3. Material und Methoden
3.3 Laborteil 2: Aufbereitung der explantierten Allografts
3.3.2 MosaiX-Aufnahme einer Tasche gefärbt mit Phalloidin und DAPI und
Die angefärbte Tasche wurde am Scheitelpunkt des Sinus (siehe Abb. 2) von der Klappenwand getrennt und auf einen Objektträger gelegt, wobei die ventrikuläre Seite nach oben und die arterielle Seite nach unten zeigte. Mit Hilfe eines elektrischen Tisches gekoppelt an ein Mikroskop Z1 der Firma Zeiss und der MosaiX-Software (Axiovision, Carl Zeiss) konnte eine Aufnahme der gesamten Tasche aus mehreren mikroskopischen Bildern zusammengesetzt werden. Diese Geräte sind im Geräteverzeichnis im Abschnitt 9.1 zu finden.
Zuerst wurde eine Übersichtsaufnahme der Tasche in geringer Qualität mit Durchlicht gemacht. Anhand dieses Bildes wurde die Fläche, die fotografiert werden sollte, genau definiert. Um die Falten und die unterschiedliche Taschendicke auszugleichen, wurden eine große Anzahl von Fokuskorrekturpunkten manuell festgelegt, verteilt auf der gesamten Oberfläche. Für das im grünen Kanal sichtbare Phalloidinsignal wurde mit dem passenden Filter in einer Wellenlänge von 470 nm angeregt. Die Belichtungszeit lag im Durchschnitt bei 600 ms. Die im blauen Kanal sichtbare DAPI-Kernfärbung wurde mit einer Wellenlänge von 360 nm angeregt und bei einer Belichtungszeit von circa 300 ms aufgenommen. Für die Anfertigung der mikroskopischen Einzelbilder wurde das 10x Objektiv benutzt.
Es wurde jeweils eine MosaiX-Aufnahme von der arteriellen Taschenoberfläche und eine Aufnahme von der ventrikulären Taschenoberfläche gemacht.
Um die Allografts der verschiedenen Tiergruppen bezüglich der Bedeckung der Tasche mit Zellen zu vergleichen, wurde die gesamte Taschenoberfläche mittels des Software „ImageJ“ berechnet. Daraufhin wurde die Fläche der Tasche ebenfalls mittels „ImageJ“ gemessen, die tatsächlich mit Zellen besiedelt war. Da diese Bereiche nicht immer eine konfluente Zellschicht aufwiesen, wurde die Fläche nochmal herunterkorrigiert in Abhängigkeit zur Konfluenz. Letztendlich konnte der Anteil der mit Zellen bedeckten Fläche prozentual zur gesamten Taschenoberfläche errechnet werden. Für die statistische Auswertung und die Erstellung der Diagramme wurde das Softwareprogramm GraphPad Prism Version 5.a verwendet. Der Einfaktorielle-Anova und die Bonferroni-Methode wurden benutzt, um die statistische Signifikanz zu errechnen.
3.3.3 Entwässerung und Einbettung der explantierten Präparate in Paraffin
Die Entwässerung und Einbettung der explantierten Gewebeproben erfolgte ähnlich dem Protokoll von Beckstead et al.117. Nach einer Fixierungsdauer von mindestens 24 Stunden in Formaldehyd wurden die Implantate zweimal für 30 Minuten in deionisiertem Wasser gespült. Anschließend wurden sie in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert. Sie kamen jeweils zweimal für 30 Minuten in 25% und in 50% Ethanol. Die weiteren Entwässerungschritte wurden maschinell durch einen Automaten der Firma Leica durchgeführt. Die explantierten Proben kamen zweimal für jeweils 30 Minuten in 75% und anschließend ebenfalls zweimal für jeweils 30 Minuten in 90% Ethanol. Nach zweimal in 95% Ethanol für 45 Minuten, folgten zwei Schritte in 100% 2-Propanol für jeweils 45 Minuten und wurden daraufhin wieder zweimal jeweils für 45 Minuten in Roticlear gegeben. Letztendlich kamen die Präparate erstmal für sechs Stunden und dann ein zweites Mal für 24 Stunden in flüssiges Paraffin. Erst dann waren die Präparate bereit, in Paraffin eingebettet zu werden. In einem Paraffineinbettungsautomaten namens „Histocentre“ (Shandon) wurden die Präparate in quadratischen Gießformen langsam mit flüssigem Paraffin übergossen und konnten anschließend auf einer Kälteplatte aushärten. In Tabelle 18 sind die Reagenzien für die Entwässerung dargestellt.
