharose (w/v) Tris/HCl, pH 7,5 EDTA, pH 8,0 20 %ige Saccharose für VLP-Reinigung 20 % 10 mM 1 mM Saccharose (w/v) Tris/HCl, pH 7,5 EDTA, pH 8,0 SDS-PAGE -Sammelgelpuffer 2,52 ml 0,1 ml 0,5 M Tris/HCl, pH 6,8 10 % SDS SDS-PAGE- Trenngelpuffer 2,5 ml 0,1 ml 2,5 M Tris/HCl, pH 8,8 10 % SDS Sequenzier-Probenpuffer 1 % 5 mM 80 % Dextranblau EDTA, pH 8,0 Formamid siRNA-Lysispuffer 50 mM 150 mM 1 % 1× Tris/HCl, pH 7.5 150 mM NaCl NP40 CompleteTM Stripping-Puffer 62,5 mM 2 % 1 mM Tris/HCl, pH 6,8, SDS β-Mercaptoethanol 50× TAE, pH 8,0 242 g 57,1 g 100 ml ad 1 l Tris-Base Essigsäure 0,5 M EDTA, pH 8,0 dH2O 10× TBE, pH 8,0 108 g 55 g 40 ml ad 1 l Tris-Base Borsäure 0,5 M EDTA, pH 8,0 dH2O
TBS
(Affinitätsreinigung von AK)
500 mM 20 mM 0,05 % NaCl Tris/HCl, pH 7,4 Tween 20 (v/v) TBS-B 500 mM 20 mM 0.05 % 3 % NaCl Tris/HCl, pH 7,4 Tween 20 (v/v) BSA (w/v) TE-Puffer 10 ml 2 ml ad 1 l 1 M Tris/HCl, pH 7,5 0,5 M EDTA, pH 8,0 dH2O Tris/KCl-Puffer 10 mM 150 mM 0,1 % 3 % Tris/HCl, pH 8,0 KCl NP40 BSA
Tris/KCl-Waschpuffer Wie Tris/KCl-Puffer, jedoch ohne BSA Triton X-114-Lysispuffer 10 mM 150 mM 1 mM 200 µm Tris/HCl, pH 7,5 NaCl PMSF Natrium-o-Vanadat Triton X-114-Saccharose-Kissen 6 % 10 mM 150 mM 0,06 % Saccharose (w/v) Tris/HCl, pH 7,5 NaCl Triton X-114 (v/v) AK-Verdünnungspuffer Western Blot 1 % 0,1 % in Magermilchpulver Tween 20 PBSdef Waschpuffer Western Blot 0,1 %
in
Tween 20 PBSdef
Western Blot Anodenpuffer I 36,34 g 200 ml ad 1 l Tris-Base Ethanol dH2O Western Blot Anodenpuffer II 3,04 g
200 ml ad 1 l Tris-Base Ethanol dH2O Western Blot Kathodenpuffer 5,25 g
3,03 g 200 ml ad 1 l 6-Amino-N-Capronsäure Tris-Base Ethanol dH2O
2.5.2 Lösungen
Ampicillin-Stammlösung 100 mg ad 1 ml Ampicillin dH2OCoomassie®-Färbelösung Wie Fixierer/Entfärber für Proteingele, jedoch mit 0,05 % Coomassie® Brillant Blue R250
Fixierer/Entfärber für Proteingele 300 ml 100 ml 600 ml Ethanol Essigsäure dH2O 100 mM IPTG 1,41 g ad 50 ml Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid dH2O 100 mM Orthovanadat, pH 10 368 g ad 20 ml Natrium-o-Vanadat dH2O 100 mM PMSF 360 mg ad 21 ml PMSF Isopropanol
Tetracyclin-Stammlösung 20 mg ad 1 ml Tetracyclin Ethanol
2.6 Wachstumsmedien
2.6.1 Wachstumsmedien für Bakterien
2YT-Medium 5 g 10 g 16 g ad 1 l NaCl Hefeextrakt Pepton dH20 LB-Agar (1,5 %) 3,75 g ad 250 ml Bacto-Agar LB-Medium LB-Medium 10 g 5 g 10 g ad 1 l NaCl Hefeextrakt Pepton dH20 SOB-Medium 20 g 5 g 0,58 g 0,19 g 10 ml 10 ml ad 1 l Pepton Hefeextract NaCl KCl 1 M MgCl2 1 M MgSO4 dH202.6.2 Wachstumsmedien für Säugerzellen
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco BRL, Karlsruhe
DMEM(+++) 500 ml 50 ml 5 ml 5 ml DMEM FCS (Fetales Kälberserum) L-Glutamin 200 mM (100x) Penicillin/Streptomycin 5000 IU / ml
