Zellbiologische Methoden

3.2.1 Kultivierung von HeLa-, HEK293- und Vero-Zellen

Diese permanenten Zelllinien wurden in 162 cm² Zellkulturflaschen in Dulbecco’s Modified Eagle‘s Medium (DMEM) in Gegenwart von 10 % FCS, L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin kultiviert. Bei 37 °C und unter 5 % CO₂-Begasung bildeten die Zellen nach 3 bis 4 Tagen einen geschlossenen Zellrasen. Die Zellen wurden unter einer Sicherheitswerkbank passagiert. Dazu wurden DMEM(+++), PBS_def und Trypsin/EDTA auf 37 °C erwärmt. Altes Medium wurde entfernt und der Zellrasen nach zweimaligem Waschen mit PBS_def durch Zugabe von 2 ml Trypsin/EDTA abgelöst.

Dieser Vorgang dauert bei den verschiedenen Zelllinien unterschiedlich lange.

Während sich HEK293-Zellen bereits nach wenigen Sekunden ablösen, dauert dies bei Vero-Zellen mitunter bis zu 20 Minuten. Daher müssen die Zellen während dieser Behandlung ständig mikroskopisch kontrolliert werden. Hatten sich alle Zellen gelöst, wurde die Reaktion mit 8 ml Wachstumsmedium gestoppt, die Zellen durch Pipettieren resuspendiert und in der gewünschten Menge in neue Zellkulturflaschen bzw. -platten mit DMEM(+++) überführt.

3.2.2 Transfektion von HEK293-Zellen mit Lipofectamine Plus^TM

Um DNA in Zellen einzubringen, wird deren negative Ladung durch Komplexbildung mit kationischen Lipiden maskiert. In dieser Form können die DNA-Lipidkomplexe sich an die Zellmembran anlagern und diese passieren. Die HEK293-Zellen wurden einen Tag vor Transfektion so umgesetzt, dass sie zum Transfektionszeitpunkt eine Dichte von 50 bis 70 % aufwiesen. Die Transfektionsansätze wurden entsprechend den Empfehlungen des Herstellers angesetzt.

pro well einer 6 well-Platte

pro well einer 12 well-Platte

5 cm-Schale

Ansatz I 4 µl Lipofectamine^TM 100 µl DMEM(+Q)

2 µl Lipofectamine^TM 50 µl DMEM(+Q)

9,1 µl Lipofectamine^TM 230 µl DMEM(+Q) Ansatz II 1 - 10 µg DNA

100 µl DMEM(+Q) 6 - 10 µl Plus-Reagent^TM

0,5 - 5 µg DNA + 50 µl DMEM(+Q) 5 µl Plus-Reagent^TM

2,3 µg DNA 230 µl DMEM(+Q) 13,7 µl Plus-Reagent^TM

Die Ansätze I und II wurden getrennt jeweils für 15 Minuten bei RT inkubiert, miteinander vereinigt, durch Schütteln per Hand gründlich gemischt und für weitere 15 Minuten bei RT inkubiert. Währenddessen wurde das FCS-haltige Medium von den zu transfizierenden Zellen abgenommen. Da sich HEK293-Zellen sehr leicht vom Boden ablösen, wurden diese Zellen nicht mit DMEM(+Q) gewaschen. Anschließend wurden auf ein well einer 6 well-Platte 800 µl, auf ein well einer 12-well-Platte 450 µl DMEM(+Q) bzw 1,85 ml auf einer 5 cm-Schale vorgelegt. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Gemische des Transfektionsansatzes zugesetzt. Nach einer Inkubationszeit von drei Stunden bei 37 °C im Brutschrank wurde das Transfektionsmedium vollständig abgenommen und durch 2 ml (6 well), 1 ml (12 well) bzw. 5 ml (5 cm-Schale) DMEM(+++) ersetzt.

