Immunfluoreszenzfärbungen

Immunfluoreszenzfärbungen wurden gegen Matrixproteine und bestimmte Zellmarker durchgeführt. Jede Färbung wurde mindestens zwei Mal je explantiertem Allograft durchgeführt. Zur Untersuchung der ECM-Integrität wurde gegen Kollagen Typ I gefärbt. Mittels der Darstellung des Kollagens Typ IV, einem Hauptbestandteil der Basallamina, konnte die Basallamina auf Vollständigkeit untersucht werden. Für die Identifizierung von Endothelzellen wurden Antikörper gegen vWF und eNOS verwendet. Vimentin gilt als Marker für Zellen mesenchymalen Ursprungs und der Antikörper färbt gleichermaßen Fibroblasten, Myofibroblasten und glatte Muskelzellen²⁸. Während sm α-actin ein Marker von Myofibroblasten und glatten Muskelzellen ist, wird MHY11 von differenzierten kontraktilen glatten Muskelzellen exprimiert^29,32. CD45¹¹⁹, wurde für die Identifizierung von immunologischen Zellen verwendet. Da die ECM⁶⁴ und somit die Kollagene Typ I und IV die Dezellularisierung der Pulmonalklappen in der Regel unbeschadet überstehen, wurde mittels Immunfluoreszenzfärbung Prokollagen Typ I gefärbt, um die Synthese von neuem, autologem Kollagen in den Allografts zu untersuchen. Dieses ist intrazellulär enthalten. Da dezellularisiertes Gewebe keine intakten stoffwechselaktiven Zellen enthielt, wurde vorausgesetzt, dass nur autologe Zellen in den Allografts der vorliegenden Studie positiv für Prokollagen Typ I sein könnten.

3.3.5.1 Durchführung der Immunfluoreszenzfärbungen

Die Immunfluoreszenzfärbungen wurden an kryokonservierten, 6 µm dicken Schnitten durchgeführt. Die Präparate waren in TissueTek eingebettet. Die Schnitte aus den nativen Pulmonalklappen und den Implantaten wurden in longitudinaler Richtung hergestellt und enthielten einen Anteil der Tasche, des arteriellen Sinus und der Arterie, wie in Abbildung 2 dargestellt. Die angefertigten Schnitte wurden bei -80°C gelagert.

Die Färbung wurde in einer feuchten Kammer unter Ausschluss von direkter Lichteinstrahlung basierend auf dem Protokoll von Frau Maike Braun durchgeführt¹¹³. Bei jeder durchgeführten Immunfluoreszenzfärbung wurden neben den zu färbenden Schnitten auch Positivkontrollen (= Färbung von ovinem Material, auf welchem die

Färbung funktionieren müsste, in den meisten Fällen native Pulmonalklappen, die im Schlachthof entnommen wurden) und Isotypkontrollen (= anstelle der Inkubation mit dem Primärantikörper wird ovines Material, auf dem die Färbung funktionieren müsste, mit dem Immunglobulinisotypen des Primärantikörpers, gewonnen aus der selben Spezies und in der gleichen Konzentration inkubiert) durchgeführt. Die Positiv- und Isotypkontrollen aller verwendeten Primärantikörper sind im Anhang in den Abbildung 45, 46, 47 und 48 dargestellt.

Zur Fixierung wurden die Objektträger mit den Schnitten direkt in Aceton bei -20°C für 4 Minuten getaucht. Die Schnitte wurden dann mit einem Pap Pen umrandet und anschließend dreimal für jeweils 5 Minuten in PBS getaucht. Die Schnitte wurden mit einer Serumlösung (10%) der Tierspezies, aus der der Sekundärantikörper gewonnen wurde, für 30 Minuten geblockt, um unspezifische Bindungen zu verhindern. Bei Färbungen von Epitopen, die sich intrazellulär befinden (vWF, eNOS, Prokollagen Typ I), enthielt die Serumlösung zusätzlich Triton X-100 (Endkonzentration: 0,025%), um die Zellmembran zu permeabilisieren.

Nach Entfernen der Serumlösung wurde der Primärantikörper auf die Präparate pipettiert und bei 4°C über Nacht inkubiert. Zur Kontrolle wurde an Stelle des Primärantikörpers eine Immunglobulinprobe der Tierspezies, aus der der Primärantikörper gewonnen wurden, inkubiert, in der selben Konzentration, wie der aufgetragene Primärantikörper. Nach drei Spülschritten in PBS für jeweils 5 Minuten wurde der Sekundärantikörper (1:200 verdünnt) aufgetragen und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Objektträger wurden erneut dreimal für jeweils 5 Minuten in PBS getaucht. Nachdem DAPI (1:15.000 verdünnt) auf den Schnitten für 15 Minuten aufgetragen wurde und die Schnitte anschließend dreimal mit PBS gespült wurden, wurden die Schnitte mit „Fluorescent mounting medium“ benetzt und mit Deckgläschen eingedeckt. In Tabelle 26 ist die Herstellung der Lösungen beschrieben. In Tabelle 27 sind alle nötigen Reagenzien für die Immunfluoreszenzfärbungen aufgelistet, während in den Tabelle 28 und 29 alle verwendeten Primärantikörper, deren verwendete Konzentration, Isotypkontrollen und Sekundärantikörper zu finden sind. Bis zur mikroskopischen Betrachtung wurden die Objektträger bei 4°C im Dunklen gelagert. Die Mikroskopische Auswertung erfolgte an einem Observer Mikroskop der Firma Zeiss gekoppelt an eine HXP120-Halogendampflampe (Kübler). Die Geräte sind unter Punkt 9.1 aufgelistet. Bilder der

gefärbten Schnitte wurden mit Hilfe des Softwareprogramms von Axiovision (Zeiss) und Objektiven mit einer 4-, 10-, 20-, und 40-fachen Vergrößerung aufgenommen.

