4 Ergebnisse
4.2 Untersuchungen zur Membranassoziation von VP24
gekoppelten α Kaninchen-AK wurde VP24 sichtbar gemacht und mithilfe des Fluoreszenzmikroskopes und der Spot-Kamera fotografiert.
Die intrazelluläre Verteilung von VP24 in Hela-Zellen ist in Abbildung 10 dargestellt.
VP24 zeigte eine punktförmige Aggregation in zellkernnahen Bereichen, jedoch nur eine schwache Färbung des Zytoplasmas. Vergleicht man die Lokalisation von VP24 mit den unter 4.1.2 beschriebenen Epitop-markierten Mutanten, so fällt auf, dass die Epitope einen deutlichen Einfluss auf die Lokalisation des VP24 haben und von der Verteilung des WT-VP24 zum Teil stark abweichen. Lediglich die N-terminal mit HA-markierte Mutante zeigte eine sehr ähnliche Verteilung in der Immunfluoreszenz und wurde daher in weiteren Versuchen verwendet.
einer Gleichgewichtszentrifugation aufgrund ihrer Schwebedichte in einem Stufengradienten (60 % - 45 % - 10 %) in die Interphase der hoch (45 %) und niedrig (10 %) konzentrierten Gradienten-Medien zu flotieren. Lösliche Proteine verbleiben in der 60-%igen Lösung.
Für diese Untersuchung wurden zunächst die kodierenden Sequenzen für das VP24 und das HA-VP24 durch Restriktionsverdau und Ligation (3.1.3.1, 3.1.3.4) aus dem Vektor pTM1 in den Vektor pCAGGS übertragen. Die VP24-Sequenzen stehen im pCAGGS-Vektor unter der Kontrolle des β-Chicken-Actin-Promotors, der eine Expression dieser Proteine in Abwesenheit des Helfervirus MVA-T7 ermöglicht.
Für die Flotationsanalyse wurden HEK293-Zellen mit VP24 bzw. pCAGGS-HA-VP24 transfiziert (3.2.2) und 24 Stunden p.t. geerntet, lysiert und der postnukleäre Überstand für die Flotationsanalyse eingesetzt (3.3.6.1). Der Gradient wurde nach der Ultrazentrifugation fraktioniert und die einzelnen Fraktionen mithilfe von SDS-PAGE und Western Blot analysiert (3.3.1.4).
Abbildung 11 zeigt die Membranassoziation von VP24 und HA-VP24. Als Kontrolle für die Flotation der Membranen innerhalb des Gradienten wurde das integrale Membranprotein Lamp-1 (lysosome-associated membrane protein 1) angefärbt (Abbildung 11 A), welches, wie erwartet, gemeinsam mit den Membranen in die oberen Fraktionen 2 und 3 flotierte. Das vorwiegend zytoplasmatisch lokalisierte Protein
Abbildung 11: Flotationsanalyse des WT-VP24 und HA-VP24.
HEK293-Zellen wurden mit pCAGGS-VP24 bzw. pCAGGS-HA-VP24 transfiziert, 24h p.t.
geerntet und einer Flotationsanalyse unterzogen. Darstellung der fraktionierten Gradienten von oben nach unten (Fraktion 1 bis 11) durch SDS-PAGE und Western Blot. A: Färbung mit α Lamp-1-AK und gekoppeltem α Maus-AK, B: Färbung mit α Annexin II-AK und POD-gekoppeltem α Maus-AK, C: Färbung mit dem affinitätsgereinigten VP24-AK und POD-gekoppletem α Kaninchen-AK, D: Färbung mit dem α HA-AK und POD-gekoppeltem α Maus-AK.
Lamp-1 110 kD
VP24 28 kD
29,8 kD HA-VP24
36 kD Annexin II
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
oben unten
A B C D
Annexin II diente als Kontrolle für ein lösliches Protein, welches nicht in der Lage ist zu flotieren (Abbildung 11 B). Vergleicht man das Flotationsverhalten von VP24 und HA-VP24, so sieht man, dass sich beide Proteine, wie auch in der Immunfluoreszenz, ähnlich verhielten. Beide Proteine zeigten eine schwache Tendenz zur Interaktion mit Membranen (Fraktionen 1 bis 4), der weitaus größere Anteil der Proteine lag jedoch in löslicher Form vor (Fraktionen 9 bis 11). In diesem Verhalten unterscheidet sich VP24 deutlich von dem des Matrixproteins VP40, welches eine starke Membranassoziation zeigt (Kolesnikova et al., 2002).
4.2.2 Charakterisierung der Membraninteraktion
Peripher assoziierte Membranproteine können durch verschiedene Behandlungen von Membranen abgelöst werden. Ihr Verhalten lässt dabei einen Rückschluss auf die Beschaffenheit der Membraninteraktion zu (Chong und Rose, 1993). Durch alkalischen pH werden Membranvesikel in Membranblätter transformiert, wodurch lösliche Proteine freigesetzt werden, die in den Vesikeln eingeschlossen waren (Fujiki et al., 1982).
