4 Ergebnisse
4.3 Bildung von virusähnlichen Partikeln (VLPs)
Es stellte sich daher die Frage, ob diese potentiell membranintegrierte Form auch in reifen MARV-Partikeln zu finden ist. Daher wurden aufgereinigte Marburgvirus-Partikel im Sicherheitslabor ebenfalls einer Phasenpartitionierung (3.3.6.3) unterzogen und mittels SDS-PAGE und Western Blot analysiert.
Die Phasenpartitionierung der MARV-Partikel (Abbildung 15) ergab, dass sich die Virusproteine VP24 und VP40, welche mit reifen Partikeln ausgeschleust werden, genauso verhielten wie die transient exprimierten Proteine. Offenbar werden beide Formen des VP24, die lösliche sowie die tendenziell membranintegrierte bei der Virusreifung eingebaut.
das Oberfächenprotein GP tragen. Des Weiteren ist gezeigt, dass VP40 in der Lage ist GP in die von VP40 gebildeten, filamentösen VLPs zu rekrutieren (Noda et al., 2002;
Swenson et al., 2004; Kolesnikova et al., 2004b).
4.3.1 Bildung von VLPs durch Einzelexpression von VP40, GP und VP24 Zunächst stellte sich die Frage, ob VP24 als potentielles zweites Matrixprotein der Filoviren ebenfalls in der Lage ist, VLPs zu bilden, wie es für die Matrixproteine vieler Vertreter der Mononegavirales gezeigt werden konnte. Für das EBOV-VP24 ist bereits eine Freisetzung in membranumhüllter Form in den Zellkulturüberstand beschrieben (Han et al., 2003). Um ein solches Verhalten für das MARV-VP24 zu untersuchen, wurde WT-VP24 transient in HEK293-Zellen exprimiert und der Zellkulturüberstand 48 Stunden p.t. auf die Anwesenheit von VLPs hin untersucht. Hierzu wurde partikuläres Material aus dem Überstand durch eine dreistündige Zentrifugation über ein Saccharose-Kissen aufgereinigt (3.2.4). Um sicherzustellen, dass es sich bei den pelletierten Proteinen wirklich um membranumhüllte VLPs handelte und nicht um Membrandebris mit assoziierten Proteinen oder Proteinaggregate, wurde ein Proteinase K-Verdau durchgeführt (3.3.5). Das resuspendierte Pellet wurde in drei Ansätze geteilt, einer blieb unbehandelt (PBSdef), der zweite wurde mit Proteinase K versetzt. Hier erwartet man den Abbau aller Proteine, die nicht durch eine Membran geschützt vorliegen, und kann somit im Vergleich zum ersten Ansatz den Anteil an pelletiertem Protein von membranumhülltem Protein unterscheiden. Als Kontrolle wurde der dritte Ansatz neben Proteinase K zusätzlich mit dem Detergenz Triton X-100 versetzt, welches die Membranen zerstört und somit auch membranumhülltes Protein der Protease zugänglich macht. Als Kontrollen für die Funktionalität der VLP-Reinigung sowie des Proteinase K-Verdaus wurden VP40 bzw. GP parallel exprimiert. Die VLPs wurden im Anschluss mithilfe von SDS-PAGE und Western Blot analysiert (3.3.1.1, 3.3.1.4).
Abbildung 16 zeigt die Ergebnisse der Aufreinigung der VLPs von VP40, GP und VP24.
Die Einzelexpression von VP40 (Spur 4) führte, wie erwartet, zur Freisetzung von VP40 in den Zellkulturüberstand (Abbildung 16 A, Spur 1). Die Behandlung mit Proteinase K und zusätzlich Triton X-100 (Spuren 2 und 3) machte deutlich, das diese Freisetzung in Form von membranumhüllten Partikeln stattfand. Das VLP-Pellet wurde außerdem von Dr. Larissa Kolesnikova elektronenmikroskopisch untersucht und es konnten die typischen, filamentösen Partikel dargestellt werden (Abbildung nicht gezeigt).
