Tierärztliche Hochschule Hannover
Generierung von tissue-engineerten Pulmonalklappen und deren Untersuchung
nach Implantation in Schafen fortgeschrittenen Alters
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
-Doctor medicinae veterinariae- ( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Karolina Theodoridis
Amaroussion/Athen, Griechenland
Hannover 2013
Tierärztliche Hochschule Hannover 2. Prof. Dr. Axel Haverich
Klinik für Herz-, Thorax-, Transplantations- und Gefäßchirurgie
Medizinische Hochschule Hannover
1. Gutachterin(nen)/Gutachter: Prof. Dr. Ralph Brehm
2. Gutachterin(nen)/Gutachter: Prof. Dr. Hewicker-Trautwein
Institut für Pathologie
Tierärztliche Hochschule Hannover
Tag der mündlichen Prüfung: 07.11.2013
1. Einleitung ... 1
2. Literaturübersicht ... 4
2.1 Klinische Relevanz ... 4
2.2 Herzklappen: Anatomie und histologischer Aufbau ... 5
2.3 Klinisch angewendete Herzklappenprothesen ... 11
2.4 Tissue-engineerte Herzklappenprothesen ... 13
2.5 Endothelzellen und ihre Vorläuferzellen ... 16
2.6 Das Bioreaktorsystem nach Lichtenberg ... 19
2.7 Das proangiogene Protein CCN1 ... 21
2.8 Das Schaf als Großtiermodell in der Herzklappenchirurgie ... 22
2.9 Auswirkung des Alters auf das Regenerationspotential ... 24
3. Material und Methoden ... 26
3.1 Laborteil 1: Präoperative Vorbereitung ... 26
3.1.1 Dezellularisierung ... 26
3.1.2 Isolierung endothelzellähnlicher Zellen (ECs) aus peripherem ovinen Blut .. ... 29
3.1.3 Immunfluoreszenzfärbungen der kultivierten ovinen Zellen ... 32
3.1.4 Einnähen der dezellularisierten Pulmonalklappe in das Bioreaktorsystem nach Lichtenberg ... 34
3.1.5 Beschichtung der Pulmonalklappe mit CCN1 ... 35
3.1.6 Reendothelialisierung der dezellularisierten Pulmonalklappen mit ECs .... 36
3.2 Tierversuch ... 39
3.2.1 Versuchstiermodell: Schaf ... 39
3.2.2 Narkose ... 41
3.2.3 Operativer Pulmonalklappenersatz ... 42
3.2.4 Echokardiographie zur Funktionsüberprüfung ... 43
3.2.5 Explantation des Implantats ... 44
3.3 Laborteil 2: Aufbereitung der explantierten Allografts ... 47
3.3.1 Färbung mit Phalloidin und DAPI einer Tasche in toto ... 47
3.3.2 MosaiX-Aufnahme einer Tasche gefärbt mit Phalloidin und DAPI und Auswertung ... 48
3.3.4.1 Vorbereitung ... 50
3.3.4.2 Hämalaun-Eosin-Färbung (HE-Färbung) ... 51
3.3.4.3 Versilberung nach von Kossa ... 52
3.3.4.4 Pentachromfärbung nach Movat ... 53
3.3.4.5 Auswertung der histologischen Färbungen ... 55
3.3.5 Immunfluoreszenzfärbungen ... 57
3.3.5.1 Durchführung der Immunfluoreszenzfärbungen ... 57
3.3.5.2 Auswertung der neuen luminalen Endothelschicht ... 61
3.3.6 Statistische Auswertung ... 62
4. Ergebnisse ... 63
4.1 Laborteil 1: Präoperative Vorbereitung ... 63
4.1.1 Dezellularisierung der Pulmonalklappe ... 64
4.1.2 Erfolgreiche Differenzierung von Zellen mit endothelzellähnlichem Charakter ... 65
4.1.3 Reendothelialisierung von Pulmonalklappen mit ECs ... 67
4.2 Tierversuch ... 69
4.2.1 Operationsverlauf und postoperativer Verlauf ... 69
4.2.2 Echokardiographische Ergebnisse ... 72
4.3 Laborteil 2: Aufbereitung der explantierten Allografts ... 76
4.3.1 Morphologische Untersuchung der Allografts nach Ablauf der Beobachtungszeit ... 76
4.3.2 Bedeckung der Taschenoberfläche mit Zellen ... 78
4.3.3 Histologische Ergebnisse ... 81
4.3.3.1 Rebesiedelung der Implantate mit Zellen ... 81
4.3.3.2 Verkalkungen in histologischen longitudinalen Schnitten ... 85
4.3.3.3 Bewertung der extrazellulären Matrix (ECM) der explantierten Implantate mittels Pentachromfärbung nach Movat ... 88
4.3.3.4 Dicke der Klappentaschen ... 90
4.3.4 Resultate der Immunfluoreszenzfärbungen ... 93
4.3.4.1 ECM ... 93
4.3.4.1.1 Kollagen Typ I ... 93
4.3.4.1.2 Kollagen Typ IV ... 95
4.3.4.2.1 Von Willebrand Faktor (vWF) ... 97
4.3.4.2.2 Endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase (eNOS) ... 101
4.3.4.2.3 Vimentin ... 103
4.3.4.2.4 Smooth muscle α-actin (sm α-actin) ... 105
4.3.4.2.5 Smooth muscle myosin heavy chain 11 (MYH11) ... 107
4.3.4.2.6 Prokollagen Typ I ... 109
4.3.4.2.7 CD45 ... 110
4.3.5 Vaskularisierung ... 112
4.3.6 Neointima ... 113
5. Diskussion ... 117
5.1 Die Rebesiedelung erfolgt hauptsächlich über das angrenzende native Gewebe und die Tunica Adventitia ... 117
5.2 Die Rebesiedelung erfolgt durch eine gemischte Zellpopulation in lokalisationsspezifischen Mengenverhältnissen ... 120
5.3 Kein klarer Unterschied in der Rebesiedelung von reendothelialisierten und CCN1-beschichteten Implantaten im Vergleich zu dezellularisierten Allografts ... 122
5.4 Die Neointima ließ sich mittels Beschichtung mit CCN1 und in vitro Reendothelialisierung nicht verhindern ... 123
5.5 Eindeutige Kennzeichen von Degeneration bzw. Entzündung in zwei Implantaten ... 124
5.6 Die Erkenntnisse aus der vorliegenden Arbeit sind bedingt auf ältere Herzklappenpatienten in der Humanmedizin übertragbar ... 125
5.7 Die Reendothelialisierung von Herzklappenersatzprothesen ist nicht vorbehaltlos als Ersatzmöglichkeit für ältere Patienten zu empfehlen ... 127
6. Zusammenfassung ... 129
6.1 Deutsche Zusammenfassung ... 129
6.2 English summary ... 131
7. Abkürzungsverzeichnis ... 133
8. Literaturverzeichnis ... 134
9. Anhang ... 156
9.1 Geräteverzeichnis ... 156
10. Abbildungsverzeichnis ... 165 11. Tabellenverzeichnis ... 167 Danksagung ... 169
1. Einleitung
In den industrialisierten Ländern nimmt die Anzahl der erwachsenen Patienten, die einen Herzklappenersatz benötigen, stetig zu. Die Gründe hierfür sind verbesserte Behandlungsmethoden für Patienten mit kongenitalen Erkrankungen, sowie die stark erhöhte Lebenserwartung. Beides führt zu mehr älteren Patienten, die an erworbenen, degenerativen Herzklappenerkrankungen leiden. Diesen älteren Patienten werden als Implantate oft Bioprothesen empfohlen. Mit einer Haltbarkeitsdauer von maximal 15 Jahren erhalten die Patienten eine Lebensverlängerung mit guter Lebensqualität. Diese Vorteile für Patienten über 65 Jahren sind unbestreitbar.
Zu den gängigsten Bioprothesen zählen fixierte porcine Aortenklappen und aus porcinem Perikard hergestellte Herzklappenprothesen. In jungen Patienten, die hauptsächlich an kongenitalen Herzklappenerkrankungen leiden, degenerieren und verkalken biologische Implantate viel schneller als in älteren Patienten. Die Abstoßung klinisch eingesetzter Bioprothesen in jungen Patienten könnte in Zusammenhang stehen mit immunogenen Antigenen, die nicht vollständig entfernt oder inaktiviert wurden. Auch das Alter der Patienten, welches mit einem vorhandenen Wachstumspotential und somit eventuell höheren Kalziumwerten im Blut einhergeht, könnte eine entscheidende Rolle spielen. Das fixierte Gewebe schließt außerdem die Rebesiedelung mit autologen Zellen, sowie ein Wachstum der Implantate aus.
