3 Methoden
3.1 Molekularbiologische Methoden
3.1.3 Klonierung und Mutagenese von DNA
3.1.3.1 Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen
Restriktionsendonukleasen sind Enzyme bakteriellen Ursprungs, welche die Phosphordiesterbindungen beider Stränge eines DNA-Moleküls an spezifschen Erkennungssequenzen hydrolytisch spalten. Man kann sie präparativ zum Herausschneiden eines Inserts aus einem Vektor oder zur Analyse von DNA verwenden, wobei zwei DNA-Moleküle, die sich in Anzahl oder Position der Erkennungsstellen unterscheiden, nach einem analytischen Restriktionsverdau und Gelelektrophorese im Gel verschiedene Bandenmuster erzeugen.
Beim Verdau mittels Restriktionsendonukleasen muss darauf geachtet werden, dass die Reaktionsbedingungen dem jeweiligen Restriktionsenzym optimal angepasst werden. Temperatur, Pufferzusammensetzung und Zusatz von BSA richten sich nach den Angaben des Herstellers. Bei einem Doppelverdau durch zwei Restriktionsenzyme kann dies gleichzeitig in einem Ansatz geschehen, sofern die Enzyme die gleichen
Reaktionsbedingungen benötigen. Ansonsten muss die DNA nach dem ersten Verdau mittels QIAquick™ PCR Purification Kit gereinigt werden (3.1.1.1), bevor sie mit dem zweiten Enzym verdaut werden kann.
Der Restriktionsverdau wurde für einen möglichst vollständigen Verdau je nach Enzym 2 bis 16 Stunden inkubiert.
Ansatz für analytischen Verdau: 0,2 - 1 µg DNA
1 µl 10x Puffer nach Herstellerangaben (1 µl 10 % BSA, falls notwendig)
1 - 5 U Restriktionsendonuklease A (0,5 – 2,5 U bei Doppelverdau)
(0,5 – 2,5 U Restriktionsendonuklease B bei Doppelverdau)
ad 10 µl (ad 20 µl
dH2O
dH2O, wenn mit 2 Enzymen verdaut wurde)
Anschließend wurde der Verdau mit einem analytischen Agarosegel (3.1.2.1.2) überprüft.
Ansatz für präparativen Verdau: 2 - 10 µg DNA 10 µl 10x Puffer
(10 µl 10 % BSA, falls notwendig)
10 - 30 U Restriktionsendonuklease A (5 - 15 U bei Doppelverdau)
(5 - 15 U Restriktionsendonuklease B bei Doppelverdau)
ad 100 µl dH2O
Wenn die DNA in weiteren Reaktionen verwendet werden soll, muss sie nach dem Verdau entweder mithilfe des PCR-Purification-Kit (3.1.1.1) oder über ein präparatives Gel (3.1.2.1.1) mit anschließender Gelextraktion (3.1.1.2) aufgereinigt werden.
3.1.3.2 Dephosphorylierung linearisierter DNA
Um die Religation linearisierter Vektoren zu verhindern, werden die 5’-Phosphatgruppen der verdauten Plasmide durch die Behandlung mit alkalischer Phosphatase (calf intestinal phosphatase, CIP) entfernt. Dazu wurde nach dem Restriktionsverdau 1 µl CIP in den Ansatz gegeben und eine Stunde bei 37°C inkubiert. Da die alkalische Phosphatase in den meisten Restriktionspuffern aktiv ist, ist
eine vorherige Reinigung im Allgemeinen nicht notwenig. Die Inaktivierung der CIP erfolgte durch Zugabe von 0,5 µl einer 0,5 M EDTA-Lösung (pH 8,0) für 10 min bei 72 °C. Die DNA wurde anschließend mit dem QIAquick PCR Purification Kit der Firma Qiagen (Hilden) gereinigt und in 30 µl dH2O aufgenommen (3.1.1.1).
3.1.3.3 Amplifikation spezifischer DNA-Sequenzen mittels Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
Mittels PCR können spezifische DNA-Abschnitte vermehrt werden. Für jede Reaktion benötigt man zwei verschiedene Primer, die an jeweils einen DNA-Strang binden. Der Vorwärts-Primer enthält die ersten 15 bis 25 Nukleotide der zu amplifizierenden Sequenz, der Rückwärts-Primer die letzten 15 bis 25 Nukleotide des komplementären Stranges. Je nach Klonierungsstrategie können Primer im 5’-Bereich zusätzliche Sequenzen, z.B. Schnittstellen für Restriktionsenzyme, enthalten (Abbildung 5).
Im ersten Schritt des Reaktionszyklus (Denaturierung) wird die DNA-Matrize durch Erhitzen in ihre Einzelstränge zerlegt. Im zweiten Schritt (Annealing) erniedrigt man die Temperatur entsprechend der Basenzusammensetzung und Länge der Primer, damit diese an die komplementären Sequenzabschnitte der einzelsträngigen DNA-Matrize binden können. Anschließend erfolgt die Synthese des Doppelstranges ausgehend vom 3’-Ende des jeweiligen Primers. Die dafür verwendete hitzestabile PWO DNA-Polymerase ist durch eine hohe Lesegenauigkeit und Korrekturlesefunktion (3’-5’-Exonukleaseaktivität) ausgezeichnet. Der Reaktionszyklus wird mehrfach wiederholt, wobei die zu amplifizierende DNA im Reaktionsgemisch exponentiell angereichert wird.
Abbildung 5: Prinzip einer PCR.