Die Einzelexpression von GP (Abbildung 16 B, Spur 4) führte ebenfalls zu seiner Freisetzung (B, Spur 1), jedoch konnte hier durch den Proteinase K-Verdau nicht eindeutig festgestellt werden, ob dies tatsächlich in Form von VLPs geschah, da der größte Anteil des Proteins (GP1 sowie Teile des GP2) aus der Membran herausragt und somit auch ohne Triton X-100-Behandlung für die Proteinase K zugänglich ist.
Lediglich ein kleiner Anteil des GP2 war nach Proteinase K-Verdau noch detektierbar (B, Spur 2). Die Einzelexpression von VP24 (Abbildung 16 C, Spur 4) führte nicht zu einer Freisetzung von VP24 (C, Spur 1-3) in den Zellkulturüberstand. Die Proben wurden nach der Ultrazentrifugation ebenfalls einer elektronenmikroskopischen Untersuchung unterzogen, doch auch hier konnten keine membranumhüllten Strukturen festgestellt werden (Abbildungen nicht gezeigt). Somit scheint das VP24 des Marburgvirus nicht in der Lage zu sein, seine eigene Freisetzung in Form von membranumhüllten, virusähnlichen Partikeln zu vermitteln.
Abbildung 16: Bildung von virusähnlichen Partikeln durch Einzelexpression von VP40, GP und VP24.
HEK293-Zellen wurden mit jeweils 1 µg pCAGGS-VP24, pCAGGS-VP40 oder pCAGGS-GP transfiziert und 48 h p.t. wurden Überstand und Zellen geerntet. Der Überstand wurde über ein Saccharose-Kissen zentrifugiert, die pelletierten VLPs anschließend einem Proteinase K-Verdau unterzogen und die Proben mittels SDS-PAGE und Western Blot analysiert. A:
Aufreinigung und Proteinase K-Verdau des Zellkulturüberstandes von VP40-transfizierten Zellen. Spur 1 zeigt das unbehandelte Pellet, Spur 2 die Behandlung mit Proteinase K (P.K) und Spur 3 die Behandlung mit Proteinase K sowie Triton X 100 (TX100). Spur 4 zeigt die zelluläre Expression. B: Darstellung der von GP erzeugten virusähnlichen Partikel. Spuren 1-4 wie unter A beschrieben. C: Darstellung des Zellkulturüberstands von VP24-exprimierenden Zellen. Spuren 1-4 wie unter A beschrieben. * markiert ein bisher unbekanntes, zelluläres Protein.
66 kD 46 kD
30 kD 97 kD
T X100 P.K
-+ + - +
21 kD
Zelllysat
Überstand
VP24 1 2 3 4
C
66 kD 46 kD
30 kD 97 kD
21 kD T X100
P.K
-+ +
- + Zelllysat Überstand
VP40
1 2 3 4
A
66 kD 46 kD
30 kD 97 kD
21 kD T X100
P.K
-+ +
- + Zelllysat Überstand
GP1
GP2
1 2 3 4
B
GPER
*
4.3.2 Koexpression von VP24, VP40 und GP in äquivalenten Mengen zur Virusinfektion
Bevor im Folgenden die Freisetzung von VP24 durch VP40 oder GP bzw. der Einfluss des VP24 auf deren Freisetzung untersucht werden konnte, sollte zunächst betrachtet werden, ob VP24 die Expression von GP oder VP40 beeinflussen kann und in welchem Verhältnis die kodierenden Plasmide für VP24, VP40 und GP zueinander transfiziert werden müssen, um eine der Virusinfektion entsprechende Proteinexpression zu erhalten.
4.3.2.1 Einfluss des VP24 auf die Expression von VP40 und GP
Es wurde zunächst untersucht, ob die Koexpression von VP24 Einfluss auf die Expression von VP40 bzw. GP nimmt. Ansteigende Mengen von pCAGGS-VP24 wurden mit 0,5 µg pCAGGS-VP40 bzw. 0,2 µg pCAGGS-GP in HEK293-Zellen kotransfiziert (3.2.2). 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen in PBSdef geerntet, mit 4x-Proteinprobenpuffer versetzt und die synthetisierten Proteinmengen mittels SDS-PAGE und Western Blot sichtbar gemacht und miteinander verglichen (3.3.1.4).
