4 Ergebnisse
4.1 Immunfluoreszenzanalyse zur intrazellulären Lokalisation von VP24
4.1.1 Klonierung Epitop-markierter VP24-Mutanten
Ein Antikörper zur immunologischen Detektion von VP24 in Western Blot- und Immunfluoreszenzanalysen war zu Beginn dieser Arbeit nicht vorhanden. Durch die Herstellung verschiedener Epitop-markierter Mutanten sollte VP24 mithilfe von käuflichen Antikörpern detektiert werden.
VP24 wurde jeweils N- bzw. C-terminal mit einem Flag-, einem HA- oder einem myc-Epitop versehen (Abbildung 6).
VP24 Flag
VP24 HA
VP24 myc
VP24 Flag
VP24 HA
VP24 myc
Sequenzen der Epitope:
Flag-tag: N‘-DYKDDDK-C‘ HA-tag: N‘-YPYDVPDYA-C‘ myc-Tag: N‘-EQKLISEEDL-C‘
*
Flag-VP24 HA-VP24 myc-VP24
VP24-Flag VP24-HA VP24-myc
Abbildung 6: Schematische Darstellung der Epitop-markierten MARV-VP24-Mutanten.
VP24 wurde zur immunologischen Detektion jeweils N- bzw. C-terminal mit einem Flag-, HA-oder myc-Epitop versehen. Die *-markierte Mutante VP24-Flag existierte bereits (Bamberg, 2000). Die Aminosäuresequenzen der verschiedenen Epitope sind im unteren Teil der Abbildung vermerkt.
Die Grundlage für die Klonierung war das bereits vorhandene Plasmid pTM1-VP24, welches die Sequenz des VP24 unter Kontrolle eines T7-Promotors enthält (Bamberg, 2000). Die eingesetzten Primer wurden so synthetisiert, dass sie neben der VP24-spezifischen Sequenz außerdem die kodierende Sequenz des einzufügenden Epitops enthielten sowie eine BamHI-Schnittstelle für die Klonierung. Abbildung 7 zeigt den schematischen Verlauf der Klonierung.
Die Sequenz der Plasmide wurde durch Sequenzierung (3.1.2.3) verifiziert.
Abbildung 7: Klonierung der Epitop-markierten MARV-VP24-Mutanten.
Durch die PCR-Amplifikation wurde VP24 entweder N- oder C-terminal mit den kodierenden Sequenzen des Flag-, HA- bzw. myc-Epitops versehen. Die PCR-Fragmente sowie der Zielvektor pTM1 wurden mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut. Nach Behandlung der Vektor-DNA mit alkalischer Phosphatase (CIP) wurden die aufbereiteten PCR-Fragmente mit diesem ligiert.
PCR
pTM1 BamHI BamHI
pTM1 BamHI BamHI
BamHI Tag-VP24
Tag-VP24 BamHI
Tag-VP24
pTM1 pTM1
pTM1-tag-VP24 Tag-VP24 Tag-VP24 Tag-VP24 Ligation BamHI
BamHI Vorwärtsprimer
#1107, 1108, 1109, 125
5' 3' Rückwärtsprimer
#174, 1110, 1111 VP24
3' 5'
pTM1-VP24
Konstrukte:
pTM1-Flag-VP24 pTM1-HA-VP24 pTM1-myc-VP24 pTM1-VP24-HA pTM1-VP24-myc
Verdau mit BamHI
CIP-Behandlung Verdau mit BamHI
4.1.2 Immunfluoreszenzanalysen der Epitop-markierten VP24-Mutanten Die unter 4.1.1 erstellten VP24-Mutanten sowie pTM1-VP24-Flag wurden im Folgenden auf ihre intrazelluläre Verteilung hin untersucht. Zu diesem Zweck wurden subkonfluente HeLa-Zellen mit dem Vaccinia-Virus MVA-T7 infiziert und eine Stunde nach Infektion jeweils mit 1 µg der entsprechenden Plasmid-DNA (pTM1-Flag-VP24, pTM1-HA-VP24, pTM1-myc-VP24, Flag, HA, pTM1-VP24-myc) transfiziert (3.2.8.1). Die Zellen wurden 12 Stunden nach der Infektion fixiert, permeabilisiert und mit den entsprechenden Antikörpern gefärbt (3.2.8.2, 3.3.2). Die Mutanten wurden mit monoklonalen AK gegen das Flag-Epitop, das HA-Epitop oder mittels eines polyklonalen α myc Kaninchen-AK markiert. Durch Inkubation mit Rhodamin-gekoppelten α Maus- bzw. α Kaninchen-AK wurden die Proteine im Fluoreszenzmikroskop detektierbar. Während der Inkubation mit dem Zweitantikörper wurde der Zellkern zusätzlich durch eine DAPI-Färbung markiert.