Hohe Salzkonzentrationen schirmen Ladungen und schwache ionische Wechselwirkungen ab, die periphere Proteine direkt oder indirekt über andere Membranproteine an Membranen binden. Chelatbildner stören Membranassoziationen, die durch divalente Kationen-Brücken vermittelt werden (Kretzschmar et al., 1996). Im Folgenden sollte untersucht werden, wie die schwache Interaktion des VP24 mit Membranen beschaffen ist. Da sich VP24 und HA-VP24 in der Flotationsanalyse gleich verhielten, wurden die folgenden Experimente aufgrund der besseren Detektierbarkeit mittels des monoklonalen HA-Antikörper mit HA-VP24 durchgeführt. Zur näheren Charakterisierung der Membranassoziation wurde der postnukleäre Überstand von HA-VP24-transfizierten HEK293-Zellen mit verschiedenen Lösungen (2 M KCl, 50 mM EDTA bzw. Karbonatpuffer pH 11) behandelt (3.3.6.2) und einer Flotation unterzogen.
Zur Kontrolle wurde ein Ansatz nicht behandelt.
2 M KCl
50 mM EDTA HA-VP24
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
oben unten
HA-VP24
HA-VP24 Karbonatpuffer pH11
HA-VP24 ∅
A B C D
Das unbehandelte HA-VP24 bindet, wie bereits unter 4.2.1 gezeigt, nur schwach an Membranen und befindet sich vor allem als lösliches Protein im unteren Teil des Gradienten (Abbildung 12 A). Durch die Behandlung mit 2 M KCl (B) und 50 mM EDTA (C) lässt sich das VP24 nicht von der Membran ablösen, KCl scheint die Bindung eher zu unterstützen. Die Inkubation mit Karbonatpuffer jedoch verringert den Anteil von VP24 in den Membranfraktionen, was darauf hinweist, dass sich ein Teil des flotierten VP24 eingeschlossen in Membranvesikeln befinden könnte und durch diese Behandlung freigesetzt wird.
4.2.3 Membranassoziation von VP24 in Anwesenheit von VP40 oder GP Wie unter 4.2.1 gezeigt, hat VP24 nur eine schwache Tendenz mit zellulären Membranen zu interagieren, während das MARV-spezifische periphere Membranprotein VP40 sowie das Oberfächenprotein GP als integrales Membranprotein stark mit Membranen assoziiert vorliegen. Aufgrund der Lokalisation des VP24 im Matrixraum der Virionen erschien eine Interaktion mit VP40 und GP wahrscheinlich. Eine Interaktion von VP24 mit dem zytoplasmatischen Anteil des GP konnte bereits in GST-Kosedimentationsexperimenten nachgewiesen werden (Bamberg, 2000). Um zu untersuchen, ob VP24 durch die Anwesenheit von VP40 oder GP an die Membranen rekrutiert werden kann, wurden diese Proteine jeweils in HEK293-Zellen koexprimiert und wie zuvor beschrieben einer Flotationsanalyse unterzogen.
Abbildung 12: Charakterisierung der Membranassoziation von HA-VP24.
HEK293-Zellen wurden mit pCAGGS-HA-VP24 transfiziert, 24 h p.t. geerntet und der PNÜ mit 2 M KCl, 50 mM EDTA bzw. Karbonatpuffer pH 11 behandelt. Anschließend wurde eine Flotationsanalyse durchgeführt. Darstellung der fraktionierten Gradienten von oben nach unten (Fraktion 1 bis 11) durch SDS-PAGE und Western Blot. Die Färbung erfolgte mit einem HA-AK sowie einem POD-gekoppelten α Maus-AK. A: unbehandelter PNÜ. B:
Behandlung mit 2 M KCl. C: Behandlung mit 50 mM EDTA. D: Behandlung mit Karbonatpuffer pH 11.
Lamp-1 110 kD
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
oben unten
VP40 33,8 kD
29,8 kD HA-VP24
A
Abbildung 13 A zeigt die Verteilung von VP24 und VP40 im Gradienten nach der Zentrifugation. Als Kontrollprotein für die Membranfraktionen diente wiederum Lamp-1.
VP40 zeigte die erwartete starke Assoziation mit den zellulären Membranen, während sich das Membranbindungsverhalten von VP24 auch in Anwesenheit von VP40 nicht veränderte. Daraus lässt sich schließen, dass VP40 nicht in der Lage ist, VP24 in diesem Flotationsassay an zelluläre Membranen zu rekrutieren.
Die Koexpression von GP und HA-VP24 (Abbildung 13 B) zeigte die erwartete Flotation des GP als integrales Membranprotein in die oberen Fraktionen (1 bis 4), während HA-VP24 im Vergleich zur singulären Expression auch hier keine größere Membranaffinität zeigte. GP scheint daher ebenfalls in der Flotation keinen Einfluss auf die Interaktion des VP24 mit Membranen zu haben.