Die Koexpression von VP24 und GP (Abbildung 17 A) zeigte kaum Einfluss auf die Bildung und Spaltung von GP. Lediglich eine leichte Erhöhung der GP-Menge konnte ab einer eingesetzten DNA-Konzentration von 0,6 µg des Vektors pCAGGS-VP24 festgestellt werden, was für eine potentielle Stabilisierung des GP durch VP24
220 kD
66 kD 46 kD
30 kD 97 kD
0 0,2
1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 pC-VP24 (µg)
0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 pC-GP (µg)
GP1
GP2
VP24
∗
220 kD
66 kD 46 kD
30 kD 97 kD 220 kD
66 kD 46 kD
30 kD 97 kD
0 0,2
1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 pC-VP24 (µg)
0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 pC-GP (µg)
GP1
GP2
VP24
∗ 46 kD
30 kD
VP40 VP24
0 0,5
0,8 0,6 0,4 0,2 0,1 pC-VP24 (µg)
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 pC-VP40 (µg)
46 kD
30 kD 46 kD
30 kD
VP40 VP24
0 0,5
0,8 0,6 0,4 0,2 0,1 pC-VP24 (µg)
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 pC-VP40 (µg)
A B
1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 5 6
Abbildung 17: Einfluss des VP24 auf die Expression von VP40 bzw. GP.
HEK293-Zellen wurden mit jeweils 0,2 µg pCAGGS-GP oder 0,5 µg pCAGGS-VP40 sowie mit verschiedenen Mengen an pCAGGS-VP24 transfiziert. 24 h p.t. wurden die Zellen geerntet und die Proteine im Western Blot sichtbar gemacht. A: Koexpression von GP ohne VP24 (Spur 1) sowie mit ansteigenden Mengen an VP24 (Spuren 2 bis 6). B: Koexpression von VP40 ohne VP24 (Spur 1) sowie mit ansteigenden Mengen an VP24 (Spuren 2 bis 6).
* markiert ein bisher unbekanntes, zelluläres Protein.
sprechen könnte. Betrachtet man die Koexpression von VP24 und VP40 (Abbildung 17 B), so beobachtet man hier keinen Effekt des VP24 auf die in der Zelle vorliegende VP40-Menge.
4.3.2.2 Expression von VP24, VP40 und GP in äquivalenten Mengen zur MARV-Infektion
Im Weiteren wurde ermittelt, welche Plasmidmengen eingesetzt werden müssen, um bei der rekombinanten Expression der viralen Proteine ein Verhältnis zu erreichen, das dem in MARV-infizierten Zellen entspricht. Ein der natürlichen Infektion entsprechendes Bild bezüglich der Verhältnisse von VP40 und GP zeigte sich, wenn sie im Verhältnis 1:0,2 transfiziert wurden (Berghöfer, 2003). VP24 ist in der Virusinfektion mengenmäßig schwächer vertreten als das VP40, jedoch zeigt es ein stärkeres Signal als GP. Aufgrund dieser Beobachtung wurden die drei viralen Proteine im Verhältnis VP24:VP40:GP = 0,5:1:0,2 in HEK293-Zellen transfiziert und die Proteinexpression 48 Stunden p.t. mit der Proteinexpression von MARV-infizierten Vero-Zellen verglichen.
Abbildung 18 zeigt die Färbung von GP, VP40 und VP24 im Western Blot. Die Signale der einzelnen Proteine machen deutlich, dass die Transfektion der drei Plasmide in dem oben genannten Verhältnis eine Proteinexpression vermitteln, die der Expression
220 kD
97 kD 66 kD
45 kD
30 kD
GP1
VP40 VP24 MARV
GP + VP40 + VP24
Abbildung 18: Vergleich der Proteinmengen in MARV-infizierten Vero-Zellen und transfizierten HEK293-Zellen.