Die Immunfluoreszenzanalysen der exprimierten VP24-Mutanten sind in Abbildung 8 dargestellt.
Mock WT VP24-Mutanten
Flag- VP24 VP24-Flag
HA- VP24 VP24-HA
myc- VP24 VP24-myc
A
B
C
WT
WT
WT Mock
Mock
Mock αFlag
αHA
αmyc
1 2 3 4
Vergleicht man die intrazelluläre Verteilung der VP24-Mutanten, so fällt auf, dass die verschiedenen Epitope die zelluläre Lokalisation des VP24 unterschiedlich beeinflussen. So zeigte die Expression des Flag-markierten VP24 (Abbildung 8, A3 und A4) eine eher netzartige, zytoplasmatische Verteilung, während das HA-markierte VP24 eher zu punktförmigen Aggregaten im zellkernnahen Bereich neigte und weniger strukturiert im Zytoplasma zu finden war (B3 und B4). Die Verteilung des myc-markierten VP24 (C3 und C4) ähnelte wiederum eher der der Flag-myc-markierten- Flag-markierten-Mutanten, wobei es hier bei VP24-myc ebenfalls zur Ausbildung kleinerer Aggregate kam, ähnlich denen der HA-markierten Mutanten. Nicht nur der Einsatz verschiedener Epitope beeinflusste die Verteilung des VP24, sondern auch die Lokalisation des Epitops im Protein selbst, d.h. ob es N- oder C-terminal vorlag. Dieser Einfluss wurde vor allem im Unterschied zwischen HA-VP24 und VP24-HA deutlich. HA-VP24 zeigte eine wesentlich stärker aggregierte Verteilung, während VP24-HA sowohl Aggregate als auch eine homogene zytoplasmatische Verteilung aufwies. Unterschiede in der Verteilung zeigten auch myc-VP24 und VP24-myc, wobei die C-terminale Markierung kleine Aggregate aufwies, welche bei N-terminalem myc-Epitop nicht zu beobachten waren. Durch die Verwendung von verschiedenen Epitopen am C- bzw. N-Terminus des VP24 ist es daher schwierig auf die Verteilung des WT-VP24 zu schließen.
4.1.3 Herstellung und Aufreinigung von VP24-spezifischen Antikörpern Um die intrazelluläre Verteilung von WT-VP24 sichtbar zu machen war ein spezifischer AK gegen das VP24 notwendig. Durch Immunisierung eines Kaninchens (3.3.8) mit einem bakteriell exprimierten Fusionsprotein aus Glutathion-S-Transferase (GST) und VP24 (3.3.7) war es möglich, ein MARV-VP24-spezifisches Serum zu erhalten. Dieses zeigte jedoch im Western Blot nur mäßige Ergebnisse aufgrund starker Hintergrundfärbung (Abbildung 9 A) und in der Immunfluoreszenz keine bis schwache VP24-spezifische Signale, ebenfalls mit hoher Hintergrundfärbung der Zellen. Daher war es notwendig, den VP24-spezifischen Antikörper aufzureinigen. Hierzu wurde MARV-VP24-Antigen aus Viruspartikeln mittels SDS-PAGE augetrennt und auf PVDF-Membran geblottet. Durch Färbung mit Ponceaurot wurden die viralen Proteinbanden
Abbildung 8: Immunfluoreszenzanalyse der Epitop-markierten VP24-Mutanten.