Tabelle 18 : Reagenzien für die Entwässerung
Reagenz Firma Artikelnummer
Ethanol vergällt BÜFA Chemikalien (Oldenburg,
Deutschland) 10002723004
2-Propanol Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland) CP41.2 Roticlear Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland) A538.5
An einem Mikrotom (Rotationsmikrotom 2040, Reichert-Jung) wurden Paraffinschnitte mit einer Dicke von 6 µm angefertigt. Im Fall der eingebetteten Pulmonalklappen wurden die Schnitte in longitudinaler Richtung angefertigt und enthielten einen Teil mit Tasche, Klappenwand und Arterie (Abb. 2). Die Schnitte wurden auf die Oberfläche von 38°C-warmen Wasser gelegt und anschließend auf Objektträger, welche mit Glycerin benetzt waren, gezogen. Zum Trocknen wurden die Objektträger über Nacht auf einer Wärmeplatte (40°C) gelagert. Alle verwendeten Geräte sind unter Punkt 9.1 aufgelistet.
3.3.4 Histologische Färbungen
Um die Lokalisation und das Ausmaß der Rebesiedelung mit autologen Zellen darzustellen, wurde eine HE-Färbung genutzt. Die Versilberung nach Kossa wurde verwendet, um mineralisierte Areale in den Implantaten zu identifizieren.
Mineralisierung bzw. Kalzifizierungen sind ein Indiz für immunologische Reaktionen auf das Implantat. Um die ECM auf mögliche autolytische Geschehen und auf ihre Integrität zu untersuchen, wurden die Allografts nach der Pentachromfärbung nach Movat gefärbt. Hierdurch lassen sich GAGs, elastische und kollagene Fasern deutlich darstellen. Die Integrität der Klappenwand und vor allem der Taschen sind unerlässlich für die langfristige Belastung und Funktionstüchtigkeit der Implantate.
Die HE-Färbung wurde an vier Paraffinschnitten pro Allograft durchgeführt. Die Färbung nach von Kossa und die Pentachromfärbung wurden jeweils an zwei Paraffinschnitten pro Allograft durchgeführt.
3.3.4.1 Vorbereitung
Vor der eigentlichen histologischen Färbung wurde das Paraffin von den Schnitten entfernt und die Schnitte rehydriert.
Damit das Paraffin schmilzt, wurden die Schnitte für mindestens 30 Minuten bei 60°C in einem Wärmeschrank gelagert. Es folgten zwei Schritte in Xylol für jeweils 10 Minuten. In einer abnehmenden Alkoholreihe mit jeweils zwei Minuten in 100%, 90%, 80% und 70% Ethanol wurden die Schnitte rehydriert113. Nach einem kurzen Waschschritt in deionisiertem Wasser konnte mit der entsprechenden histologischen Färbung begonnen werden. In Tabelle 19 sind Materialen, die für die Paraffinentfernung und Rehydrierung benutzt wurden, sowie Materialien, die in allen folgenden histologischen Färbungen verwendet wurden, aufgelistet.
Tabelle 19: Sonstige Materialien für histologische Färbungen
Reagenz Firma Artikelnummer
Corbit Balsam Einschlussmedium Hecht (Kiel, Deutschland)
Deckgläschen Thermo Scientific (Waltham, USA) 21433 Ethanol vergällt BÜFA Chemikalien (Oldenburg,
Deutschland) 10002723004
Objektträger Thermo Scientific (Waltham, USA) ISO 8037/1
Xylol J.T. Baker (Phillipsburg, USA) 8118
3.3.4.2 Hämalaun-Eosin-Färbung (HE-Färbung)
Die entparaffinisierten und rehydrierten Schnitte kamen für 8 Minuten in die Hämalaunlösung (Tab. 20). Anschließend wurden die Schnitte in fließendem Leitungswasser für 10 Minuten gespült. Dann wurden sie in die Eosinfärbelösung (Tab. 20) für 5 Minuten überführt. Nach einem Spülschritt in deionisiertem Wasser, wurden die Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe mit 80%, 90% und 100%
Ethanol für jeweils 2 Minuten erneut entwässert61, 64, 113. Nach 2 Schritten für jeweils 5 Minuten in Xylol wurden die Schnitte mittels Corbit-Balsam Einschlussmedium und einem Deckgläschen eingedeckt. In Tabelle 20 ist das Herstellen der Lösung beschrieben und in Tabelle 21 sind die Reagenzien für die HE-Färbung dargestellt.