3.2.3 Zellernte für Flotationsanalysen und Triton X-114 Phasen-partitionierung

HEK293-Zellen wurden für die Durchführung von Flotationsanalysen sowie Triton X-114 Phasenpartitionierungen 24 Stunden nach Transfektion geerntet. Die Zellernte erfolgte auf Eis, Zentrifugen und Puffer wurden auf 4 °C gekühlt. Für die Flotationsanalysen wurden pro Ansatz 3 wells einer 6 well-Platte bearbeitet, für die Phasenpartitionierung eine 5 cm-Schale.

Da HEK293-Zellen nur schwach am Boden der Zellkulturschalen haften, wurden sie zunächst mithilfe einer Pipette im Medium vom Boden abgespült, in ein 15 ml Reaktionsröhrchen überführt und die Zellen durch Zentrifugation bei 1500 UpM und 4 °C in einer Heraeus-Zentrifuge pelletiert. Anschließend erfolgte das Waschen der Zellen jeweils einmal mit 5 ml PBS_def und 5 ml Lysispuffer für Flotationen bzw. Triton X-114 Lysispuffer mithilfe von Zentrifugation. Das Zellpellet wurde mit 300 µl Lysispuffer für Flotationen versetzt und die Zellen mittels 10fachem Passagieren durch eine 22G-Kanüle aufgeschlossen und homogenisiert. Die Zellkerne konnten durch fünfminütige Zentrifugation bei 830 x g pelletiert werden und der postnukleäre Überstand wurde im Weiteren für die Flotationsanalysen (3.3.6.1) bzw. die Phasenpartitionierung (3.3.6.3) eingesetzt.

3.2.4 Ernte und Aufreinigung von Zellkulturüberstand zur Analyse freigesetzter Proteine in Form von virusähnlichen Partikeln (VLPs) VLPs wurden durch Zentrifugation des Überstandes über ein Saccharose-Kissen aufgereinigt. Pro Ansatz wurde eine 6 well-Platte mit den entsprechenden Plasmiden wie unter 3.2.2 beschrieben, transfiziert und der Überstand sowie die Zellen 48 Stunden später geerntet.

Hierzu wurde das Medium von einer 6 well-Platte abgenommen, in ein 15 ml Reak-tionsröhrchen überführt und, um Zellen und Zelltrümmer zu entfernen, bei 5000 UpM und 4 °C in einer Heraeus-Zentrifuge zentrifugiert.

In UltraClear^TM-Zentrifugenröhrchen für SW41-Rotoren wurden 2 ml 20 %ige Saccharoselösung vorgelegt und vorsichtig mit dem zuvor zentrifugierten Zellkulturüberstand überschichtet. Es folgte ein Ultrazentrifugations-Schritt für drei Stunden bei 35.000 UpM und 4 °C in einem SW41 Rotor. Der Überstand wurde dekantiert, die Röhrchen vorsichtig trocken gewischt, ohne den Boden zu berühren, und das Pellet in 65 µl PBS_def resuspendiert. Anschließend wurde ein Proteinase K-Verdau durchgeführt (3.3.5).

Die Zellen wurden in PBSdef abgespült, in ein 15 ml Reaktionsröhrchen überführt und durch Zentrifugation bei 1500 UpM und 4°C pelletiert. Das Pellet wurde in 800 µl PBSdef resuspendiert und mit 400 µl 4x Proteinprobenpuffer versetzt.

3.2.5 Transfektion von Vero-Zellen mit Lipofectamine^TM 2000

Das Funktionsprinzip des Transfektionsreagents Lipofectamine^TM 2000 ist ähnlich dem von Lipofectamine Plus^TM (3.2.2), jedoch hat sich gezeigt, dass sich dieses Reagenz besser zur Transfektion von chemisch synthetisierten siRNAs in Vero-Zellen eignet.