Vero-Zellen wurden 1 h mit MARV infiziert und 24 h p.i. geerntet. HEK293-Zellen wurden mit 1 µg pCAGGS-VP40, 0,5 µg pCAGGS-VP24 und 0,2 µg pCAGGS-GP transfiziert, die Zelllysate 48 h p.t. geerntet und mittels SDS-PAGE und Western Blot analysiert.
von GP, VP40 und VP24 in virusinfizierten Zellen entspricht. Die folgenden Kotransfektionen zur Untersuchung der VLPs wurden deshalb immer in diesem Verhältnis durchgeführt.
4.3.3 Rekrutierung von VP24 in von VP40 bzw. GP gebildete VLPs
Da VP24 nicht in der Lage ist, virusähnliche Strukturen auszubilden, stellte sich im Weiteren die Frage, ob VP24 in die von VP40- bzw. GP-gebildeten Partikel rekrutiert werden kann.
Um dies zu untersuchen, wurde VP24 jeweils entweder mit VP40 oder GP koexprimiert und die resultierenden VLPs auf den Einbau von VP24 hin untersucht. 0,5 µg pCAGGS-VP24 wurde zusammen mit 1 µg pCAGGS-VP40 bzw. 0,2 µg pCAGGS-GP in HEK293-Zellen kotransfiziert (3.2.2). 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen sowie der Zellkulturüberstand geerntet und die gebildeten VLPs durch Zentrifugation des Überstandes über ein Saccharose-Kissen aufgereinigt (3.2.4). Im Anschluss wurde, wie bereits unter 4.3.1 beschrieben, ein Proteinase K-Verdau durchgeführt, um membranumhüllte Proteine von freien Proteinen zu unterscheiden.
Die Einzelexpression von VP24 zeigte, wie erwartet, keine Freisetzung des exprimierten VP24 (Abbildung 19 A), während die Koexpression mit VP40 dazu führte, dass VP24 im Zellkulturüberstand detektierbar wurde (B, Spur 1). Dieser freigesetzte Anteil an VP24 war zudem resistent gegen Proteinase K-Verdau (B, Spur 2), ebenso wie das VP40, und wurde erst durch Anwesenheit des Triton X-100 für die Protease angreifbar (B, Spur 3), was darauf hindeutet, dass VP24 in die von VP40 gebildeten VLPs eingebaut und so in den Zellkulturüberstand abgegeben wurde. Somit ist eine Interaktion zwischen VP24 und VP40 sehr wahrscheinlich.
T X100 P.K
-+ +
- + Zelllysat Überstand
A
1 2 3 4
T X100 P.K
-+ +
- + Zelllysat Überstand
B
1 2 3 4
P.K
-+ +
- + Zelllysat Überstand
T X100
C
1 2 3 4
VP24 VP40 GP1
GP2
VP24 VP40 GP1
GP2
VP24 VP40 GP1
GP2
Im Gegensatz zu VP40 führte die Koexpression von GP und VP24 (Abbildung 19 C, Spur 4) nicht zur Freisetzung von VP24 in den Zellkulturüberstand, während GP hier jedoch detektiert werden konnte (C, Spur 1). GP scheint somit im Gegensatz zu VP40 nicht in der Lage zu sein, VP24 in die von GP gebildeten virusähnlichen Partikel zu rekrutieren und in den Überstand freizusetzen. Die durch Koexpression von VP24 und VP40 entstandenen Partikel wurden außerdem elektronenmikroskopisch von Dr. Larissa Kolesnikova untersucht. Es zeigte sich (Abbildung 19 D), dass auch hier die für VP40 typischen filamentösen VLPs gefunden wurden. Aufgrund der Umhüllung durch die Membran waren die eingeschlossenen Proteine nicht für eine Antikörperfärbung zugänglich (weder VP40, noch VP24), jedoch war in Bereichen, in denen die Membran beschädigt zu sein schien, eine Färbung sowohl von VP24 (12 nm Goldpartikel, Pfeil) als auch von VP40 (6 nm Goldpartikel, Pfeilkopf) möglich.