Sonstige Reagenzien sind in Tabelle 19 zu finden.
Durch die Färbung der Zellkerne mit Hämalaun wurden diese blau dargestellt. Eosin sorgte für die rosa Färbung von Zytoplasma und ECM.
Tabelle 20: Herstellen der Lösungen für die modifizierte Hämalaun-Eosin-Färbung
Hämalaun Gebrauchsfertig
Eosinfärbelösung In 200 ml deionisiertem Wasser wurden 1 Tropfen Essigsäure (100%) und 0,2 g Eosin gelöst.
Tabelle 21: Reagenzien für die modifizierte Hämalaun-Eosin-Färbung
Reagenz Firma (Ort, Land) Artikelnummer
Eosin Merck (Darmstadt, Deutschland) 1.159.350.025
Essigsäure Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland) 3738.2
Hämalaun Merck (Darmstadt, Deutschland) 1-09249.0500
3.3.4.3 Versilberung nach von Kossa
Die Färbung nach von Kossa61,113 erfolgte unter gleichbleibenden Lichtverhältnissen.
Die Objektträger mit den Schnitten wurden nach der Paraffinentfernung und Rehydrierung für 15 Minuten in Silbernitratlösung (5%) inkubiert und anschließend dreimal 3 Minuten lang in deionisiertem Wasser gespült. Zur Reduzierung wurden sie in eine Natriumkarbonat-Formaldehydlösung für 2 Minuten getaucht. Nach 10 Minuten wässern unter fließendem Leitungswasser wurden die Schnitte noch einmal in deionisiertem Wasser für 3 Minuten gewaschen und anschließend mit der Kernechtrotaluminiumsuflatlösung für 10 Minuten gefärbt. Einem abschließenden Waschschritt mit deionisiertem Wasser folgte die Entwässerung in aufsteigender Alkoholreihe (50%, 70%, 90%, 100% Ethanol, für jeweils 2 Minuten). Die Objektträger wurden zweimal für eine Dauer von jeweils 5 Minuten in Xylol getaucht.
Abschließend wurden die Schnitte mit Corbit-Balsam benetzt und mit Deckgläschen eingedeckt. In Tabelle 22 wird das Herstellen der Lösungen und in Tabelle 23 die dafür verwendeten Reagenzien beschrieben.
Mineralisierungen wurden schwarzbraun angefärbt, während die Kerne rot dargestellt wurden.
Tabelle 22: Herstellen der Lösungen für die Versilberung nach von Kossa
Silbernitratlösung (5%) 12,5 g Silbernitrat wurden in 250 ml deionisiertem Wasser gelöst.
Natriumkarbonat-Formaldehydlösung
In 150 ml deionisiertem Wasser wurden 50 ml Formaldehyd (37%) und 10 g Natriumkarbonat gegeben.
Natriumthiosulfatlösung 12,5 g Natriumthiosulfat wurden in 250 ml deionisiertem Wasser gelöst.
Kernechtrot-Aluminiumsulfat
10 g Aluminiumsulfat wurden in 200 ml deionisiertem Wasser gelöst.
Diese hergestellte 5%ige Aluminiumsulfatlösung wurde zum Kochen gebracht und mit 0,2 g Kernechtrot-Trockensubstanz versetzt. Nach dem Erkalten wurde die Lösung filtriert.