DMEM(+ Q) 500 ml 5 ml
DMEM
L-Glutamin 200 mM (100x) Fetales Kälberserum (FCS) Whittaker, Heidelberg
Opti-MEM I Gibco BRL, Karlsruhe
Trypsin/EDTA Gibco BRL, Karlsruhe
2.7 Nukleinsäuren und Nukleotide
2.7.1 Nukleinsäuren als Größenmarker
DNA Größenmarker III (λ-DNA EcoRI, HindIII verdaut) Roche, Mannheim
MassRuler™ DNA-ladder High range MBI-Fermentas, St.Leon-Rot
2.7.2 Sonstige Nukleinsäuren und Nukleotide
dATP 2’-Desoxyadenosin 5’-Triphosphat 10 mM Eurogentec, Köln dCTP 2’-Desoxycytidin 5’-Triphosphat 10 mM Eurogentec, Köln dGTP 2’-Desoxyguanosin 5’-Triphosphat 10 mM Eurogentec, Köln dTTP 2’-Desoxythymidin 5’-Triphosphat 10 mM Eurogentec, Köln rATP Adenosin 5’-Triphosphat 10 mM Roche, Mannheim
2.7.3 siRNA Sequenzen
VP24 Nr. 1 sense-Strang: 5’ -CCGUUUUUGGCCCUGAGGAdTdT- 3’ antisense-Strang: 5’ -UCCUCAGGGCCAAAAACGGdTdT- 3’ 20 µM Dr. Michael Krause, IMT, Marburg VP24 Nr. 2 sense-Strang: 5’ -CCUUGCUGUGGUGAGACAGdTdT- 3’ antisense-Strang: 5’ -CUGUCUCACCACAGCAAGGdTdT- 3’ 20 µM Dr. Michael Krause, IMT, Marburg VP35 sense-Strang: 5’ -UAGGCAGAUAUCAGACAUUdTdT- 3’ antisense-Strang: 5’ –AAUGUCUGAUAUCUGCCUdTdT- 3’ 20 µM Qiagen, Hilden VP30 sense-Strang: 5’ -UAGAGAUCAUGACCUUGAUdTdT- 3’ antisense-Strang: 5’ -AUCAAGGUCAUGAUCUCUAdTdT- 3’ 20 µM Qiagen, HildenNP sense-Strang: 5’ -CAGUUCUCGAGUUCAUCUUdTdT- 3’ antisense-Strang: 5’ -AAGAUGAACUCGAGAACUGdTdT- 3’ 20 µM Qiagen, Hilden X sense-Strang: 5’ -UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT- 3’ antisense-Strang: 5’ -ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT- 3’ 20 µM Qiagen, Hilden
2.7.4 DNA-Oligonukleotide (Primer)
MARV-spezifische Vorwärtsprimer Nr. Name Sequenz116 NPv 2515-Bam CAG GGA TCC CAT GAC TTG ATT CAA AGA ATA TAC 718 VP24Flag/mutF CGA TGA CAA GTA ACT GCA GCT CG
958 VP40-PPxA+ GAA CCC CCC TCC TGC TGC TGA TCA CGG TGC 1086 MGP-SmaI f CAG CCC GGG ATG AAG ACC ACA TGT TTC C 1089 MVP24-SmaI f CAG CCC GGG ATG GCA GAA TTA TCA ACG CG 1091 MVP40-SmaII f CAG CCC GGG ATG GCC AGT TCC AGC AAT TAC 1107 VP24-Flag-N+ CGG GAT CCA CCA TGG ACT ACA AGG ACG ACG ATG
ACA AGG CAG AAT TAT CAA CGC GTT AC
1108 VP24-HA-N+ CGG GAT CCA CCA TGG CTT ACC CTT ACC CTT ATG ATG TGC CGG ATT ATG CCG CAG AAT TAT CAA CGC GTT AC
1109 VP24-myc-N+ CGG GAT CCA CCA TGG AAC AAA AAC TCA TCT CAG AAG AGG ATC TGG CAG AAT TAT CAA GCC GTT AC
MARV-spezifische Rückwärtsprimer
138 NP 43.1 Acc R CCT CAT ATC TGT TAT CAT CTA 435 VP24 - Flag
(Pst I)
CTG CAG TTA GTT GTC ATC GTC GTC CTT GTA GTC CAT TAT AGC AAT TTT GCT GTT C
719 VP24Flag/mutR CGA GCT GCA GTT ACT TGT CAT CGT CG