4.3.4 Einfluss des VP24 auf die Bildung von virusähnlichen Partikeln Im Folgenden stellte sich die Frage, ob VP24 die Freisetzung von VP40 und GP beeinflussen kann. Um diese Frage zu beantworten, wurden die drei Proteine jeweils
Abbildung 19: Rekrutierung von VP24 in virusähnliche Partikel.
HEK293-Zellen wurden mit jeweils 0,5 µg pCAGGS-VP24 und 1 µg pCAGGS-VP40 oder 0,2 µg pCAGGS-GP transfiziert und 48 h p.t. wurden Überstand und Zellen geerntet. Der Überstand wurde über ein Saccharose-Kissen zentrifugiert und die pelletierten VLPs anschließend einem Proteinase K-Verdau unterzogen. Die Proben wurden mittels SDS-PAGE und Western Blot analysiert. A: Aufreinigung und Proteinase K-Verdau des Zellkulturüberstandes von VP24-transfizierten Zellen. Spur 1 zeigt das unbehandelte Pellet, Spur 2 die Behandlung mit Proteinase K (P.K) und Spur 3 die Behandlung mit Proteinase K sowie Triton X-100 (TX100). Spur 4 zeigt die zelluläre Expression. B: Koexpression von VP24 und VP40. Die Spuren 1 bis 3 zeigen den Proteinase K-Verdau, Spur 4 zeigt die zelluläre Expression. C: Koexpression von VP24 und GP. Die Spuren 1 bis 3 zeigen den Proteinase K-Verdau, Spur 4 zeigt die zelluläre Expression. D: Elektronenmikroskopische Aufnahme von VLPs, enstanden durch Koexpression von VP24 und VP40, nach Zentrifugation über ein Saccharose-Kissen. Gefärbt wurde mit α VP24- (Kaninchen) und α VP40- (Maus) Antikörpern. VP24 ist mit 12 nm Goldpartikeln (Pfeil) durch Verwendung eines Gold-markierten Esel α Kaninchen-Sekundärantikörpers markiert. VP40 ist durch 6 nm Goldpartikel (Pfeilkopf) durch Verwendung eines Gold-markierten Esel α Maus-Sekundärantikörpers markiert. 60000fach Vergrößerung. EM-Bild Dr. Larissa Kolesnikova.
D
¿
einzeln (VP24, VP40, GP), in Zweierkombinationen (VP24 + VP40, VP24 + GP, VP40 + GP) und zusammen in HEK293-Zellen exprimiert und die Freisetzung der virusähnlichen Partikel miteinander verglichen. VP24, VP40 und GP wurden im Verhältnis 0,5:1:0,2 transfiziert (s. 4.3.2.2). Um die transfizierten DNA-Mengen vergleichbar zu halten wurde, wenn notwendig, mit Leervektor pCAGGS aufgefüllt. Der Zellkulturüberstand wurde 48 Stunden p.t. geerntet, ebenso die Zellen (3.2.4).
Abbildung 20 zeigt die Darstellung der zellulären Expression der einzelnen Proteine (A) sowie deren Freisetzung in den Zellkulturüberstand (B) mittels Western Blot Analysen (3.3.1.4).
Vergleicht man zunächst die Einzelexpression von VP40 (B, Spur2) mit der Koexpression von VP40 und VP24 (B, Spur 4) so fällt zum einen auf, dass es, wie bereits gezeigt, zur Freisetzung von VP24 in Anwesenheit von VP40 kam. Außerdem zeigte sich, dass sich die Menge an freigesetztem VP40 in Anwesenheit von VP24 nicht veränderte. VP24 scheint somit keinen Einfluss auf die Freisetzung des VP40 zu haben. Auch die Freisetzung von GP wurde durch die Anwesenheit des VP24 nicht beeinflusst (Vergleich Spur 3 und 5).