Die ideale Herzklappenprothese, welche keine Abstoßung oder Degeneration erfährt, die nicht thrombogen oder inflammatorisch ist, sowie die Fähigkeit besitzt, in jungen Patienten mitzuwachsen, ist noch nicht entwickelt. Es gibt allerdings vielversprechende Ansätze. Mittels Tissue Engineering ist es möglich, native Herzklappen, gewonnen aus verstorbenen Spendern, zu dezellularisieren und zusätzlich Prothesen vor deren Implantation mit patienteneigenen bzw. homologen Zellen zu rebesiedeln. Einerseits kann so die Antigenität reduziert werden und andererseits könnten die implantierten, funktionstüchtigen Zellen verschiedene
Rollen erfüllen, wie z.B. antithrombogene und stabilisierende Wirkung durch Produktion von Proteinen der Extrazellulären Matrix (ECM).
Praktisch alle vorklinischen Untersuchungen von Herzklappenimplantaten biologischen Ursprungs wurden in Schafen oder Schweinen durchgeführt, die jünger als ein Jahr waren. Dabei wurde nachgewiesen, dass die dezellularisierte ECM in vivo nach und nach mit autologen Zellen rebesiedelt wird. Man erhofft sich, dass die eingewanderten Zellen zusätzlich Matrixproteine, wie Kollagene und Elastin, produzieren, um so im natürlichen Umbauprozess auch die ECM durch autologe Proteine zu ersetzen. Dies würde eine lebenslange Haltbarkeit sowie potentielles Wachstum der Implantate gewährleisten. Wie sich solche dezellularisierte Herzklappenmatrices in älteren Patienten und somit in alten Organismen bezüglich einer Wiederbesiedelung in vivo verhalten, ist bis dato ungeklärt.
In dieser Arbeit wurde das Tissue Engineering, also das Herstellen von funktionellem Ersatzgewebe mittels Kombination einer biologischen Gerüstsubstanz und autologen Zellen genutzt, um Implantate für den Pulmonalklappenersatz zu generieren. Es wurden (1) dezellularisierte (n=6), (2) mit dem proangiogenen Protein CCN1 beschichtete dezellularisierte (n=6) und (3) reendothelialisierte (n=6) Allografts (Implantate speziesgleicher Herkunft) in 7 Jahre alte Schafe implantiert und nach Explantation mittels Histologie und Immunfluoreszenzfärbungen ausgewertet.
Für die histologische Auswertung wurden die Färbung mit Hämalaun und Eosin (HE), die Versilberung nach von Kossa und die Pentachromfärbung nach Movat angewendet. Während mittels Hämalaun und Eosin die Lokalisation und das Ausmaß der Rebesiedelung des Allografts mit neuen Zellen im Vordergrund stand, wurde die Versilberung nach von Kossa verwendet, um mögliche Mineralisierungen des Gewebes darzustellen, ein Indiz für eine immunologische Reaktion. Mittels der Pentachromfärbung nach Movat konnten Kollagen, Elastin und Glucosaminoglycane (GAGs) der ECM genau betrachtet werden, um die Integrität und Veränderungen der ECM untersuchen zu können. Hierfür wurden zusätzlich Immunfluoreszenzfärbungen gegen die Kollagene von Typ I und Typ IV verwendet. Um die Identität der eingewanderten Zellen zu definieren, wurde gegen Marker von Endothelzellen (von Willebrand Faktor = vWF, endotheliale Stickstoffmonoxidsynthase = eNOS), von
interstitiellen Zellen der Herzklappe, wie z.B. Vimentin, Smooth muscle α-actin (sm α- actin), Smooth muscle myosin heavy chain 11 (MYH11) und von Entzündungszellen mit CD45 gefärbt. Als Marker für die Produktion von Kollagen in den neu eingewanderten Zellen und somit auch für die Vitalität der Zellen im Implantat wurde Prokollagen Typ 1 genutzt, was sich innerhalb der Zellen befindet.
Im Vordergrund der vorliegenden Arbeit standen folgende Fragestellungen:
1. Findet eine Rebesiedelung mit autologen Zellen in den drei unterschiedlich behandelten Implantaten nach einer Verweildauer von 6 bzw. 12 Monaten statt? Welche Zellen sind daran beteiligt und wie sind diese in den Implantaten verteilt?
2. Lassen sich Vorteile erkennen in Funktion und Rebesiedelung der reendothelialisierten und CCN1-beschichteten Implantate in Vergleich zu den einfacher herzustellenden dezellularisierten Allografts?
3. Ist es gelungen, mittels Tissue Engineering ein nicht-immunogenes, nicht- thrombogenes Implantat herzustellen, welches den dezellularisierten allogenen Implantaten überlegen ist?
4. Ist die Rebesiedelung der Implantatmatrix durch autologe Zellen und somit das Regenerationsvermögen im Schaf fortgeschrittenen Alters vergleichbar mit publizierten Ergebnissen von vergleichbaren Versuchen an jungen Tieren?
2. Literaturübersicht
2.1 Klinische Relevanz
Herzklappenerkrankungen spielen in Deutschland eine bedeutende Rolle. Im Jahr 2010 wurden 25.127 Operationen an Herzklappen durchgeführt1. Am häufigsten war die Aortenklappe betroffen, dicht gefolgt von der Mitralklappe. Allerdings konnten mehr als die Hälfte der zu operierenden Mitralklappen durch eine Rekonstruktion erhalten werden. Bei den Aortenklappen konnten weniger als 10% auf diese Weise korrigiert werden. Insgesamt wurden im Jahr 2010 11.582 Implantate für einen Aortenklappenersatz benötigt1. Der Bedarf nach dem idealen Implantat besteht also nach wie vor.
Den Jahresberichten der Herz-, Thorax- und Transplantationschirurgie der Medizinischen Hochschule Hannover ist zu entnehmen, dass die Anzahl älterer Patienten (>60 Jahre), die sich einem herzklappenchirurgischen Eingriff unterziehen mussten, allein von 2008 bis 2011 um mindestens 10% gestiegen ist2,3. 2011 wurden 77% der Herzklappenoperationen an Patienten >60 Jahren durchgeführt3. Durch die gestiegene Lebenserwartung steigt die Anzahl der geriatrischen Patienten mit degenerativen Herzklappenerkrankungen. Während bei Kindern kongenitale Herzklappenfehler im Vordergrund stehen, sind bei Erwachsenen die degenerativen Veränderungen ausschlaggebend. Die bessere medizinische Versorgung bewirkt, dass Patienten mit kongenitalen Herzklappenerkrankungen ein hohes Alter erreichen, so dass die Anzahl der Erwachsenen mit angeborenen Herzklappenerkrankungen kontinuierlich zunimmt. Es wird erwartet, dass die Zahl der Erwachsenen mit kongenitalen Herzerkrankungen die Anzahl der jungen Patienten übersteigen wird4. Diese Patienten benötigen lebenslange medizinische Betreuung und eventuell Nachoperationen, um eingesetzte Implantate mit Funktionsverlust zu ersetzen5.
Bei der Auswahl des richtigen Implantats muss das Alter der Patienten berücksichtigt werden. Bei Patienten über 65 Jahren wird eine Bioprothese empfohlen, da diese
eine Haltbarkeitsdauer von ungefähr 15 Jahren, sowie eine gute Lebensqualität bietet, nicht zuletzt weil man auf eine Antikoagulation verzichten kann6. Allerdings ist zu berücksichtigen, dass alle tierexperimentellen Studien zu Herzklappenimplantaten biologischer Herkunft in juvenilen Tieren - insbesondere in Schafen -, die nicht älter als 2 Jahre waren, durchgeführt wurden. Demzufolge ist es nötig, zu untersuchen, wie sich Implantate biologischer Herkunft im alten Individuum entwickeln und ob es Unterschiede bezüglich Haltbarkeitsdauer und Funktion gibt.
Am häufigsten betroffen bei Herzklappenerkrankungen ist die Aortenklappe, gefolgt von der Mitralklappe. Pulmonalklappenerkrankungen sind hingegen eher seltene Erkrankungen, die meistens kongenital auftreten1,7. Das primäre Ziel dieser Arbeit ist das Regenerationspotenzial (Wiederbesiedlung mit autologen Zellen) nach einem Herzklappenersatz im älteren Individuum zu untersuchen. Um die Frage der Wiederbesiedelung zu beantworten, wurde der Pulmonalklappenersatz in supravalvulärer Position durchgeführt, weil diese Methode aus herzchirurgischer Sicht einfach und schnell durchzuführen ist. Gleichzeitig ist dieser Ansatz gut geeignet, um das Rebesiedelungsverhalten eines dezellularisierten Gewebes unter wechselnden Strömungs- und Druckverhältnissen zu untersuchen.