Die Zellen wurden 1 Tag vor Transfektion so umgesetzt, dass sie zum Transfektionszeitpunkt eine Dichte von 50 bis 70 % aufwiesen. Sollte eine Immun-fluoreszenzanalyse durchgeführt werden, wurden die Zellen auf Deckgläschen ausgesät. Die Transfektionsansätze wurden entsprechend der Empfehlungen des Herstellers angesetzt.

pro well einer 6 well-Platte pro well einer 24 well-Platte Ansatz I 10 µl Lipofectamin^TM 2000

250 µl Opti-MEM I

2 µl Lipofectamin^TM 2000 50 µl Opti-MEM I

Ansatz II x µg DNA

100 µl Opti-MEM I

x µg DNA x ng siRNA 50 µl Opti-MEM I

Die Ansätze I und II wurden getrennt jeweils für fünf Minuten bei RT inkubiert, miteinander vereinigt, durch Schütteln per Hand gründlich gemischt und für weitere 30 Minuten bei RT inkubiert. Die Zellen wurden unterdessen 2x mit DMEM(+Q) gewaschen. In den Zellkulturschalen wurden 2 ml (6 well) bzw. 0,5 ml (24 well) DMEM(+Q) vorgelegt und nach Ablauf der Inkubationszeit mit den entsprechenden Transfektionsgemischen versetzt. Nach einer vierstündigen Inkubationszeit bei 37 °C im Brutschrank wurde das Transfektionsmedium abgenommen und durch 2 ml (6 well) bzw. 0,5 ml (24 well) DMEM(+++) ersetzt. Die Zellernte erfolgte bei Immunfluoreszenz-analysenen 24 Stunden nach Transfektion (p.t.), bei siRNA-Untersuchungen 48 Stunden p.t..

3.2.6 Transfektion von siRNAs in MARV-infizierte Vero-Zellen

Die Vero-Zellen wurden einen Tag vor der ersten Transfektion in 6 well-Platten umgesetzt, sodass sie zum Transfektionszeitpunkt eine Dichte von 50 bis 70 % aufwiesen.

ein well einer 6 well-Platte Ansatz I 10 µl Lipofectamine^TM 2000

250 µl Opti-MEM I

Ansatz II 1543 ng siRNA (= 44 nM) 250 µl Opti-MEM I

Die Transfektionsbedingungen entsprachen denen, die unter 3.2.5. beschrieben wurden. Vier Stunden nach der ersten Transfektion wurde das Medium nach zweimaligem Waschen durch 2 ml DMEM(+Q) mit 2,5 % FCS ersetzt und für weitere vier Stunden inkubiert. Acht Stunden nach der ersten Transfektion fand die Infektion der Vero-Zellen mit Marburgvirus (Stamm Musoke) mit einer m.o.i von ungefähr 1 p.f.u.

im Sicherheitslabor des Instituts für Virologie in Marburg statt. Die Inkubationszeit der Viren auf den Zellen betrug eine Stunde. Durch zweimaliges Waschen wurden nicht gebundene Viruspartikel entfernt und im direkten Anschluss fand eine zweite siRNA-Transfektion, wie zuvor beschrieben, statt. Vier Stunden nach dieser zweiten Trans-fektion wurden die Zellen nach zweimaligem Waschen mit DMEM(+++) für weitere 20 Stunden mit 2 ml DMEM(+++) bei 37 °C inkubiert. Die Ernte der Zellen und Zellkulturüberstände fand 24 Stunden nach der Virusinfektion statt.

3.2.7 Ernte von Vero-Zellen sowie Zellkulturüberständen nach siRNA-Behandlung

Die Zellernte erfolgte auf Eis, Zentrifugen und Puffer wurden auf 4 °C gekühlt.

1,2 ml des Überstandes der MARV-infizierten Zellkulturplatten wurden abgenommen, in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und Zellen sowie Zelltrümmer durch zwei-minütige Zentrifugation bei 10.000 UpM entfernt. Der Überstand wurde für die Isolierung viraler RNA mit AVL-Puffer (3.1.5.1) bzw. für Western Blot Analysen mit 4x Proteinprobenpuffer versetzt.