4.2.4 Untersuchungen zur Membranintegration des VP24
Durch eine Triton X-114 Phasenpartitionierung lässt sich unterscheiden, ob ein membranassoziiertes Protein als peripheres oder integrales Membranprotein vorliegt (3.3.6.3), da dieses Detergenz die Eigenschaft besitzt, bei 0 °C in einer Phase mit der wässrigen Umgebung vorzuliegen, während es bei Erwärmung zu einer Separation des Triton X-114 von der wässrigen Umgebung kommt. Während dieses Phasenübergangs transferiert das Detergenz alle integralen Membranproteine in die sogenannte Detergentienphase, die von Triton X-114 gebildet wird, während alle löslichen oder nur peripher an Membranen gebundene Proteine in der wässrigen Phase verbleiben.
Für VP40 konnte bereits gezeigt werden, dass es sich um ein peripheres Membranprotein handelt, welches sich ausschließlich in der wässrigen Phase der
Abbildung 13: Membranassoziation von HA-VP24 bei Koexpression von VP40 bzw. GP.
HEK293-Zellen wurden mit 1 µg pCAGGS-HA-VP24 und 1 µg pCAGGS-VP40 bzw. 0,5 µg pCAGGS-GP transfiziert, 24 h p.t. geerntet und der PNÜ einer Flotationsanalyse unterzogen.
Darstellung der fraktionierten Gradienten von oben nach unten (Fraktion 1 bis 11) durch SDS-PAGE und Western Blot. A: Flotation von VP40 und HA-VP24 nach Koexpression. B:
Flotation von GP und HA-VP24 nach Koexpression.
B
GP1 160 kD
HA-VP24 29,8 kD
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
oben unten
11
Partitionierung befindet (Kolesnikova et al., 2002). Das Verhalten von VP24 sollte hier im Vergleich zu VP40 untersucht werden.
HEK293-Zellen wurden entweder mit pCAGGS-VP24, pCAGGS-VP40 oder mit beiden Plasmiden im Verhältnis 1:1 transfiziert und 24 Stunden p.t. geerntet (3.2.2). Der PNÜ wurde anschließend einer Triton X-114 Phasenpartitionierung unterzogen, wie sie unter 3.3.6.3 beschrieben ist. Abbildung 14 zeigt die Western Blot Analyse der wässrigen (W) sowie der Detergentienphase (D).
In Abbildung 14 A sind als zelluläre Kontrollproteine das Lamp-1 sowie Annexin II gezeigt. Lamp-1 zeigte als integrales Membranprotein, wie erwartet, die vollständige Anwesenheit in der Detergentienphase, während Annexin II als vorwiegend lösliches Protein ausschließlich in der wässrigen Phase zu finden war. Betrachtet man nun die Verteilung von VP24, so zeigte sich, dass es zu gleichen Teilen in der wässrigen als auch in der Detergentienphase vertreten war. Abbildung 14 B zeigt zur Kontrolle die Partitionierung des VP40, welches sich, wie bereits beschrieben, ausschließlich in der wässrigen Phase wiederfand. Auch die Koexpression des VP24 gemeinsam mit dem VP40 (C) änderte nichts an der Verteilung beider Proteine in der Phasenpartitionierung. VP24 zeigte somit das Verhalten eines partiell membranintegrierten Proteins, während die Sequenz des VP24 jedoch weder eine Signalsequenz für die Translokation in das ER noch eine potentielle Transmembrandomäne aufweist.
220 kD
66 kD 46 kD
30 kD 97 kD
Lamp-1
Annexin II
VP24
W D
Lamp-1
VP40
220 kD
66 kD 46 kD
30 kD 97 kD
W D
220 kD
66 kD 46 kD
30 kD 97 kD
VP40 Lamp-1
VP24
W D
A B C
1 2 1 2 1 2
Abbildung 14: Triton X-114 Phasenpartitionierung von VP24 und VP40.
HEK293-Zellen wurden einzeln und in Kombination mit pCAGGS-VP24 und pCAGGS-VP40 transfiziert, 24 h p.t. geerntet und der PNÜ einer Phasenpartitionierung unterzogen.
Darstellung der wässrigen (W) sowie der Detergentienphase (D) durch SDS-PAGE und Western Blot. A: Partitionierung von singulär exprimiertem VP24. B: Partitionierung von singulär exprimiertem VP40. C: Partitionierung von VP24 und VP40 nach Koexpression.
Es stellte sich daher die Frage, ob diese potentiell membranintegrierte Form auch in reifen MARV-Partikeln zu finden ist. Daher wurden aufgereinigte Marburgvirus-Partikel im Sicherheitslabor ebenfalls einer Phasenpartitionierung (3.3.6.3) unterzogen und mittels SDS-PAGE und Western Blot analysiert.
Die Phasenpartitionierung der MARV-Partikel (Abbildung 15) ergab, dass sich die Virusproteine VP24 und VP40, welche mit reifen Partikeln ausgeschleust werden, genauso verhielten wie die transient exprimierten Proteine. Offenbar werden beide Formen des VP24, die lösliche sowie die tendenziell membranintegrierte bei der Virusreifung eingebaut.