2.2 Herzklappen: Anatomie und histologischer Aufbau
Wie an der Ventilebene des Herzens zu erkennen ist (Abb. 1), besitzt das Herz vier Herzklappen, welche entsprechend ihrer Form in Segelklappen und Taschenklappen eingeteilt werden8,9. Die Segelklappen (Valvae atrioventriculares, Mitralklappe und Tricuspidalklappe) liegen zwischen Vorhof und Ventrikel und sorgen dafür, dass das Blut während der Systole nicht zurück in den Vorhof fließt. Während die Mitralklappe aus zwei Segeln (Cuspes) besteht und somit auch Bicuspidalklappe genannt wird, besitzt die Tricuspidalklappe drei Segel. Diese Segel sind mittels der Sehnenfäden (Chordae tendinae) mit den Papillarmuskeln der Ventrikelwand verbunden. Ihre Aufgabe besteht darin, die Segel zu stabilisieren und ein „Rückschlagen“ in Richtung Vorhof zu verhindern. Die Taschenklappen (= Valvae semilunares) bzw. die Aortenklappe (= Valva aortae) und Pulmonalklappe (= Valva trunci pulmonalis) liegen
zwischen den Ventrikeln und den großen abführenden Blutgefäßen, der Aorta und dem Truncus pulmonalis. Sie öffnen während der Systole und schließen kurz vor der Diastole, durch den Blutrückfluss aus den Gefäßen und wenn der Druck im abführenden Gefäß größer als der in den Ventrikeln ist. Beide Taschenklappen bestehen aus je drei halbmondförmigen Taschen, den Valvulae semilunaris.
Abbildung 1: Ventilebene des humanen Herzens mit Mitralklappe (= Bicuspidalklappe) (1), Tricuspidalklappe (2), Aortenklappe (3) und Pulmonalklappe (4)10.
(Modifiziert nach „ Gray´s Anatomy of the human body“10)
Der Aufbau einer Taschenklappe mit den verwendeten Begriffen wird in Abbildung 2 genauer erläutert. Die Sinuswand bzw. Klappenwand der Taschenklappen wird proximal vom Sinusscheitelpunkt und distal vom sinutubulären Übergang begrenzt und somit morphologisch von der Aorta bzw. dem Truncus pulmonalis begrenzt11.
Abbildung 2: Schematischer, longitudinaler Aufbau (A) und histologischer, longitudinaler Schnitt (B) einer Taschenklappe am Beispiel der Pulmonalklappe (1: Myokard, 2: Scheitelpunkt des Sinus, 3:
Klappenwand, 4: Sinutubulärer Übergang 5: Wand des Truncus pulmonalis, 6: Arterieller Sinus, 7: Sinus, 8: Tasche, 9: Arterielle Seite der Tasche, 10: Taschenspitze, 11: Ventrikuläre Seite der Tasche).
Obwohl die Taschenklappenwand dünner ist als die Gefäßwand des abführenden Gefäßes (Aorta oder Truncus pulmonalis), ist der Aufbau vergleichbar (Abb. 3) und kann ähnlich den Arterien des elastischen Typs, wie folgt von innen nach außen eingeteilt werden11,12:
1. Lamina endothelialis (Endothelzellen orientiert in Richtung des Gefäßes) 2. Stratum subendotheliale
3. Membrana elastica interna
4. Tunica media (Glatte Muskulatur, GAGs, kollagene Fasern und elastische Fasern)
5. Membrana elastica externa
6. Tunica adventitia (lockeres Bindegewebe mit Blutgefäßen).
In Gefäßen wird Kollagen Typ I in hoher Konzentration gefunden13, zusätzlich ist Kollagen Typ I der Hauptbestandteil des Kollagengehalts in der gesamten Herzklappe (Kollagen Typ I: 74%; Kollagen Typ III: 24%)14. Die elastischen Fasern, die in Abbildung 3 mittels Pentachromfärbung nach Movat rot dargestellt wurden, sind v.a. im Stratum subendotheliale und in der Tunica media zwischen der
Muskulatur zu sehen und sind u.a. für die Windkesselfunktion des Gefäßes essentiell15.
Abbildung 3: Aufbau einer ovinen Klappen- bzw. Sinuswand einer nativen Pulmonalklappe, gefärbt mit Pentachromfärbung nach Movat (1: Lamina endothelialis, 2: Stratum subendotheliale, 3: Tunica media).
(Gelb: Kollagen; Rot: Elastin; Blau: GAGs; Rotbraun: Zellkerne)
Die Valvulae der Taschenklappen zeigen von der ventrikulären zur arteriellen Seite einen typischen dreischichtigen Aufbau16,17:
1. Lamina ventricularis (Reich an Elastin und Kollagen Typ I), 2. Lamina spongiosa (Lockeres Gerüst aus GAGs),
3. Lamina fibrosa (Dichtes Netzwerk aus Kollagenfasern).
Wie in Abbildung 4 zu erkennen, lässt sich der dreischichtige Aufbau der Tasche besonders gut mittels Pentachromfärbung darstellen. Dabei werden Kollagenfasern gelb, elastische Fasern rot und GAGs blau gefärbt.
Trotz des ähnlichen Aufbaus besitzt die Pulmonalklappe im Vergleich zur Aortenklappe dünnere bzw. feinere Valvulae18.
Abbildung 4: Ovine, native Klappentasche (Pentachromfärbung nach Movat) mit dem typischen dreischichtigen Aufbau (1: Lamina ventricularis, 2: Lamina spongiosa, 3: Lamina fibrosa). Die ventrikuläre Seite ist oben und die arterielle Seite unten im Bild. (Gelb: Kollagen; Rot: Elastin; Blau:
GAGs; Rotbraun: Zellkerne)
Die Tasche wird beidseitig von einer Endothelschicht bedeckt. Das Endothel erfüllt u.a. die Aufgabe, das unterliegende Gewebe vom Blutfluss zu trennen und im Falle von Verletzung den von Willebrand Faktor (vWF) auszuschütten, was zur Agglomeration von Thrombozyten führt15. Außerdem geht von sogenannten
„endothelialen tip cells“ die Neuendothelialisierung des verletzten Gefäßes aus19. Es wird vermutet, dass die Endothelzellen in Kontakt mit den interstitiellen Zellen der Tasche (z.B. Fibroblasten, Myofibroblasten) stehen und diese so beeinflussen können20. Die Fibroblasten und Myofibroblasten werden für die Stabilisierung und den Remodelingprozess in der Tasche verantwortlich gemacht21.
Endothelzellen werden in der Literatur z.B. durch folgende Marker identifiziert: vWF (von Willebrand Faktor)22,23, eNOS (endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase)24,23, VE-Cadherin (vaskulär-endotheliales Cadherin)23,25,26 und CD31 (PECAM-1)27,23. Die Zellen des Bindegewebes der Tasche und Klappenwand (Fibroblasten, Myofibroblasten, glatte Muskelzellen) sind mesenchymalen Ursprungs und enthalten
das Intermediärfilament Vimentin28. Während Myofibroblasten in den meisten Publikationen anhand des sm α-actins (= smooth muscle α-actin)29,30 identifiziert werden können, sind für die glatten Muskelzellen bedeutend mehr Marker gebräuchlich: sm α-actin, MYH11 (= sm myosin heavy chain 11), Calponin und Caldesmon31,32. Fibroblasten, Myofibroblasten und glatte Muskelzellen sind zur Prokollagensynthese fähig29,33. Verglichen mit nativen Herzklappen ist die Prokollagen-Typ-I-Konzentration in implantierten biologischen Implantaten höher34. Während die Ergebnisse der Studien von Steinhoff et al. und Lichtenberg et al. für eine Prokollagen-I-Synthese in den Prothesen sprachen, für die die Myofibroblasten verantwortlich waren35,36, sahen Lupinetti et al. und Song et al. die Fibroblasten als die Hauptproduzenten an34,37.
2.3 Klinisch angewendete Herzklappenprothesen
Bei der Wahl der richtigen Klappenprothese stehen zwei große Untergruppen zur Verfügung: mechanische und biologische Herzklappen38,39. Mechanische Herzklappen (Abb. 5) existieren seit den 1960er und werden mit teils sehr guten Ergebnissen angewandt. Nach einem Herzklappenersatz mittels mechanischer Prothesen können zwischen 20 und 30 Jahre verstreichen, ohne dass ein Ersatz nötig wird. Die Starr-Edwards-Herzklappenprothese verspricht sogar eine Haltbarkeit von bis zu 40 Jahren40. Wegen der starken Aktivierung der Blutgerinnung durch die mechanischen Herzklappen41, müssen die Patienten allerdings eine lebenslange Antikoagulationstherapie mit Aspirin oder Warfarin erhalten. Somit müssen die Patienten entweder das Risiko einer hohen Blutungsneigung bzw.