Tabelle 23: Reagenzien für die Versilberung nach von Kossa
Reagenz Firma (Ort, Land) Artikelnummer
Aluminiumsulfat Merck (Darmstadt, Deutschland) 101.102 Formaldehyd 37% Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland) 4979.1
Kernechtrot Chroma (Müster, Deutschland) 1A402
Natriumkarbonat Merck (Darmstadt, Deutschland) 1.063.920.500 Natriumthiosulfat Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 31,954-6 Silbernitrat Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland) 9370.1
3.3.4.4 Pentachromfärbung nach Movat
Für die Pentachromfärbung nach Movat61,64,113 wurden die Lösungen wie in Tabelle 24 angefertigt, wofür die Reagenzien in Tabelle 25 verwendet wurden. Zu Beginn wurden die Schnitte 10 Minuten in Alcianblau gefärbt, um anschließend für 5 Minuten unter tropfendem Leitungswasser gespült zu werden. Die Stabilisierung in alkalischem Ethanol dauerte 60 Minuten. Nach Spülen in fließendem Leitungswasser für 10 Minuten wurden die Schnitte nochmals kurz in deionisiertem Wasser gewaschen. Die Inkubation in Weigerts Eisenhämatoxylin dauerte 10 Minuten. Nach einem erneuten Spülschritt in deionisiertem Wasser mit anschließendem Wässern in Leitungswasser für 15 Minuten erfolgte die Färbung in Brilliant-Crocein-Säurefuchsin, die 15 Minuten dauerte. Die Schnitte wurden kurz in Essigsäure (0,5%) eingetaucht und dann zur Differenzierung in Phosphorwolframsäure (5%) für 20 Minuten gegeben. Erneut wurden die Schnitte in Essigsäure (0,5%) für 2 Minuten gespült.
Nach dreimal 5 Minuten in Ethanol (100%), wurden die Schnitte 60 Minuten lang unter Ausschluss von Licht in Saffron du Gatinais gefärbt. Die Objektträger wurden dreimal kurz in Ethanol (100%) getaucht und kurz in Xylol gespült. Am Ende wurde die Schnitte mit Eukitt und Deckgläschen eingedeckt. Das Eisenhämatoxylin sorgte für die rotbraune Zellkernfärbung, während das Zytoplasma rötlich erschien. Kollagen wurde gelb, Elastin rot und GAGs hellblau dargestellt.
Tabelle 24: Herstellen der Lösungen für die Pentachromfärbung nach Movat
Alcianblau 1 g Alcianblau wurde in 1 ml Essigsäure (100%) und 100 ml deionisiertem Wasser gelöst.
Brilliant-Crocein-Säurefuchsin
0,1 g Brilliant Crocein wurde in 0,5 ml Essigsäure (100%) und 99,5 ml deionisiertes Wasser gegeben. 0,1 g Säurefuchsin wurde in 0,5 ml Essigsäure (100%) und 99,5 ml deionisiertem Wasser gelöst. 8 Teile der Brilliant-Crocein-Lösung und 2 Teile der Säurefuchsin wurden zusammengegeben. deionisiertem Wasser wurden 1,16 g Eisenchlorid und 1 ml Salzsäure (25%) gegeben. Zu dieser Lösung wurde die Hämatoxylinlösung im Verhältnis 1:1 gemischt.
Alkalischer Ethanol 10 ml Ammoniumhydrochlorid (25%) wurde in 90 ml Ethanol (96%) gegeben.
Tabelle 25: Reagenzien für die Pentachromfärbung nach Movat
Reagenz Firma (Ort, Land) Artikelnummer
Alcianblau Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) A5268
Ammoniumhydroxid Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) A6899 Brilliant Crocein Chroma (Münster, Deutschland) 1B109
Eisenchlorid Merck (Darmstadt, Deutschland) 1.039.430.250 Essigsäure Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland) 3738.2
Hämatoxylin Chroma (Münster, Deutschland) 5B535
Saffron du Gatinais Chroma (Münster, Deutschland) 5A394
Säurefuchsin Chroma (Münster, Deutschland) 1B525
Wolframphorsphorsäurehydrat Merck (Darmstadt, Deutschland) 1.005.830.100
3.3.4.5 Auswertung der histologischen Färbungen
Die mikroskopische Betrachtung der histologisch gefärbten Schnitte erfolgte an einem BXMikroskop (Olympus) mit Objektiven mit einer 4-, 10-, 20- und 40-fachen Vergrößerung. Wie im Abschnitt 9.1 zu entnehmen ist, wurden die mikroskopischen Bilder mittels einer AxioCam und der Axiovision-Software (Carl Zeiss) aufgenommen.