Subkonfluente HeLa-Zellen wurden mit MVA-T7 infiziert und mit den Plasmiden Flag-VP24, HA-Flag-VP24, myc-Flag-VP24, VP24-Flag, VP24-HA oder pTM1-VP24-myc transfiziert. 12 h nach Infektion wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und mit Antikörpern gefärbt. A: Expression der Flag-markierten VP24-Mutanten, Färbung mit dem monoklonalen α Flag-AK und Rhodamin-gekoppeltem α Maus-AK. B: Expression der HA-markierten VP24-Mutanten, Färbung mit dem monoklonalen α HA-AK und Rhodamin-gekoppeltem α Maus-AK. C: Expression der myc-markierten VP24-Mutanten, Färbung mit dem polyklonalen α myc-AK und Rhodamin-gekoppeltem α Kaninchen-AK.
sichtbar gemacht und nur die Bande des VP24 ausgeschnitten (3.3.1.4). Mithilfe der so erhaltenen VP24-Blotstreifen konnten die VP24-Antikörper wie unter 3.3.9 beschrieben aufgereinigt werden. Blotstreifen die das Fusionsprotein GST-VP24 trugen konnten hierbei nicht verwendet werden, da die Möglichkeit bestand, neben den VP24-spezifischen auch GST-Antikörper aufzureinigen, welche dann potentielle Hintergrundfärbungen verursachen könnten.
Abbildung 9 zeigt die spezifische VP24-Färbung im Western Blot durch das unbehandelte Kaninchenserum (A) im Vergleich zum affinitätsgereinigten VP24-AK (B).
Die Aufreinigung des VP24-AK zeigte eine deutliche Verminderung des Hintergrunds im Western Blot und sollte im Folgenden auf die Funktionalität in der Immunfluoreszenzanalyse hin untersucht werden.
4.1.4 Immunfluoreszenzanalyse des VP24
Um die intrazelluläre Verteilung von VP24 zu zeigen, wurden subkonfluente HeLa-Zellen mit dem Vaccinia-Virus MVA-T7 infiziert und eine Stunde nach Infektion mit 1 µg pTM1-VP24 transfiziert (3.2.8). Die Zellen wurden 12 Stunden nach der Infektion fixiert, permeabilisiert (3.2.8.2) und mit dem affinitätsgereinigten VP24-Antikörper (3.3.9) in einer Verdünnung von 1:2 angefärbt. Durch Inkubation mit einem
Rhodamin-Abbildung 9: Vergleich des VP24-spezifischen Kaninchenserum und des affinitätsgereinigten VP24-AK.
MARV-Antigen wurde mittels SDS-PAGE aufgetrennt, auf PVDF-Membran geblottet und die Membran in Streifen geschnitten. Die Blotstreifen wurden im folgenden mit verschiedenen AK-Verdünnungen des VP24-spezifischen Kaninchenserums sowie des affinitätsgereinigten VP24-AK gefärbt. Als Zweitantikörper diente ein POD-gekoppelter α Kaninchen-AK. A:
Färbung mit einer 1:100 (1) und 1:500 Verdünnung (2) des VP24-spezifischen Kaninchen-serum. B: Färbung mit einer 1:50 (3) und 1:100 Verdünnung (4) des affinitätsgereinigten VP24-AK.
A B
VP24-spezifisches Kaninchen-Serum 1:100 1:500
gereinigter VP24-AK 1:50 1:100
1 2 3 4
VP24 VP24
gekoppelten α Kaninchen-AK wurde VP24 sichtbar gemacht und mithilfe des Fluoreszenzmikroskopes und der Spot-Kamera fotografiert.
Die intrazelluläre Verteilung von VP24 in Hela-Zellen ist in Abbildung 10 dargestellt.
VP24 zeigte eine punktförmige Aggregation in zellkernnahen Bereichen, jedoch nur eine schwache Färbung des Zytoplasmas. Vergleicht man die Lokalisation von VP24 mit den unter 4.1.2 beschriebenen Epitop-markierten Mutanten, so fällt auf, dass die Epitope einen deutlichen Einfluss auf die Lokalisation des VP24 haben und von der Verteilung des WT-VP24 zum Teil stark abweichen. Lediglich die N-terminal mit HA-markierte Mutante zeigte eine sehr ähnliche Verteilung in der Immunfluoreszenz und wurde daher in weiteren Versuchen verwendet.