Gerinnungshemmung oder einer potentiellen Thrombenbildung bei zu hohen Gerinnungswerten eingehen. Mechanische Herzklappenprothesen haben zusätzlich den Nachteil, dass sie zur Bildung eines Biofilms auf ihrer Oberfläche neigen42, was zu einer Endokarditis führen kann.
Abbildung 5: Mechanische Herzklappenprothesen verschiedener Hersteller (A: Bicuspide mechanische Klappe der Firma St. Jude, B: monocuspide, mechanische Klappe der Firma Medtronic, C: „Caged ball“
Klappe der Firma Carpentier-Edwards Magna)38 (Modifiziert nach Pibarot et al.38)
Bioprosthetische Herzklappen hingegen bestehen aus Materialien biologischen Ursprungs39 (Abb. 6). Kommerziell erhältlich sind kryokonservierte Pulmonalklappen oder Aortenklappen menschlichen Ursprungs43. Aus tierischem Material stehen
porcine Aortenklappen und bioprosthetische Klappen aus porcinem oder bovinem Perikard zur Verfügung. Um die Antigenität zu senken, werden diese mit Glutaraldehyd fixiert. Diese Behandlung führt zu einer Kreuzbindung der Epitope44. Meistens nutzen die Hersteller dieser Klappen zusätzlich Chemikalien, welche einer Verkalkung vorbeugen sollen39. Allerdings haben diese Implantate aufgrund von Degenerationsprozessen45 eine Haltbarkeit von maximal 15 Jahren, die allerdings nur in Patienten auftreten, die jünger als 65 Jahre sind46, wobei die Autoren keine Erklärung hierfür hatten. Ein weiterer Nachteil der bioprosthetischen Klappen ist, dass verbleibendes Glutaraldehyd sowohl zytotoxisch als auch inflammatorisch wirken kann47.
Es gilt somit die Nachteile einer Antikoagulationstherapie gegen eine frühzeitige Klappenfunktionsbeeinträchtigung durch Abbauprozesse des biologischen Implantats abzuwägen. Für ältere Patienten werden im klinischen Alltag bioprosthetische Klappen empfohlen, da die erwartete komplikationsfreie Lebenserwartung höher ist als bei implantierten mechanischen Klappen48. Weder mechanische noch biologische, fixierte Prothesen sind zum Wachstum fähig.
Abbildung 6: Bioprosthetische Herzklappen unterschiedlichen Ursprungs (A: porcine bioprosthetische Klappe, B: Herzklappe aus bovinem Perikard, C: humane Aortenklappe)39
(Modifiziert nach Vesely et al.39)
2.4 Tissue-engineerte Herzklappenprothesen
Weder die mechanischen noch die auf Biomaterialien basierenden Herzklappen stellen „ideale Ersatzklappen“ dar. Eine „ideale Herzklappe“ verspricht man sich allerdings durch das sogenannte Tissue Engineering49. Im Tissue Engineering kann eine körperfremde, biologische Matrix mit autologen Zellen (= körpereigene Zellen des Empfängers) kombiniert werden. Als Matrix kommen Substanzen wie Kollagene und Fibrin in Frage, welche in die erforderliche Form gegossen werden50. Ein anderes sehr populäres Grundgerüst ist die dezellularisierte biologische Matrix. Beim Vorgang des „Dezellularisierens“ werden die vorhandenen Zellen des Gewebes zerstört und die Zelltrümmer herausgewaschen. Die ECM (= extrazelluläre Matrix) soll dabei möglichst unbeschadet erhalten bleiben. Diese dezellularisierte Matrix soll bei einer Implantation aufgrund der fehlenden zellgebunden Epitope des Spenders eine reduzierte immunologische Reaktion hervorrufen51. Dieses Verfahren ist mit isolierten Gefäßen52 und Herzklappen53 aber auch mit ganzen Herzen54, Knorpel55, Haut56 und Nieren57 möglich58. Erste dezellularisierte Gefäßimplantate wurden bereits in den 1980er-Jahren angewendet59. Die ersten dezellularisierten Herzklappenimplantate dagegen wurden 1995 im caninen Tiermodell mit guten Ergebnissen getestet60. Im ovinen Tiermodell wurden außerdem mit dezellularisierten Aortenklappen bessere Ergebnisse erzielt als mit nativen Klappen. Nach 3 und 9 Monaten in vivo zeigten die dezellularisierten Aortenklappen keine strukturellen Veränderungen im Gegensatz zu den nativen Klappen, die deutliche Zeichen von Degeneration aufwiesen, wie z.B. verdickte und geschrumpfte Taschen, sowie Verkalkungen61. Auch erste klinische Anwendungen demonstrieren die Überlegenheit der dezellularisierten Herzklappen. Fünf Jahre nach Implantation benötigten 100%
der Kinder, die dezellularisierte, homologe (= Implantate humanen Ursprungs, bestimmt für den Einsatz im Menschen) Pulmonalklappen als Implantat erhielten, keine Reoperation53. Die kryokonservierten, homologen Herzklappen und glutaraldehydfixierten Implantate aus boviner Jugularvene zeigten mit nur 85,9%
bzw. 87,6% Reoperationsfreiheit deutlich schlechtere Ergebnisse. Die Gründe für
den Ersatz dieser Implantate waren Fremdkörperreaktionen, Undichtigkeit der Klappe und/oder Kalzifizierungen der Implantate53.
Dezellularisierte Herzklappen gelten streng genommen noch nicht als tissue- engineerte Herzklappen. Erst durch die Besiedlung mit körpereigenen Zellen kann von Tissue Engineering gesprochen werden. Im Tissue Engineering kommen als Zellkomponenten für Ersatzgefäße glatte Muskelzellen, Fibroblasten und Endothelzellen zum Einsatz62.
Im Fall von tissue-engineerten Herzklappen können Endothelzellen genutzt werden.
Ziel ist es, dass die Endothelzellen die lumenseitige Oberfläche der Implantate z.B.
der Gefäßimplantate besiedeln und solange proliferieren, bis eine konfluente Schicht entsteht, die in Form und Funktion der nativen Endothelzellschicht entspricht. In den Leibniz Laboratorien für Biotechnologie und artifizielle Organe (LEBAO), der Forschungsabteilung der Herz-, Thorax-, Transplantations- und Gefäßchirurgie der Medizinischen Hochschule Hannover, werden seit 2005 dezellularisierte Herzklappen in einem Bioreaktor unter physiologischen Flussbedingungen erfolgreich mit Endothelzellen rebesiedelt. Dadurch erhalten die Herzklappen eine oberflächliche Schicht aus Endothelzellen, die einem pulsatilen Fluss von 1 l/min widerstehen können63,64.
Eine weitere Alternative sind Herzklappenprothesen, in denen de novo Zellen in einem Grundgerüst aus Proteinen eingeschlossen wurden. Hierbei wird zum Beispiel ein Gemisch aus flüssigem Fibrin und Zellen in Formen eingegossen. Nach mehreren Wochen in Kultur bildet sich ein Konstrukt, in welchem die eingeschlossenen Zellen selber Kollagen produzieren65,66. Diese Methode ist unabhängig vom vorhandenen Angebot an Herzklappen von verstorbenen Spendern.
Außerdem ist das Risiko der Übertragung von Pathogenen, die eventuell vom Spender stammen, wesentlich geringer und man kann Herzklappen verschiedener Größen herstellen. Allerdings ist die Herstellungsdauer länger und der mikroskopische Aufbau ähnelt nur wenig dem komplexen Aufbau der nativen Herzklappenmatrix (Abb. 7). Bis dato haben in vivo Versuche im Tiermodell mit diesen Konstrukten aufgrund der Retraktion der Taschen nicht die erwünschten Ergebnisse gebracht65.
Abbildung 7: Histologische Ergebnisse mittels Hämatoxylin-Eosin Färbung (A-F) und Trichromfärbung nach Gomori (G-L) von Flanagan et al. Dargestellt sind Tasche (A, G) und Wand (B, H) einer nativen Klappe, Tasche (C, D) und Wand (I, J) einer tissue-engineerten Herzklappe vor Implantation und Tasche (E, F) und Wand (K, L) einer tissue-engineerten Herzklappe drei Monate nach Implantation65. Es wird deutlich, dass den künstlichen Konstrukten sowohl in den Taschen als auch in der Wand der typische mehrschichtige Aufbau fehlt. Nach Implantation haben sich die Konstrukte zwar leicht verändert, sind allerdings den nativen Herzklappen nicht ähnlicher geworden.