959 VP40-PPxA- GCA CCG TGA TCA GCA GCA GGA GGG GGG TTC 1085 MGP-NotI r GTC GCG GCC GCT TAT CCG ATA TAT TTA GTA AAG 1088 MVP24-NotI r GTC GCG GCC GCT TAT ATA GCA ATT TTG CTG 1092 MVP40-NotI r GTC GCG GCC GCT CAA ACG GCA CTG AGC G 1110 VP24-HA-C- CGG GAT CCT TAG GCA TAA TCC GGC ACA TCA TAA
GGG TAT ATA GCA ATT TTG CTG TTC ATG
1111 VP24-myc-C- CGG GAT CCT TAC AGA TCC TCT TCT GAG ATG AGT TTT TGT TCT ATA GCA ATT TTG CTG TTC ATG
Vektorspezifische Primer
125 pTM1-F ATT GTA TGG GAT CTG ATC TGG 174 pTM1-R GCC AAC TCA GCT TCC TTT CGG
600 pGEX-F GCA GGG CTG GAC AGC CAC GTT TGG TGG TGG CG 601 pGEX-R CCG TCT CCG GGA GCT GCA TGT GTC AGA GG 1233 pCAGGS-forw CCT TCT TCT TTT TCC TAC AG
1234 pCAGGS-rev CCT TTA TTA GCC AGA AGT CAG
Die Schnittstellen von Restriktionsendonukleasen wurden unterstrichen. Nukleotidaustausche wurden durch Fett-Druck hervorgehoben. Die Primer #125 bis #435 wurden von Dr. M. Krause am Institut für Molekularbiologie und Tumorforschung in Marburg synthetisiert. Die Primer #718 bis #1234 wurden von der Firma MWG Biotech in München synthetisiert.
2.8 Vektoren und rekombinante Plasmide
2.8.1 Vektoren
pTM1 B. Moss, NIH, Bethesda (USA)
pCAGGS-MCS-5 Institut für Virologie, Marburg
pGEX-6P1 Amersham Pharmacia Biotech
Europe GmbH, Freiburg
2.8.2 Rekombinante Plasmide
pTM1-MARV-VP24 Institut für Virologie, Marburg
pTM1-MARV-NP Institut für Virologie, Marburg
pTM1-MARV-GP Institut für Virologie, Marburg
kloniertes Plasmid
Matrizen-DNA Oligonukleotide Klonierungs-strategie Zielvektor pTM1-Flag-VP24 pTM1-VP24 #1107 / #174 PCR + RL pTM1 pTM1-HA-VP24 pTM1-VP24 #1108 / #174 PCR + RL pTM1 pTM1-myc-VP24 pTM1-VP24 #1109 / #174 PCR + RL pTM1 pTM1-VP24-Flag pTM1-VP24 #125 / #435 #718 / #719 PCR, IVM pTM1 pTM1-VP24-HA pTM1-VP24 #125 / #1110 PCR + RL pTM1 pTM1-VP24-myc pTM1-VP24 #125 / #1111 PCR + RL pTM1
pGEX-6P1-VP24 pTM1-VP24 RL: BamHI
pGEX-6P1 pCAGGS-VP24 pTM1-VP24 #1088 / #1089 PCR + RL pCAGGS
pCAGGS-HA-VP24 pTM1-VP24 RL: EcoRI, XhoI pCAGGS
pCAGGS-VP40 pTM1-VP24 #1091 / #1092 PCR + RL pCAGGS pCAGGS-VP40-PPPA pTM1-VP24 #958 / #959 #1091 / #1092 IVM, PCR + RL pCAGGS pCAGGS-GP pTM1-GP #1085 / #1086 PCR + RL pCAGGS
pCAGGS-NP pTM1-NP RL: EcoRI pCAGGS
2.9 Proteine
2.9.1 Enzyme
Alkalische Phosphatase,Calf Intestinal Phosphatase (CIP) (10 U / µl)
New England Biolabs GmbH, Frankfurt
Pfu-TurboTM DNA-Polymerase (2.5 U / µl) Stratagene, Heidelberg
Proteinase K, lyophilisiert Sigma-Aldrich, Deisenhofen SAWADY PWO DNA-Polymerase (1U / µl) Peqlab Biotechnologie GmbH,
Erlangen Restriktionsendonukleasen:
BamHI (20 U / µl), DpnI (20 U / µl),
EcoRI (20 U / µl), PstI (20 U / µl), SacI (20 U / µl), SmaI (20 U / µl), StuI (20 U / µl), XhoI (20 U / µl)
New England Biolabs GmbH, Frankfurt
RNase A Qiagen, Hilden
Tabelle 2: Für Klonierungen verwendete DNA-Matrizen und Oligonukleotide.