Um die Rebesiedelung der Matrix mit autologen Zellen nach Ablauf der Beobachtungszeit zu beurteilen, wurde die HE-Färbung benutzt. Zum Vergleich der Rebesiedelung der verschiedenen Implantate wurde ein Auswertungsschema erstellt. Nach dieser Punkteskala in Tabelle 26 wurden die Zellkerndichte und Zellverteilung in folgenden Bereichen der Implantate bewertet: (1) Klappenwand, (2) Scheitelpunkt des Sinus und (3) Tasche (ventrikuläre Taschenseite, arterielle Taschenseite und Interstitium der Tasche). Nach diesem Schema wurden zwei Taschen pro explantiertem Allograft - die kryokonservierte und die in Paraffin eingebettete Tasche - bewertet. Dargestellt wurde der Mittelwert der zwei Taschen.
Tabelle 26: Bewertungsschema der Rebesiedelung in longitudinalen Schnitten
Punkte Rebesiedelung der Klappenwand
Zellen in adventitialer Seite 2
Rebesiedelung der Arterie von der Adventitia bis zum Lumen 4 Zelldichte und Zellverteilung vergleichbar zur nativen Klappenwand 6 Scheitelpunkt des Sinus
Zellen vorhanden 2
Rebesiedelung des Sinus im Interstitium und bis zum Lumen 4 Zelldichte und Zellverteilung vergleichbar zu nativer Klappentasche 6 Ventrikuläre Seite der Tasche
⅓ der ventrikulären Seite mit Zellen bedeckt 1
circa ½ der ventrikulären Seite mit Zellen bedeckt 3
100% der ventrikulären Seite mit Zellen bedeckt 4
Arterielle Seite der Tasche
bis ½ der arteriellen Seite mit Zellen bedeckt 2
über ½ der arteriellen Seite mit Zellen bedeckt 3
Interstitium der Tasche
bis ½ der Lamina spongiosa mit Zellen besiedelt 2
über ½ der Lamina spongiosa mit Zellen besiedelt 3
maximal zu erreichende Punktzahl 22
Ein wichtiger Aspekt von biologischen, kardiovaskulären Implantaten ist die Bildung einer Neointima auf der luminalen Seite, die sich vor allem in Gefäßimplantaten negativ auswirken kann. Lichtenberg et al. haben festgestellt, dass Allografts, die zuvor mit Endothelzellen reendothelialisiert wurden, weniger Neointimabildung aufwiesen als nur dezellularisierte Implantate36. Aus diesem Grund wurde die verdickte, luminale Zellschicht, die in einigen Allografts auf der Tasche der Klappenwand oder dem Scheitelpunkt des Sinus festgestellt wurde, mikroskopisch mit Hilfe des Softwareprogramms „Axiovision“ (Zeiss) ausgemessen. Dafür wurden histologische Schnitte, gefärbt mit der Pentachromfärbung nach Movat benutzt, da sich die Neointima aufgrund des hohen Gehalts an GAGs blau anfärbt und sich deshalb klar abgrenzen lässt.
Einige Publikationen haben gezeigt, dass in vivo zuerst die Basis der Tasche mit Zellen rebesiedelt wird31,103. Zusätzlich wurden Anzeichen einer Neointima hauptsächlich proximal auf der Tasche festgestellt118. Als Hinweis für eine ungleichmäßige Rebesiedelung und eine Neointimabildung wurde ein Taschendicke-Index entwickelt. Mittels des Softwareprogramms „Axiovision“ (Zeiss) wird die Dicke der Tasche an einer repräsentativen Seite proximal und distal gemessen und miteinander verglichen. Dadurch ist diese Methode unabhängig von der Schnittebene des Präparates und von eventuellen Unterschieden der Schnittdicke. Als Kontrolle dienten zwei dezellularisierte und zwei native Pulmonalklappentaschen. Diese stammten aus gesunden ausgewachsenen Schafen, die im Schlachthof getötet wurden. Die Formel des Taschendicke-Index lautet wie folgt:
Taschendicke-Index (TDI) = Taschendicke proximal / Taschendicke distal