(Modifiziert nach Flanagan et al.65)
2.5 Endothelzellen und ihre Vorläuferzellen
Eine oft genutzte Zellart in der regenerativen Medizin sind die Endothelzellen67-‐69. Als innere Auskleidung der Gefäße in Form von einem streng einschichtigen Zellverband dienen diese Zellen als Barriere zwischen Blut und Gewebe. Die Aufgaben der Endothelzellen sind sehr umfangreich. Die wohl wichtigste Aufgabe ist die antiadhäsive Wirkung gegenüber Erythrozyten und Thrombozyten. Im Fall von Gefäßverletzungen kann z.B. der vWF freigesetzt werden, der prothrombogen wirkt70,71. Das Endothel kann je nach Bedarf sowohl gerinnungshemmend sowie gerinnungsfördernd wirken. Durch die Produktion von NO (Stickstoffmonoxid) durch eNOS (endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase) und iNOS (induzierte Stickstoffmonoxid-Synthase) wird zusätzlich der Gefäßtonus an den glatten Muskelzellen beeinflusst72,73. Außerdem können Endothelzellen anti- oder proinflammatorisch wirken74. Bei Verletzung der Endothelzellkontinuität kann aus dem intakten angrenzenden Endothel eine neue Endothelzellschicht proliferieren75. Diesen Reparaturvorgang führen „Tip cells“ aus. Perizyten, die in kleinen Gefäßen zwischen den Endothelzellen und dem umliegenden Gewebe liegen, können über parakrine Signale oder direkt über die Zell-Zell-Kontakte die Differenzierung und Proliferation von Endothelzellen beeinflussen76-‐78. Um ausdifferenzierte Endothelzellen zu gewinnen, benötigt man ein Blutgefäß. Wird dieses mit Kollagenase behandelt, kann man einzelne Endothelzellen isolieren63,79. Allerdings stellt die Entnahme eines Blutgefäßes für einen Patienten einen nicht unerheblichen Eingriff dar. Als 1997 zum ersten Mal endotheliale Vorläuferzellen aus dem peripheren Blut eines Erwachsenen isoliert werden konnten80, war die Hoffnung groß, dass man eine neue Quelle für endothelzellähnliche Zellen gefunden hatte, welche dieselben Aufgaben erfüllen können wie ausdifferenzierte Endothelzellen.
Bald wurden diese endothelialen Vorläuferzellen (Endothelial progenitor cells = EPCs) aufgrund von Isolationstechniken oder aufgrund unterschiedlich exprimierter membranständiger Epitope in Untergruppen unterteilt.
In definierten Kulturverfahren kann man die sogenannten „frühen EPCs“ gewinnen:
dabei werden Zellen der mononukleären Phase des peripheren Bluts mit Medium, welches den VEGF (vaskulärendothelialer Wachstumsfaktor = vascular endothelial growth factor) enthält, für circa 4 Tage kultiviert81,82. Diese Zellen stellen eine heterogene Population dar, die viel Ähnlichkeit mit immunologischen Zellen besitzt.
Daher ist Ihre Bezeichnung EPC kontrovers. Werden allerdings die frühen EPCs über einen längeren Zeitraum kultiviert, differenzieren sich diese Zellen in einen weitaus reiferen Endothelzellphänotyp, die „späten“ oder „late outgrowth EPCs“83. Um die gleiche Zellgruppe handelt es sich vermutlich auch bei den „endothelialen koloniebildenden Zellen“ (Endothelial colony-forming cells = ECFCs), welche im Kolonieverfahren von Ingram et al. isoliert wurden84. Diese wurden über 14 Tage auf Kollagen kultiviert und zeichneten sich durch einen „reifen“ endothelialen Phänotyp mit der charakteristischen Kopfsteinpflastermorphologie (Abb. 8) und ein hohes Proliferationspotential aus. Während die frühen EPCs die Gefäßbildung durch das Sezernieren von Wachstumsfaktoren stimulieren sollen, sind es die späten EPCs oder die ECFCs, die als Zellbestandteil beim Gefäßaufbau fungieren85. Zusätzlich können EPCs in hämatopoetische und nicht-hämatopoetische EPCs eingeteilt werden. Die hämatopoetischen EPCs sind kleine, unreife Zellen mit einem hohen proliferativen Potential, die CD34 und CD133 exprimieren. Nicht-hämatopoetische EPCs können aus dem peripheren Blut isoliert werden, stammen aber nicht aus hämatopoetischen Stammzellen. Ihr Phänotyp ähnelt sehr stark dem der reifen Endothelzellen86.
Zusätzlich kann man EPCs nicht nur aus dem peripheren Blut gewinnen, sondern auch aus Nabelschnurblut87 oder sogar aus Stammzellen, die aus Fett gewonnen worden sind88.
Künstliche Gefäßersatzstrukturen, welche luminal mit autologen EPCs rebesiedelt wurden, haben seltener zu Thrombosierungen geführt als Implantate ohne endotheliale Auskleidung89. Auch dezellularisierte Pulmonalklappen, welche vor der Implantation im Schaf mit autologen Endothelzellen (isoliert aus der Jugularvene) reendothelialisiert wurden, zeigten ein besseres Ergebnis nach einer Implantationszeit von 1 und 3 Monaten als die nur dezellularisierten
Pulmonalklappen. Die reendothelialisierten Herzklappen wiesen im Gegensatz zu den dezellularisierten eine konfluente Endothelzellschicht, geringere Neointimabildung und weniger Thromben auf36.
Eine begünstigende Wirkung der Endothelialisierung mit EPCs wurde auch für die vorliegende Arbeit bei der Implantation von dezellularisierten Pulmonalklappen in alten Schafen erwartet. Abgesehen vom Alter der Tiere in diesem Tiermodell wurde auch eine andere Zellquelle verwendet. Während Lichtenberg et al. ausdifferenzierte autologe Endothelzellen verwendeten36, wurden für sechs Schafe in dieser Studie autologe EPCs genutzt, die aus dem eigenen peripheren Blut stammten. Der vorliegenden Arbeit liegen die Hypothesen zugrunde, dass 1. die im Bioreaktor erschaffene luminale, einschichtige Endothelzellschicht die Aktivierung des Gerinnungssystems verhindert und dass 2. durch die Nutzung von autologen Zellen auf der dezellularisierten Matrix keine Abstoßungsreaktionen initiiert werden und somit die Akzeptanz des Gewebes verbessert wird, was durch eine stärkere Besiedelung mit körpereigenen interstitiellen Zellen in vivo gekennzeichnet sein könnte.
Abbildung 8: Von Ingram et al. isolierte ECFCs (Endothelial Colony Forming Cells) mit Pflastersteinmorphologie84
(Modifiziert nach Ingram et al.84)
2.6 Das Bioreaktorsystem nach Lichtenberg
Lichtenberg et al. haben im Rahmen des Tissue Engineerings ein Bioreaktorsystem (Abb. 9) entwickelt, mit dessen Hilfe dezellularisierte Pulmonalklappen mit Endothelzellen rebesiedelt werden können36,63,64. Neben der Rebesiedelung sollen die zugegebenen Endothelzellen im Bioreaktor weiterhin für den Fluss und die Druckveränderungen in der Pulmonalklappenposition „trainiert“ werden.
Grundsätzlich besteht das System aus zwei zylinderförmigen Räumen, dem Innenraum und dem Außenraum, wobei der Außenraum den Innenraum umschließt.
Beide Räume werden erst durch das Einnähen der Herzklappe von einander getrennt und sie besitzen kleine Ein- bzw. Auslassöffnungen auf beiden Seiten des Zylinders zum Auffüllen und Zugeben von Flüssigkeiten (Abb. 9). Die Enden des Innenraums sind offen. Durch aufgesteckte Silikonschläuche an beiden Enden kann der Innenraum verschlossen werden.
Nach erfolgter Endothelzellzugabe in den Innenraum einer im Bioreaktor eingenähten Herzklappe wurde den Zellen Zeit gegeben, auf der luminalen Oberfläche zu adhärieren. Anschließend wurde der Innenraum mit einem Schlauchsystem zur Mediumzirkulation verbunden, wobei der Gasaustausch bzw.
die Oxygenierung des Mediums in einer angeschlossenen Luftkammer stattgefunden hat. Das Schlauchsystem wurde mit einer Pumpe verbunden, die für einen dynamischen und pulsatilen Fluss sorgte. Der initiale Fluss von 0,1 l/min wurde zweimal täglich bis zu 1 l/min bzw. 2 l/min erhöht63. Die Auswertung der rebesiedelten Pulmonalklappen ergab, dass sich auf der gesamten luminalen Oberfläche der Pulmonalklappe eine konfluente vWF-positive Zellschicht gebildet hatte63. Diese im Bioreaktor reendothelialisierten Pulmonalklappen wiesen im Schafmodell drei Monate post OP im Vergleich zu dezellularisierten Pulmonalklappen eine stärker ausgeprägte Endothelzellschicht und eine geringere Neointimabildung auf36.