Abbildung 20: Einfluss des VP24 auf die Bildung virusähnlicher Partikel.
HEK293-Zellen wurden entweder einzeln mit pCAGGS-VP24, pCAGGS-VP40 bzw.
pCAGGS-GP transfiziert, oder in Zweier- und Dreierkombination kotransfiziert. Das Verhältnis der eingesetzten DNA VP24:VP40:GP betrug dabei immer 0,5:1:0,2. 48 h p.t.
wurden die Zellen sowie der Zellkulturüberstand geerntet und die viralen Proteine mittels SDS-PAGE und Western Blot sichtbar gemacht. A: Expression von VP24, VP40 und GP in HEK293-Zellen. B: Freisetzung der viralen Proteine VP24, VP40 und GP in den Überstand.
-+ + + -+ -pC-GP
-+ + -+ -+ -pC- VP40
-+ + + -+ pC-VP24
-+ + + -+ -pC-GP
-+ + -+ -+ -pC- VP40
-+ + + -+ pC-VP24
Zelllysat Überstand
GP1
GP2
VP40 VP24
A B
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8
Vergleicht man jeweils die Einzelexpression von VP40 und GP (B, Spuren 2 + 3) mit der Koexpression beider Proteine (Spur 7), so fällt auf, dass die Freisetzung beider Proteine in den Zellkulturüberstand gegenüber der Einzelexpression erhöht war. Beide Proteine schienen sich gegenseitig in der Freisetzung zu unterstützen. Es konnte gezeigt werden, dass das GP bei Koexpression mit VP40 nicht verstärkt als Vesikel freigesetzt wurde, sondern in die filamentösen, von VP40 gebildeten Partikel rekrutiert wurde (Kolesnikova et al., 2004b).
Exprimierte man zusätzlich zu VP40 und GP das zweite Matrixprotein VP24 (B, Spur 6), sah man, dass die Menge an freigesetztem VP24 im Vergleich zur Koexpression von VP24 und VP40 erhöht war. Diese Erhöhung war wahrscheinlich durch die vermehrte Freisetzung von VP40 bedingt, welche wiederum durch die Koexpression mit GP zustande kam. Allerdings war die Menge an freigesetztem GP im Vergleich zur Koexpression von VP40 und GP in Anwesenheit von VP24 leicht verringert. VP24 scheint somit einen Einfluss auf den Einbau des GP in die von VP40 gebildeten virusähnlichen Partikel zu haben.
4.3.5 Einfluss des Late-Domain-Motivs PPPY des MARV-VP40 auf den Einbau von VP24
Viele umhüllte Viren, darunter Vertreter der Familien der Retroviridae, Rhabdoviridae, Arenaviridae und der Filoviridae kodieren in den viralen Strukturproteinen für sogenannte Late-Domain-Motive. Diese kurzen Peptidmotive sind für den letzten Schritt der Virusfreisetzung notwendig, wenn die Hüllmembran des Virus sich von der Plasmamembran abschnürt. Für das Ebolavirus konnte bereits gezeigt werden, dass die sich überlappenden Late-Domain-Motive PTAPPEY (bestehend aus PTAP und PPEY) des VP40 eine zentrale Rolle in der Freisetzung von virusähnlichen Partikeln aus VP40-transfizierten Zellen spielen (Licata et al., 2003; Martin-Serrano et al., 2004).
Das VP40 des MARV besitzt im N-terminalen Bereich ebenfalls ein klassisches Late-Domain-Motiv PPPY (EMBL Nucleotide Sequence Database, accession number Z12132; Nukleotide 4612 – 4623). Die Funktionalität eines solchen Motivs kann bereits durch die Mutation des Tyrosin-Restes (Y) stark beeinträchtigt werden, wie es bereits bei anderen viralen Matrixproteinen gezeigt wurde (Strecker et al., 2003; Jayakar et al., 2000). Ein nicht mehr funktionelles Late-Domain-Motiv resultierte hier in der verminderten oder vollständig gehemmten Freisetzung von virusähnlichen Partikeln.