Tabelle 26: Herstellung der Lösungen für die Immunfluoreszenzfärbungen

Serumlösung 100µl Eselserum wurden in 900 µl PBS hinzugegeben.

Färbelösung mit Primärantikörper

Der Primärantikörper wurde in PBS im Verhältnis wie unter Tabelle 29 beschrieben verdünnt.

Färbelösung mit Sekundärantikörper (membranständig)

1 µl einer Stocklösung (2 µg/ml) wurde in 199 µl PBS gegeben.

Färbelösung mit dem Sekundärantikörper (intrazellulär)

25 µl Triton X- 100 wurden in 10 ml PBS gelöst. In 199 µl dieser Lösung wurde 1 µl einer Stocklösung mit dem Sekundärantikörper (2 µg/ml) gegeben.

DAPI-Färbelösung 1 µl einer DAPI-Stocklösung (5 µg/ml) wurde in 15 ml PBS gelöst.

Tabelle 27: Reagenzien für die Immunfluoreszenzfärbungen

Reagenz Firma (Ort, Land) Artikelnummer

Aceton J.T. Baker (Phillipsburg, USA) 8002

AlexaFluor®488-konjugiertes Esel anti Kaninchen IgG

Dianova, Jackson (West Grove,

USA) 711-166-151

Cy3-konjugiertes Esel anti Maus IgG Dianova, Jackson (West Grove,

USA) 715-165-151

Cy3-konjugierten Esel anti Kaninchen IgG

Dianova, Jackson (West Grove,

USA) 711-166-152

DAPI Invitrogen (Carlsbad, USA) D1306

Eselserum Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) D9663

Fluorescent Mounting Medium Dako (Glostrup, Denkmark) S3023 Kaninchen polyklonales IgG Abcam (Cambridge, UK) ab27478 Negativkontrolle Maus IgG1 Dako (Glostrup, Denkmark) X0931 Negativkontrolle Maus IgG2a Dako (Glostrup, Denkmark) X0943

Pap Pen Kisker Biotech (Steinfurt,

Deutschland) MKP-1

PBS Biochrom (Berlin, Deutschland) L182-05

TritonX-100 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 387-0548

Tabelle 28: Verwendete Antikörper für die Immunfluoreszenzfärbungen Teil I

Antigene Struktur Firma (Ort, Land) Artikelnummer Immunglobulin-gruppe

IgG-Konzentration eNOS BD Biosciences

(Franklin Lakes, USA) 610297 Maus IgG1 250 mg/L CD45 AbD Serotec Bio-Rad

(Hercules, USA) MCA2220 Maus IgG1 1 mg/ml

Kollagen Typ I Sigma-Aldrich (St. Louis,

USA) C2456 Maus IgG1 7,4 mg/ml

Kollagen Typ IV Dako (Glostrup,

Denkmark) M0785 Maus IgG1 80 mg/L

Sm myosin heavy

chain 11 (MYH11) Abcam (Cambridge, UK) ab53219 Kaninchen

polyclonal 2 mg/mL Prokollagen Typ I Hybridoma Bank (Iowa,

USA) M38 Maus IgG1 Tabelle 29: Verwendete Antikörper für die Immunfluoreszenzfärbungen Teil II

Antigene Struktur verwendete

3.3.5.2 Auswertung der neuen luminalen Endothelschicht

Die vWF-Färbung wurde genutzt, um die Konfluenz und Ausbreitung einer möglichen neuen Endothelzellschicht auf der luminalen Oberfläche der Implantate auszuwerten.

Diese Methode basiert auf dem Auswertungsschema von Baraki et al.⁶¹. Allerdings wurden die Konfluenz und Ausbreitung der vWF-positiven Zellschicht auf der Klappenwand, dem Scheitelpunkt des Sinus und der Tasche (arterielle und ventrikuläre Seite separat) einzeln beurteilt (Tabelle 30). Die Summe wurde zum Vergleich herangezogen.

Tabelle 30: Bewertungsschema der Konfluenz der vWF-positiven Zellschicht auf der Tasche Konfluenz (separat für 1. Klappenwand, 2. Scheitelpunkt, 3. arterielle

Taschenseite und 4. ventrikuläre Taschenseite) Punkte

Keine Zellen mit positivem Signal 0

bis 50% der luminalen Fläche mit positiven Zellen bedeckt 1 über 50% der luminalen Fläche mit positiven Zellen bedeckt 2

vollständig bedeckt mit 100% Konfluenz 3

maximal zu erreichende Summe (des ganzen Allografts) 4 x 3 = 12