Aufgrund der vielversprechenden Ergebnisse wurde auch in der vorliegenden Studie das Bioreaktorsystem nach Lichtenberg et al. benutzt, um dezellularisierte
Pulmonalklappen mit autologen endothelähnlichen Zellen aus dem peripheren Blut von sechs älteren Schafen vor der Implantation zu rebesiedeln.
Abbildung 9: Schematische Darstellung des Bioreaktorsystems nach Lichtenberg et al.63 (Modifiziert nach Lichtenberg et al.63)
2.7 Das proangiogene Protein CCN1
Sechs Schafe erhielten als Implantat eine dezellularisierte Pulmonalklappe beschichtet mit dem proangiogenen Faktor CCN190,91. Somit sollte untersucht werden, ob diese Implantate in vivo eine stärkere Reendothelialisierung erfahren als dezellularisierte ovine Pulmonalklappen, was womöglich zu einer geringeren Neointimabildung mit weniger Thromben führen könnte.
CCN1 ist ein sezerniertes Matrixprotein mit vielfältigen Funktionen und u.a. an Prozessen wie die Angiogenese, Vaskularisierung und Gefäßreparatur beteiligt92. CCN1 wurde in Gewebe während der Wundheilung gefunden93 und hat einen Einfluss auf Endothelzellen94, glatte Muskelzellen95 und Fibroblasten96. Obwohl der genaue Mechanismus nicht völlig geklärt ist, wird u.a. vermutet, dass VEGF die Freisetzung von CCN1 herbeiführt, was letztendlich in Kultur zu einer Proliferation und Migration von Endothelzellen führt97. 2008 wurde publiziert, dass nicht nur Endothelzellen und EPCs, wenn sie durch VEGF stimuliert werden, verstärkt CCN1 exprimieren, sondern dass auch in Kultur zugefügtes CCN1 zu einer Sekretion von VEGF und zur verstärkten Proliferation, Migration von EPCs und zur Bildung von gefäßstrangähnlichen Strukturen führt98. Die Unterstützung der Endothelzellproliferation durch eine Anlockung von CD34-positiven Vorläuferzellen ist ebenso denkbar90. Bär et al. haben am Beispiel der Reendothelialisierung von BioVaMs (= Biologische Vaskularisierte Matrices mit erhaltenen zu- und abführenden Gefäßen) nachgewiesen, dass die Beschichtung von dezellularisierten Gefäß- strukturen mit CCN1 zu einer höheren Reendothelialisierungsrate geführt hat99. Die parakrinen und autokrinen Fähigkeiten von CCN1 könnten in vitro und in vivo genutzt werden um eine höhere Endothelzelldichte zu erreichen91.
2.8 Das Schaf als Großtiermodell in der Herzklappenchirurgie
Das Schaf ist ein sehr beliebtes Großtiermodell für die Herzchirurgie, sowohl für die Erprobung von neuen operativen Methoden, als auch für die vorklinische Testung von allogenen100 sowie xenogenen Materialien101,102. Die vergleichbare Größe und ähnliche hämodynamische Bedingungen des Herzens zu dem menschlichen Herzen sind besonders von Vorteil. Aber auch die einfache Haltung und das robuste Wesen des Schafes haben dazu geführt, dass es seit mehreren Dekaden für den experimentellen Herzklappenersatz eingesetzt wird.
Durch eine Vielzahl von publizierten Studien mit Herzklappenersatz in Schafen ist eine Fülle von Informationen bezüglich der in vivo Veränderungen der jeweiligen Prothesen und zum Repopulationsmuster mit autologen Zellen der Implantate zu finden. So publizierten Quinn et al. 2011, dass dezellularisierte Pulmonalklappen im juvenilen Schaf nach 160 Tagen am stärksten in der Klappenwand und in der Basis der Valvulae mit Zellen rebesiedelt waren. In der Mitte und in der Spitze hingegen waren nur selten Zellen zu finden. Die Rebesiedelung der Klappenwand war in Richtung der Adventitia stärker als luminal103.. Dezellularisierte porcine Aortenklappen wurden von Goldstein et al. in Lämmer im Alter von 4 bis 6 Monaten im rechten Ausflusstrakt des Herzens (= Pulmonalklappe mit angrenzendem Herzmuskel und Truncus pulmonalis) implantiert. Nach 150 Tagen Implantationszeit wurden neue Zellen hauptsächlich an der Basis der Tasche in der Nähe der Klappenwand gefunden. Der Großteil der Zellen wurde als Fibroblasten charakterisiert. Nach 336 Tagen in vivo war die Zelldichte in der Tasche mit nativem Material vergleichbar, so dass die Klappentasche als fast vollständig rebesiedelt angesehen werden konnte104. Sowohl Wu et al. als auch Hopkins et al. charakterisierten die neue Zellpopulation im Interstitium der Pulmonalklappenimplantate als SMA-positiv30,100. Zusätzlich identifizierten Wu et al. 16 Wochen post OP eine luminale, konfluente Endothelzellschicht30.
Das Schaf zeichnet sich weiterhin durch eine schnelle Verkalkung von Gewebe z.B.
aufgrund von entzündlichen Geschehen aus. Kalzifizierungen können histologisch einfach dargestellt werden z.B mittels der Versilberungsmethode nach von Kossa und wurden daher häufig zum Kennzeichnen von Unverträglichkeitsreaktionen bei
mangelhaften biologischen Prothesen genutzt35,30. So konnten auch Hopkins et al.
feststellen, dass dezellularisierte allogene Pulmonalklappen weniger stark und weniger häufig kalzifizieren als nicht-dezellularisierte Klappen. Für diese Erkenntnis reichten in jungen Schafen schon 20 Wochen Implantationszeit aus100. In einer weiteren Kalzifizierungsstudie von Schoen et al. über „Hancock ITM“ porcine Aortenklappenprothesen, implantiert in der Mitralklappenposition des juvenilen Schafmodells, wurde festgestellt, dass der Kalzifizierungsverlauf dem des Menschen mit gleichen Bioprothesen identisch war. In der Arterienwand konnten kleine, verteilte Mineralisierungspunkte dargestellt werden. Diese waren in späteren Stadien größeren markanten Verkalkungen gewichen. Frühe Verkalkungen wurden im Scheitelpunkt des Sinus und in der Basisregion der Tasche gefunden und zwar zuerst in der Lamina fibrosa der Valvulae und erst später auch in der Lamina spongiosa. Die Autoren fanden zudem Hinweise, die auf eine intrinsische und nicht auf eine extrinsische Verkalkung hindeuteten. Die Verkalkungen fanden demzufolge vermutlich ihren Ursprung in abgestorbenen Zellen und deren Zelltrümmern105.
2.9 Auswirkung des Alters auf das Regenerationspotential
Das Durchschnittsalter von Patienten, die einen Herzklappenersatz benötigen, beträgt 65 Jahre. Diesen Patienten wird eine Herzklappenprothese biologischer Herkunft empfohlen46,48, wodurch ihre Lebensdauer um bis zu 15 Jahre verlängert werden kann. Entscheidend ist auch, dass die Lebensqualität durch die gute Herzklappenfunktion und den Verzicht auf eine Koagulationstherapie in diesen 15 Jahren verbessert wird. Aus Tiermodellen mit juvenilen Schweinen31 und Schafen46 ist bekannt, dass die dezellularisierte Herzklappenmatrix mit autologen Zellen wiederbesiedelt wird. Diese Rebesiedelung mit körpereigenen, interstitiellen Zellen (Fibroblasten, Myofibroblasten, glatte Muskelzellen) wird als sehr positiv betrachtet, da diese Zellen zu Remodelingprozessen fähig sind und somit die langfristige Erhaltung der Matrix garantieren100. Alle zuvor erwähnten Tierversuche wurden in jungen Schafen oder in Schafen unbekannten Alters durchgeführt. Nun stellt sich die Frage, ob diese gewonnenen Erkenntnisse klinisch relevant sind. Bis heute ist nicht bekannt, ob autologe Zellen bei älteren Patienten noch potent zur Wiederbesiedelung von dezellularisierten Herzklappen sind.