Für MARV ist die Rolle des PPPY-Motivs des VP40 bei der Abschnürung viraler Partikel bzw. VLPs bisher unbekannt, ebenso dessen Einfluss auf die Freisetzung des VP24 in die VLPs. Daher wurde durch in vitro Mutagenese (3.1.3.5) der Tyrosin-Rest gegen ein Alanin ausgetauscht und die so entstandene VP40-PPPA-Mutante im
Vergleich zum WT-VP40 auf ihre Fähigkeit hin untersucht, VLPs zu bilden sowie VP24 in die VLPs zu rekrutieren.
pCAGGS-VP40 oder pCAGGS-VP40-PPPA wurden in HEK293-Zellen transfiziert (3.2.2) und 48 Stunden p.t. wurde der Zellkulturüberstand geerntet, einem Proteinase K-Verdau unterzogen und mithilfe von SDS-PAGE und Western Blot auf die Anwesenheit von VLPs überprüft (3.3.1.4). Zusätzlich wurden Zellen sowohl mit den beiden VP40-Proteinen sowie dem VP24 im Verhältnis 1:0,5 kotransfiziert, um den Einfluss des Late-Domain-Motivs auf die Ausschleusung von VP24 zu untersuchen.
Abbildung 21 zeigt, dass im Fall des MARV-VP40 eine Mutation des Late-Domain-Motivs PPPY zu PPPA nicht zu einer verminderten Freisetzung des Proteins in den Zellkulturüberstand führte (Abbildung 21, A + B) und dass die VP40-Mutante ebenso wie das WT-Protein in membranumhüllter Form vorlag (A + B, Spuren 1 bis 3). Des Weiteren lässt die Koexpression von VP24 erkennen, dass VP24 unabhängig von dem PPPY-Motiv in die virusähnlichen Partikel rekrutiert wird (Abbildung 21, C + D).
+
-TX100
+ + +
P.K
Zelllysat
Überstand
+
-+ + +
P.K
Zelllysat
Überstand
TX100
+
-TX100
+ + +
P.K
Zelllysat
Überstand
+
-TX100
+ + +
P.K
Zelllysat
Überstand
VP24 VP24
VP40-PPPA VP40-PPPA
VP40 VP40
A B
C D
1 2 3 4 1 2 3 4
1 2 3 4 1 2 3 4
+
-TX100
+ + +
P.K
Zelllysat
Überstand
+
-+ + +
P.K
Zelllysat
Überstand
TX100
+
-TX100
+ + +
P.K
Zelllysat
Überstand
+
-TX100
+ + +
P.K
Zelllysat
Überstand
VP24 VP24
VP40-PPPA VP40-PPPA
VP40 VP40
A B
C D
1 2 3 4 1 2 3 4
1 2 3 4 1 2 3 4
Abbildung 21: Mutation des Late-Domain-Motivs PPPY des VP40 und sein Einfluss auf die Freisetzung der VLPs sowie die Rekrutierung von VP24.
HEK293-Zellen wurden entweder mit je 1 µg pCAGGS-VP40 bzw. pCAGGS-VP40-PPPA transfiziert (A + B), oder zusätzlich mit 0,5 µg pCAGGS-VP24 (C + D). 48 h p.t. wurden die Zellen sowie der Zellkulturüberstand geerntet, und die VLPs mittels Zentrifugation über ein Saccharose-Kissen aufgereinigt und einer Proteinase K-Behandlung unterzogen (3.3.5). Die viralen Proteine wurden mittels SDS-PAGE und Western Blot sichtbar gemacht. A:
Freisetzung und Expression von VP40. B: Freisetzung und Expression von VP40-PPPA. C:
Freisetzung von VP24 durch VP40. D: Freisetzung von VP24 durch VP40-PPPA.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Late-Domain-Motiv PPPY des MARV-VP40 nicht ausschlaggebend für die Freisetzung von virusähnlichen Partikeln von der Zelloberfläche sowie die Rekrutierung von VP24 ist, sondern dass VP40 andere Sequenzen enthalten muss, welche für die Abschnürung und Freisetzung der Partikel eine Rolle spielen.