Die Bezeichnung der Oligonukleotide erfolgte mit der internen Labornummer (#n), deren genaue Bezeichnung und Sequenz unter 2.7.4 verzeichnet ist. PCR: Polymerase-Ketten-Reaktion (3.1.3.3), RL: Restriktionsverdau (3.1.3.1) mit anschließender Ligation (3.1.3.4); IVM: in vitro Mutagenese (3.1.3.5).
RNase-Inhibitor (RNasin) aus humaner Plazenta Roche, Mannheim
T4-DNA-Ligase (4 U / µl) New England Biolabs GmbH, Frankfurt
2.9.2 Antikörper
α GST-MARV-VP24, Kaninchen (27.06.2002) Institut für Virologie, Marburg α MARV-VP24, Kaninchen (17.08.94) Institut für Virologie, Marburg α MARV-NC, Kaninchen (1 M NaCl, 11.06.1996) Institut für Virologie, Marburg α MARV-GP, Kaninchen (glykosyliert, 3/95,
11.09.1996)
Institut für Virologie, Marburg
α MARV-GP, Kaninchen (nicht glykosyliert, 3/95, 11.09.1996)
Institut für Virologie, Marburg α MARV-NP 2B10, Maus, monoklonal Institut für Virologie, Marburg α MARV-VP40, Maus, monoklonal CDC, Atlanta (USA)
α MARV-VP35/2, Meerschweinchen (16.04.1998) Institut für Virologie, Marburg α MARV-VP30 #249, Meerschweinchen Institut für Virologie, Marburg α HA 11 16B12, Maus, monoklonal Santa Cruz Biotechnology, Inc.,
Heidelberg
α α-tubulin, Maus, monoklonal Sigma-Aldrich, Deisenhofen α FlagTM M2, Maus, monoklonal Sigma-Aldrich, Deisenhofen
α FlagTM, Kaninchen Sigma-Aldrich, Deisenhofen
α c-myc sc-789, Kaninchen Santa Cruz Biotechnology, Inc., Heidelberg
α Lamp-1, Maus, monoklonal Santa Cruz Biotechnology, Inc., Heidelberg
α Lamin A/C sc-7292, Maus, monoklonal Santa Cruz Biotechnology, Inc., Heidelberg
Ziege α Maus, Rhodamin-gekoppelt Dianova, Hamburg Esel α Kaninchen, FITC-gekoppelt Dianova, Hamburg Ziege α Maus FITC-gekoppelt Dianova, Hamburg Ziege α Kaninchen, Rhodamin-gekoppelt Dianova, Hamburg
Ziege α Maus, POD DAKO-Diagnostika GmbH,
Hamburg
Ziege α Meerschweinchen, POD DAKO-Diagnostika GmbH, Hamburg
2.9.3 Proteine, Peptide und Aminosäuren
Glutathion, gebunden an Sepharose CL-4B Sigma-Aldrich, Deisenhofen Protein A, gebunden an Sepharose CL-4B Sigma-Aldrich, Deisenhofen RainbowTM Protein Molecular Weight Marker
14,3 - 220 kD
Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Freiburg
2.10 Radioaktiv markierte Substanzen
[14C] RainbowTM Protein Molecular Weight Marker
14,3 - 200 kDa
Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Freiburg [35S]-PromixTM Redivue, 14,3 mCi / ml
(Methionin 10 mCi / ml)
Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Freiburg
2.11 Zellen und Viren
2.11.1 Prokaryotische Zellen
E. coli Stamm BL-21 Amersham Pharmacia Biotech
Europe GmbH, Freiburg
Genotyp: B F-, ompT, hsdS (rB-, mB-), gal, dcm
E. coli Stamm XL1-Blue Stratagene, Heidelberg
Genotyp: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F‘ proAB laclqZ∆M15 Tn10
(Tetr)]
2.11.2 Eukaryotische Zellen
HeLa-Zellen (humane epitheliale Zervixkarzinomzellen): ATCC Klon CCL-2 HEK 293-Zellen (humane, embryonale Nierenzellen)
Vero-Zellen (Nierenzellen der affrikanischen Meerkatze)
2.11.3 Viren
rekombinantes Vacciniavirus MVA-T7 Sutter et al., 1995
3 Methoden
3.1 Molekularbiologische
Methoden
3.1.1 Isolierung und Reinigung von DNA
DNA, die in molekularbiologische Experimente eingesetzt wird, darf keine Verunreinigungen enthalten. Phenol, Chloroform, Ethanol, EDTA, Detergenzien, Salze oder Proteine greifen negativ in den Verlauf nachfolgender biochemischer Reaktionen ein.