Der vergrößerte DNA-Abschnitt soll amplifiziert werden. Gleiche Linien stehen für gleiche Sequenzen, gestrichelte und gepunktete Bereiche, sofern sie einander gegenüberliegen, sind komplementär. Die Synthese erfolgt in 5’-3’-Richtung.
dsDNA
Rückwärts-Primer
5’
3’
5’ 3’
3’
5’
3’
5’
Vorwärts-Primer
Reaktionsansatz: 10 ng DNA 30 µM Vorwärts-Primer 30 µM Rückwärts-Primer
je 1,5 µl 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP
10 µl 10× Puffer für PWO DNA-Polymerase (komplett) ad 99,5 µl dH2O
0,5 µl PWO DNA-Polymerase
Programm: Zyklen Temperatur Zeit
Denaturierung 1 95 °C 5 min
Denaturierung 35 95 °C 1 min
Annealing 50 – 60 °C 1 min
Synthese 72 °C 2 min + 5 sec pro
Zyklus
Nach Durchlaufen der Zyklen wurden 5 µl des Reaktionsansatzes auf einem analytischen Agarosegel (3.1.2.1.2) überprüft. Anschließend wurde das entstandene DNA-Fragment mittels eines präparativen Agarosegels (3.1.2.1.1) aufgetrennt und durch Gelextraktion (3.1.1.2) gereinigt.
3.1.3.4 Ligation von DNA-Fragmenten in linearisierte Vektoren
Bei der Ligation von DNA-Fragmenten in einen zuvor mit geeigneten Restriktionsendonukleasen geschnittenen Vektor katalysiert die DNA-Ligase die Bildung von Phosphodiesterbrücken zwischen freien 5’-Phosphatgruppen eines DNA-Stranges mit den freien 3’-OH-Gruppen eines zweiten DNA-Stranges.
Insertions- und Vektor-DNA wurden in einem Verhältnis von 7,5:1 eingestetzt.
Ansatz: 20 - 200 ng verdaute, gereinigte Insert-DNA (3.1.3.1, 3.1.1.1) 25 - 50 ng linearisierte, gereinigte Vektor-DNA (3.1.3.1, 3.1.1.1)
1 µl 10x Ligationspuffer mit rATP 0,5 µl T4-DNA-Ligase (4 U / µl) ad 10 µl dH2O
Zur Abschätzung des Verhältnisses von religierten Plasmiden zu Plasmiden mit Insertionen wurde eine Religationskontrolle mitgeführt, in der das zu klonierende Insert durch dH2O ersetzt wurde. Als Ligationskontrolle diente ein phosphoryliertes linearisiertes Plasmid, das nur mit einem Restriktionsenzym geschnitten wurde.
Der Ansatz wurde eine Stunde bei RT inkubiert und anschließend in Z-kompetente XL1-blue Zellen transformiert (3.1.3.6).
3.1.3.5 Ortsgerichtete Mutagenese von Plasmid-DNA
Mittels in vitro Mutagenese ist es möglich, Punktmutationen, Deletionen und Insertionen in Plasmid-DNA einzubringen. Die Methode beruht auf einer Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) mit speziell entworfenen, zueinander komplementären Primern, welche die gewünschte Mutation enthalten.
Die Plasmid-DNA wurde mit den entsprechenden Primern durch rekombinante PfuTurboTM-DNA-Polymerase amplifiziert, wobei die Amplifikate die durch die Primer eingeführten Mutationen enthalten. Anschließend wurde der PCR-Ansatz drei Stunden bei 37 °C nach Zugabe von 1 µl DpnI inkubiert, ein Restriktionsenzym, welches methylierte DNA vollständig in kleinste Fragmente verdaut. Dadurch wurde die methylierte Ausgangs-DNA abgebaut, während die nicht methylierte, neu synthetisierte DNA intakt blieb. 10 µl des Amplifikationsansatzes wurden direkt in XL1-Blue Zellen transformiert (3.1.3.6). Zur Kontrolle wurden außerdem 5 µl des Reaktionsproduktes mit einem analytischen Agarosegel (3.1.2.1.2) dargestellt.
Ansatz der PCR: 50 ng DNA
125 ng Vorwärts-Primer
125 ng Rückwärts-Primer
je 1 µl 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP
5 µl 10x Puffer für die PfuTurboTM-DNA-Polymerase ad 49 µl dH2O
1 µl PfuTurboTM-DNA-Polymerase (2,5 U / µl)
Programm: Zyklen Temperatur Zeit
Denaturierung 1 95 °C 30 sec
Denaturierung 16 95 °C 30 sec
Annealing 55 °C 1 min
Synthese 68 °C 2 min / kb
Plasmidlänge
Ende der Synthese 1 4 °C ∞
3.1.3.6 Transformation von Bakterien mit Plasmid-DNA
Rekombinante Plasmide werden in vivo durch Replikation und Teilung transformierter Bakterienzellen vermehrt. Um DNA in Bakterienzellen zu transformieren, ist es notwendig, die Bakterien der Wahl kompetent, sie also aufnahmefähig für DNA zu machen.
Mit dem Z-Competent E. coli Transformation KitTM and Buffer Set wurden E. coli-Zellen laut beiliegendem Protokoll behandelt, aliquotiert und bei –80 °C gelagert.
Vor einer Transformation wurden die Z-kompetenten E. coli-Zellen zügig in der Hand aufgetaut. Nach der Zugabe von 100 µl Zellsuspension zur DNA-Lösung (z.B. 10 µl Ligationsansatz) erfolgte eine Inkubation der Zellen für eine Stunde auf Eis. Schließlich wurde der komplette Ansatz auf LB-Agarplatten mit Ampicillin (100 µg / ml) ausge-strichen und über Nacht (ÜN) bei 37 °C inkubiert. Die transformierten Bakterien verfügen durch die aufgenommenen Plasmide über ein Ampicillin-Resistenzgen und können deshalb auf den ampicillinhaltigen Agarplatten wachsen.