Im Alter kommen degenerative Veränderungen vermehrt vor. Ein gesundes Gewebe kann sich fortlaufend selbstregenerieren, im Alter ist dieses Vermögen reduziert, dadurch können aufgetretene Schäden viel langsamer repariert werden106,107. Daher kann die Alterung eines Organismus als Unfähigkeit beschrieben werden, die Homöostase des Gewebes aufrechtzuerhalten.
Eine Erklärung zur Alterung ist z.B. die Freie-Radikale-Theorie. Der erhöhte oxidative Stress, der durch die Akkumulation von ROS (= Reactive Oxygen Species) in den Mitochondrien der Gefäßzellen entsteht, kann z.B. zu einer verstärkten Gefäßschädigung führen, welche im Alter zunimmt und eine Erklärung für die hohe Inzidenz der Aortenverkalkung in älteren Individuen darstellt108. Interessanterweise gibt es zudem eine Korrelation zwischen beeinträchtigter Telomerlänge und erhöhtem ROS-Gehalt. Neben der Telomerverkürzung ist auch zu beobachten, dass die Menge an Telomerase in den Zellen im Alter abnimmt109. In Leukozyten zum Bespiel nimmt die Telomerlänge zwischen 6 - 9% pro Dekade ab110. Dies führt zu einer fehlerhaften DNA-Replikation und somit zu DNA-Schäden.
Mesenchymale Stammzellen erfüllen eine wichtige Rolle in der Geweberegeneration, die auch bei der Rebesiedelung einer azellulären Matrix wichtig sein könnten. Mit zunehmendem Alter nehmen die Anzahl der Stammzellen und das Differenzierungspotential dieser Zellen in verschiedenen Geweben ab. So kommt es auch in adipösen Geweben zu einer Akkumulierung von nicht teilungsfähigen Stammzellen111.
3. Material und Methoden
Der Versuchsaufbau ist zusammenfassend in Abbildung 10 dargestellt.
Abbildung 10: Chronologische Darstellung des Versuchsaufbaus
3.1 Laborteil 1: Präoperative Vorbereitung
3.1.1 Dezellularisierung
Im Schlachthof von Hannover wurden aus Herzen von geschlachteten ausgewachsenen Schafen die Pulmonalklappen innerhalb von wenigen Minuten nach der Schlachtung herauspräpariert. Der Transport zum Labor erfolgte in eisgekühlter antibiotika- und fungizidhaltiger Phosphatpufferlösung (PBS+ = PBS mit Gentamycin, Patricin und Penicillin-Streptomycin). Die Pulmonalklappen wurden unter einer Sterilbank von Fett und größtenteils von der Tunica adventitia des
Truncus pulmonalis befreit. Bei der Präparation wurde ein Muskelring von 1 cm Breite proximal der Klappe und ein Arterienring von ca. 3 cm Länge distal der Klappe zum späteren Einnähen in das Bioreaktorsystem und für die Implantation belassen.
Der Dezellularisierungsvorgang basierte auf dem Protokoll von Lichtenberg et al.63. Alle Waschschritte des Dezellularisierungsverfahrens wurden in Flaschen mit 250 ml Füllvolumen vorgenommen. Die Glaswand der Flaschen wurde vorher in den Forschungswerkstätten der Medizinischen Hochschule Hannover mit Beulen versehen, welche für stärkere Turbulenzen der Flüssigkeit sorgten. Die Pulmonalklappen standen in diesen Flaschen während des Verfahrens auf einem Orbitalschüttler, welcher ein kontinuierliches Schütteln der Klappen bei 200 U/min und 24°C ermöglichte. Die bei der Dezellularisierung verwendeten Lösungen wurden unter sterilen Bedingungen in einer Sterilbank gewechselt.
Um die Keimbelastung der freipräparierten Pulmonalklappen zu reduzieren, wurden diese 5 Minuten lang in jodhaltiger Lösung auf dem Orbitalschüttler gewaschen. Es folgte ein Waschschritt mit PBS+ für 20 Minuten. Die Pulmonalklappen wurden dann 24 Stunden in der Detergentienlösung auf dem Orbitalschüttler gespült, wobei die Lösung nach 12 Stunden durch frische Detergentienlösung ersetzt wurde. Bei der Herstellung der Dezellularisierungslösung wurde 5 g Natriumdeoxycholat und 5 g Natriumlaurylsulfat in 1 l PBS gelöst. Vor der Nutzung wurde sie mittels eines Sterilfilteraufsatzes steril filtriert. Um einen großen Teil der Detergentien und der Zelltrümmer zu entfernen, folgten 2 Waschschritte à 12 Stunden mit deionisiertem Wasser. Die verbliebenen Detergentienreste und die Zellreste im Gewebe wurden in 12 Waschzyklen für jeweils 12 Stunden mit PBS+ herausgespült. Ein letzter Waschritt erfolgte mit PBS ohne Antibiotika. 1 ml aus der Lösung des letzten Spülschrittes jeder Herzklappe wurde mit 9 ml eines einfachen Mediums (in diesem Fall „Medium 199“ von Lonza) für mindestens 24 Stunden bei 37°C und 160 U/min inkubiert. Anschließend wurde eine Probe mikroskopisch auf Pilze und bakteriellen Befall untersucht. Nur Herzklappen, die keine Anzeichen von Verunreinigungen in dieser Sterilkontrolle zeigten, wurden weiterverwendet.
Zudem wurde eine Probe des Truncus pulmonalis aus jeder dezellularisierten Herzklappe steril entnommen und in Tissue Tek® eingebettet. Von dieser Probe wurden mit dem Kryotom 7 µm dicke Schnitte angefertigt. Die Schnitte wurden mit HE gefärbt. Beim Nachweis von Zellkernen oder Zellresten im Gewebe der Probe wurden die jeweiligen Pulmonalklappen nicht als Implantate verwendet, weil deren
Dezellularisierung in dem Fall als nicht erfolgreich angesehen wurde. Eine Matrix mit vielen Zellresten könnte bei Implantation eine stärkere immunologische Reaktion bewirken als vollständig dezellularisiertes Gewebe.
Die vollständig dezellularisierten Pulmonalklappen wurden in PBS+ bei 4°C bis zur Implantation bzw. Einnähen in das Bioreaktorsystem gelagert.
Die Reagenzien und Materialien, die für die Dezellularisierung verwendet wurden, sind in Tabelle 1 und 2 dargestellt.
Tabelle 1: Reagenzien für die Dezellularisierung
Reagenz Firma (Ort,
Land)
Artikel- nummer
Produkt- konzentration
Angewendete Verdünnung Earles Medium 199 PAA (Pasching
Austria)
E-15-003 Fertigkonzentration Fertigkonzentration Gentamycin Biochrom
(Berlin, Deutschland)
A2712 10 mg/ml 10 ml in 1l PBS = 1%
Natriumdeoxycholat Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)
D670- 550G
Reinsubstanz 5 g
Natriumdeoxycholat und 5g Natrium- Natriumdlaurylsulfat Carl Roth
(Karlsruhe, Deutschland)
4360,2 Reinsubstanz laurylsulfat in 1 l deionisiertes Wasser = 1%
Patricin Biochrom
(Berlin, Deutschland)
A2812 50 µg/ml 10 ml in 1l PBS = 1%
Penicillin- Streptomycin
Biochrom (Berlin, Deutschland)
A2212 10 mg/ml 10 ml in 1l PBS = 1%
Phosphatpufferlösun g (PBS)
Biochrom (Berlin, Deutschland)
L182-05 Reinsubstanz 9,55 g in 1 l deionisiertes Wasser
Tabelle 2: Sonstige Materialien für die Dezellularisierung
Handelsname Firma Artikelnummer Sonstiges
Sterilfilteraufsatz TPP
(Trasadingen, Schweiz)
8479 Porengröße 0,45 µm
3.1.2 Isolierung endothelzellähnlicher Zellen (ECs) aus peripherem ovinen Blut
Aus Gründen der Optimierung wurden die folgenden zwei Protokolle zur Isolierung genutzt:
1. Vier Schafen der Gruppe 3 (#356, #355, #382, #349) wurden circa 40 ml Blut aus der Vena saphena oder der Vena jugularis in Citrat-Blutentnahmeröhrchen entnommen. In je einem 50 ml-Röhrchen mit 15 ml vorgelegter „Biocoll Separating Solution“, als Gradienthilfsmittel, wurden 10 ml Blut vorsichtig überschichtet. Nach der Zentrifugation bei 800x g für 20 Minuten wurde die weiße, mononukleäre Phase entnommen und mit PBS auf ein Endvolumen von 35 ml gebracht. Die Lösung wurde erneut für 10 Minuten bei 800x g zentrifugiert. Nachdem der Überstand dekantiert wurde, wurde das Pellet mit 5 ml Endothelzelldifferenzierungsmedium (supplementiertes EGM) resuspendiert und in 25 cm2 Zellkulturflaschen, welche mit Gelatine (1%) beschichtet waren, gegeben.