3.1.1.1 Reinigung von DNA-Fragmenten > 100 bp
Die DNA wurde mit dem QIAquick PCR Purification Kit über eine Säulenmatrix gereinigt, wobei die Durchführung laut beiliegendem Protokoll erfolgte. Die gereinigte DNA wurde in 30 - 50 µl dH2O von der Säulenmatrix eluiert. Diese Reinigung wurde
nach der Durchführung einer PCR (3.1.3.3) bzw. nach einem Restriktionsverdau (3.1.3.1) durchgeführt.
3.1.1.2 Isolierung von DNA aus Agarosegelen
Zur Extraktion von DNA aus präparativen Agarosegelen wurde das QIAquick Gel Extraction Kit entsprechend der beiliegenden Arbeitsanleitung verwendet. Die DNA wurde über eine Säulenmatrix gereinigt und in 30 µl dH2O eluiert. Ein Zehntel des
Eluats wurde zur Kontrolle der Präparation auf einem analytischen Agarosegel (3.1.2.1.2) aufgetrennt.
3.1.1.3 Ethanolfällung
Mittels Ethanolfällung kann DNA gereinigt und ankonzentriert werden. Ansatz: x µl DNA-Lösung
1 µl Glykogen (20 µg / µl)
x/10 µl 3 M Natriumacetat-Lösung, pH 5,2
ad 2,5fache des bisherigen Volumens 100 % Ethanol
Die Präzipitation erfolgte durch Vortexen bei Raumtemperatur (RT). Das Präzipitat wurde 30 Minuten bei 13.000 UpM abzentrifugiert. Das durch die Verwendung von Glykogen gut sichtbare Pellet wurde mit 300 µl 70 % Ethanol gewaschen, weitere 15 Minuten bei 13.000 UpM abzentrifugiert und das DNA-Pellet bei RT getrocknet. Diese Art der Reinigung wurde nach DNA-Sequenzierung (3.1.2.3) durchgeführt.
3.1.2 Analyse von DNA
3.1.2.1 Elektrophoretische Auftrennung
DNA kann unter nativen Bedingungen entsprechend ihrer Molekülgröße in einer Agarosegelmatrix elektrophoretisch aufgetrennt werden. Die Nukleinsäuren bewegen sich aufgrund ihrer negativen Ladung in einem elektrischen Feld in Richtung der Anode (⊕-Pol), wobei kleinere Fragmente schneller wandern als große. Präparative Gele dienen der Reinigung, analytische der Größenbestimmung von Nukleinsäuren nach enzymatischen Reaktionen.
3.1.2.1.1 Präparative DNA-Agarosegele
Agarosegel: 1 % (w/v) Agarose NA in 1x TAE-Puffer gelöst Laufpuffer: 1x TAE-Puffer, pH 8,0
Die Agarose wurde durch Erhitzen in TAE-Puffer gelöst und in einen Gelschlitten gegossen. Die Proben wurden nach Erstarren des Gels mit 1/6 Volumen 6x DNA-Probenpuffer versetzt und anschließend zusammen mit einem DNA-Längenstandard aufgetrennt. Die Auftrennung erfolgte bei einer konstanten Stromstärke von 60 mA bei maximaler Spannung. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel für 20 Minuten in einer wässrigen Ethidiumbromidlösung (1 µg / ml) gefärbt und die DNA unter UV-Beleuchtung von 302 nm Wellenlänge sichtbar gemacht. Die gewünschten DNA-Banden wurden auf dem UV-Schirm einzeln mit einem Skalpell ausgeschnitten und in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt.
3.1.2.1.2 Analytische DNA-Agarosegele
Agarosegel: 1 % (w/v) Agarose, ultrarein in 1x TBE-Puffer gelöst Laufpuffer: 1x TBE-Puffer, pH 8,0
Aufbau- und Elektrophoresebedingungen entsprechen denen präparativer Agarosegele (3.1.2.1.1). Nach Färbung der DNA wurde diese mithilfe des Geldokumenta-tionssystems GelDoc 2000 visualisiert.
3.1.2.2 Quantifizierung von DNA
Zur Bestimmung der Konzentration von wässrigen DNA-Lösungen wurde deren Absorptionsvermögen photometrisch mithilfe des GeneQuant II bei einer Wellenlänge von 260 nm in einer Quarzküvette mit 1 cm Lichtweg analysiert. Eine Absorption von 1 entsprach dabei einer Konzentration von 50 µg / ml für doppelsträngige (ds) DNA. Um Extinktionen im linearen Bereich (zwischen 0,1 und 0,8) zu erhalten, wurden die Proben entsprechend in dH2O verdünnt.