Der Zellrasen wurden 1x mit PBS_def gewaschen und dann durch Zugabe von 500 µl Trypsin / EDTA vom Boden der Zellkulturplatten abgelöst. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 700 µl DMEM(+++) gestoppt, die Zellen gründlich abgespült und in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt. Die Pelletierung der Zellen erfolgte durch eine fünf-minütige Zentrifugation bei 1500 UpM in einer Eppendorf-Kühlzentrifuge. Nach dem Waschen des Pellets mit 1 ml PBS_def wurden die Zellen in 100 bis 200 µl siRNA-Lysispuffer resuspendiert, mit 4x Proteinprobenpuffer versetzt und für 10 Minuten bei 95 °C erhitzt. Die Proben wurden mittels Western Blot (3.3.1.4) analysiert.

3.2.8 Das Vaccinia-Virus-Expressionssystem

Mit diesem System ist es möglich, Fremdgene in Zellen rekombinant zu exprimieren.

Die Zellen werden mit dem rekombinanten, modifizierten Vaccinia-Virus Ankara T7 (MVA-T7) infiziert (Sutter et al., 1995). Infizierte Zellen exprimieren dann die viruskodierte DNA-abhängige-RNA-Polymerase des Phagen T7. Anschließend werden die Zellen mit Plasmiden transfiziert, welche die zu exprimierenden Fremdgene unter Kontrolle eines T7-Promotors enthalten. Durch die T7-RNA-Polymerase wird das Fremdgen transkribiert und es kommt zu dessen Expression durch die zelluläre Translationsmaschinerie.

3.2.8.1 Infektion und Transfektion von HeLa-Zellen

Zur Durchführung von Immunfluoreszenzanalysen wurden HeLa-Zellen auf runden Deckgläsern (12 mm) in 6 well-Zellkulturplatten angezüchtet. Bei einer Konfluenz von 40 bis 60 % wurden die Zellen einmal mit vorgewärmtem DMEM(+Q) gewaschen. Die Infektion erfolgte in einem Gesamtvolumen von 500 µl pro well, wobei 100 µl MVA-T7 mit der entsprechenden Menge DMEM(+Q) versetzt wurde. Dies entspricht ungefähr einer Infektionsdosis von drei infektiösen Einheiten / Zelle. Anschließend fand eine ein-stündige Inkubation bei 37 °C im Brutschrank auf einem Kippschüttler statt.

Für die DNA-Transfektion wurde Lipofectin^®-Reagent verwendet, welches mit der DNA spontan Lipid-DNA-Komplexe bildet. Für die Transfektion wurden zwei Ansätze (I und II) in Polystyrolröhrchen vorbereitet:

I: 5 µl Lipofectin^® Reagent II: 1 – 2 µg DNA

1 ml DMEM(+Q) 1 ml DMEM(+Q)

Nach einer 20-minütigen Inkubation der Ansätze I und II bei RT wurden diese vereinigt, durch Vortexen gemischt und nochmals für 15 Minuten bei RT inkubiert. Das Transfektionsvolumen für ein well einer 6 well-Platte betrug somit 2 ml. Vor Zugabe des Transfektionsansatzes wurden die infizierten HeLa-Zellen einmal mit DMEM(+Q) gewaschen. Die Transfektion erfolgte für 8 bis 14 Stunden bei 37 °C in einem Brutschrank. Im Anschluss wurden die exprimierten Fremdgene durch Immunfluoreszenzanalysen sichtbar gemacht.

3.2.8.2 Fixierung von Zellen durch Paraformaldehyd und Permeabilisierung mittels Triton X-100

Die Zellen wurden zunächst zweimal mit PBS_def gewaschen und anschließend mit 3 % Paraformaldehyd in PBS_def für 15 Minuten bei RT fixiert. Nach der Fixierung folgte

zweimaliges Waschen mit PBSdef und eine Inkubation der Zellen mit 0,1 M Glycin für 10 Minuten bei RT. Nach zwei weiteren Waschschritten mit PBS_def erfolgte die Permeabilisierung der Zellen mit 0,1 % Triton X-100 in PBSdef für 10 Minuten bei RT.

Die Zellen wurden erneut gewaschen und für mindestens 10 Minuten mit Blockierungspuffer überschichtet. Im Anschluss erfolgte die Immunfluoreszenzanalyse (3.3.2).