2. Bei zwei Schafen der Gruppe 3 (#5685, #7702) wurde mittels eines venösen Zugangs 100 ml Blut aus der Vena jugularis entnommen. Zur Gerinnungshemmung des Blutes wurden 100 I.E Heparin/ ml Blut in den Blutentnahmespritzen vorgelegt.
Zur Isolierung der mononukleären Phase wurde kein Gradientenhilfsmittel benutzt.
Nach zwei Zentrifugationsschritten wurde das Isolat aus 50 ml Blut mit 5 ml Endothelzelldifferenzierungsmedium in eine mit Gelatine (1%) beschichtete, 75 cm2 große Zellkulturflasche gegeben.
Unabhängig der Zellisolationsmethode erfolgte die Kultur der Zellen bei 38°C und 5%
CO2 bis zur Ausdifferenzierung von Zellkolonien endothelzellähnlichen Phänotyps.
Zum Passagieren der Zellen wurden die Zellen vorsichtig mit PBS gespült, anschließend mit 3 ml TrypLETM Select benetzt und für circa 3 Minuten bei 38°C inkubiert. Anschließend wurden 12 ml Stoppmedium hinzugefügt und damit die Zellkulturflasche gründlich gespült. Die Zelllösung wurde für 10 Minuten bei 1200 rpm und 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 30 ml Endothelzelldifferenzierungsmedium resuspendiert. In drei mit Gelatine beschichteten, 75 cm2 große Zellkulturflaschen wurden 10 ml Zelllösung gegeben.
Von jeder Passage gab es demzufolge drei 75 cm2 große Zellkulturflaschen. Beim Erreichen der Konfluenz wurde nur eine der Zellkulturflaschen in der oben beschriebenen 1:3 Methode passagiert.
Die Zellen der zweiten Flasche wurden zur Reserve eingefroren. Dazu wurde anfangs wie beim Passagieren der Zellen verfahren. Nach dem Zentrifugationsschritt wurde das Pellet in 1 ml Einfriermedium (enthält fetales bovines Serum = FCS und Dimethylsulfoxid = DMSO) aufgelöst, um die intrazelluläre Bildung von Eiskristallen zu verhindern, und anschließend in Einfrierröhrchen eingefüllt. Nach mindestens 24 Stunden in einem Einfrierbehälter bei -80°C wurden für eine längere Lagerung die Einfrierröhrchen über flüssigem Stickstoff bei -180°C überführt.
Die Zellen der dritten Flasche wurden für eine mögliche Genexpressionsanalyse in Trizol aufgenommen. Beim Aufnehmen der ECs in Trizol wurden die Zellen nach einem Waschschritt mit PBS mit 1 ml Trizol benetzt. Mit einem Zellschaber wurden die Zellen von der Flaschenoberfläche abgekratzt, um dann die ECs im Trizol in einem 1,5 ml Eppendorfreaktionsgefäß zu überführen. Anschließend wurden sie bei - 80°C gelagert.
Während die Zusammensetzung des Endothelzellmediums, Stopmediums und Einfriermediums in Tabelle 3 beschrieben wird, sind die Reagenzien, die für die Zellkultivierung benutzt wurden, in Tabelle 4 und 5 dargestellt. Alle verwendeten Zentrifugen, Brutschränke und Sterilbänke werden unter Punkt 9.1 angegeben.
Tabelle 3: Zusammensetzung der Lösungen für die ECs-Kultivierung
Endothelzell- differenzierungs- medium
Zu einer Flasche EBM-2 Medium wurden aus dem EGB Supplementierungspäckchen folgende Substanzen dem Medium zugefügt:
Hydrokortison, humaner Fibroblastenwachstumsfaktor (hFGF), vaskulärendothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), IgG-1, humaner EGF, Heparin, Ascorbinsäure.
Zusätzlich wurden 50 ml fetales bovines Serum, 5 ml Penicillin/Streptomycin und 5 ml Patricin zugegeben.
Stopmedium In 500 ml Earles Medium 199 wurden 100 ml fetales bovines Serum und 5 ml Penicllin/Streptomycin zugefügt.
Einfriermedium 9 ml fetales bovines Serum wurden mit 1 ml DMSO gemischt.
Tabelle 4: Reagenzien für die EC-Kultivierung
Reagenz Firma (Ort, Land) Artikelnummer Angewendete Verdünnung Biocoll Separating
Solution Biochrom (Berlin, Deutschland) L6615 Fertigkonzentration;
Dichte: 1,007 g/ml DMSO Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) D8418-100ml 10%
Earles Medium 199 PAA (Pasching, Österreich) E-15-003 Ohne L-Glutamin Earles Medium 199 PAA (Pasching, Österreich) E-15-003 Ohne L-Glutamin EBM-2 Medium Lonza (Basel, Schweiz) CTM-3241 Fertigkonzentration EGM-2
Zusatzpäckchen Lonza (Basel, Schweiz) CTM-4176 Fertigkonzentration Fetales bovines Serum Promocell (Heidelberg,
Deutschland) C37360 50 mL in 500 ml
Medium = 10%
Gelatine Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) G2500-100G 1%
Patricin Biochrom (Berlin, Deutschland) A2812 5 ml in 500 ml Medium Penicillin/ Streptomycin Biochrom (Berlin, Deutschland) A2213 5 ml in 500 ml Medium PBS Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) P4417-100TAB 2 Tabletten in 400 ml
deionisiertes Wasser Trizol Invitrogen (Carlsbad, USA) 15596-026 Fertigkonzentration TrypLETM Select Gibco Life Technologies
(Carlsbad, USA) 12563 Fertigkonzentration
Tabelle 5: Sonstige Materialien für die EC-Kultivierung
Handelsname Firma (Ort, Land) Artikelnummer
Zellkulturflasche 25 cm2 Bluefiltercap Nunc (Wiesbaden
Deutschland) 156367
Zellkulturflasche 75 cm2 Bluefiltercap Nunc (Wiesbaden
Deutschland) 156499
Einfriergefäß Thermo Scientific Nalgene (Waltham,
USA) 5100-0001
3.1.3 Immunfluoreszenzfärbungen der kultivierten ovinen Zellen
Zum Nachweis des endothelähnlichen Charakters der kultivierten Zellen wurden diese gegen endothelzelltypische Marker mittels Immunfluoreszenz angefärbt112. Die isolierten ECs wurden für mindestens 24 Stunden in einer 24-well-Platte kultiviert, wobei die einzelnen Kulturkammern mit Gelatine (1%) beschichtet waren. Mit Antikörpern wurden folgende Epitope nachgewiesen: 1. das membranständige CD31, 2. das VE-Cadherin, welches in Zell-Zell-Verbindungen vorkommt, und 3. der vWF, welcher sich in den sogenannten Weibel-Palade-Körperchen des Zytoplasmas befindet71. Während bei den Färbungen gegen CD31 und VE-Cadherin alle Lösungen mit PBS verdünnt wurden, mussten für den Nachweis von vWF in den Färbelösungen Detergentien (Triton X-100 und Tween®20) benutzt werden, um die Zellmembran zu permeabilisieren112. Die Zusammensetzung der Lösungen für die Immunfluoreszenzfärbung ist in Tabelle 6 beschrieben.
Im ersten Schritt wurden die Zellen dreimal mit PBS vorsichtig gespült. Anschließend wurden sie mit Paraformaldehyd (PFA) (2%) 20 Minuten lang fixiert. Nach drei Spülschritten mit PBS wurden die Zellen für 40 Minuten mit Eselserum (2%) blockiert. Anschließend wurde der Primärantikörper in die Kulturkammern mit den Zellen gegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Ungebundene Primärantikörper wurden am nächsten Tag mittels dreier Waschschritte mit PBS ausgespült. Der Sekundärantikörper wurde in einer Verdünnung von 1:200 für 2 Stunden im Dunkeln inkubiert und anschließend in drei Waschschritten ausgespült. Die Zellkerne wurden in 10 Minuten mittels DAPI angefärbt. Nach drei weiteren Spülschritten wurden die Zellen für die mikroskopische Bewertung mit Fluoreszenzbedeckungsmedium benetzt. Zum Schluss wurden mikroskopische Bilder angefertigt. Hierfür wurden ein Mikroskop und eine Kamera der Firma Zeiss benutzt (Punkt 9.1). Die verwendeten Antikörper, Reagenzien und weitere Materialien sind in den Tabellen 7, 8 und 9 dargestellt.