4.3.6 Einbau von NP in die VLPs
Zur Bildung reifer, infektiöser Virionen muss das im Zytoplasma reifende Nukleokapsid mit einer Hüllmembran umschlossen werden, in welche die viralen Oberflächenproteine inseriert sind. Die Matrixproteine gelten hierbei als Mediatoren der Interaktion zwischen den RNP-Komplexen und der Plasmamembran mit den eingelagerten Hüllproteinen.
Es ist bekannt, dass das Nukleoprotein NP des MARV auch in Abwesenheit anderer viraler Proteine durch singuläre Expression in der Lage ist, nukleokapsidähnliche Strukturen und sog. Einschlusskörper zu bilden, die in ihrer Ultrastruktur denen in der Virusinfektion sehr ähneln (Kolesnikova et al., 2000). Durch die Koexpression von NP zusammen mit VP40 und/oder VP24 sollte überprüft werden, ob NP in die von VP40 gebildeten virusähnlichen Partikel rekrutiert werden kann.
Dazu wurde 1 µg NP entweder alleine oder in Kombination mit pCAGGS-VP24 und/oder pCAGGS-VP40 transfiziert. Der Zellkulturüberstand wurde 48 Stunden p.t. geerntet, einem Proteinase K-Verdau unterzogen und mittels SDS-PAGE und Western Blot analysiert. Abbildung 22 zeigt die Freisetzung von NP in den Überstand.
T X100 P.K
-+ +
- +
Überstand
T X100 P.K
-+ +
- +
Überstand
T X100 P.K
-+ +
- +
Überstand P.K
-+ +
- +
Überstand
T X100 P.K
-+ +
- +
Überstand
T X100 P.K
-+ +
- +
Überstand
T X100 P.K
-+ +
- +
Überstand
NP
VP40 VP24
A B C D
1 2 3 4
Zelllysat
Zelllysat
Zelllysat
Zelllysat
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 NP
VP40 VP24 NP
VP40 VP24
Abbildung 22: Einbau von NP in VLPs.
HEK293-Zellen wurden mit pCAGGS-NP alleine oder in Kombination mit pCAGGS-VP24 und/oder pCAGGS-VP40 transfiziert. 48 h p.t. wurden die Zellen sowie der Zellkultur-überstand geerntet, einem Proteinase K-Verdau unterzogen und die viralen Proteine mittels SDS-PAGE und Western Blot sichtbar gemacht. A: Expression von NP. B: Expression von NP und VP24. C: Expression von NP und VP40. D: Expression von NP, VP24 und VP40.
Die solitäre Expression von NP (Abbildung 22 A) führte nicht zu dessen Freisetzung in den Überstand, ebenso wenig die Koexpression mit VP24 (22 B). Koexprimierte man jedoch NP zusammen mit VP40, so war NP im Zellkulturüberstand detektierbar (22 C) und dessen Freisetzung wurde durch die Anwesenheit von VP24 (22 D) noch einmal signifikant verstärkt. Allerdings ließ sich durch den Proteinase K-Verdau zeigen, dass die Freisetzung des NP nicht in einer membrangeschützten Form als VLP stattfand, da NP auch in Abwesenheit eines Detergenz Proteinase K-sensitiv war (Spuren 1 + 2).
Untersuchungen der VLPs mithilfe des Elektronenmikroskopes ergaben, dass die Expression von VP40 zur Bildung der erwarteten filamentösen VLPs führte, in welche VP24 bei Koexpression eingebaut wurde. Das freigesetzte NP trat zwar in Assoziation mit den VLPs auf, war jedoch außen und nicht, wie erwartet, innen an den VLPs zu finden (Daten nicht gezeigt). Somit scheint die singuläre Expression von NP nicht auszureichen, um Nukleokapsid-ähnliche Strukturen zu erzeugen, welche dann in die von VP40 gebildeten VLPs eingebaut werden können.