6.1 Deutsche Zusammenfassung
Generierung von tissue-engineerten Pulmonalklappen und deren Untersuchung nach Implantation in Schafen fortgeschrittenen Alters
Karolina Theodoridis
In industrialisierten Ländern nimmt die Anzahl an Patienten mit Herzklappenerkrankungen immer mehr zu. Vor allem die Anzahl von älteren Patienten (> 65 Jahren) nimmt aufgrund der verbesserten medizinischen Versorgung und steigender Lebenserwartung zu. Wegen der guten hämodynamischen Eigenschaft werden älteren Patienten biologische Implantate empfohlen. Ein wichtiges Ziel dieser Arbeit war, das Rebesiedelungsverhalten und Rebesiedelungspotenzial von dezellularisierten Herzklappen in älteren Schafen zu untersuchen, welches bereits in jungen Tieren beschrieben wurde.
Ovine Pulmonalklappen wurden vom Schlachthof erworben, dezellularisiert, mit dem proangiogenen Faktor CCN1 beschichtet und reendothelialisiert. Für Letzteres erfolgte die Gewinnung von autologen endothelzellähnlichen Zellen aus dem Blut von 6 Schafen. Schwarzkopfschafe mit einem durchschnittlichen Alter von 7 Jahren erhielten eine tissue-engineerte Herzklappe zum Pulmonalklappenersatz in supravalvulärer Position, wobei drei Arten von unterschiedlich vorbehandelten Allografts verwendet wurden. Die 18 überlebenden Schafe des Tierversuches hatten dezellularisierte (Gruppe 1, n=6); dezellularisierte und CCN1-beschichtete (Gruppe 2, n=6) oder dezellularisierte, CCN1-beschichtete und mit autologen Zellen reendothelialisierte (Gruppe 3, n=6) Implantate erhalten. Die Untersuchung der Herzklappenfunktion erfolgte echokardiographisch direkt nach Implantation und kurz vor der Euthanasie. Die explantierten Allografts, 6 und 12 Monate post OP, wurden histologisch und mittels Immunfluoreszenzfärbungen bezüglich der Rebesiedelung und der Identität der eingewanderten Zellen analysiert.
Keines der überlebenden Schafe zeigte während der Beobachtungszeit klinische Symptome eines Herzklappenversagens. Vier Allografts wiesen bei der Explantation eine Erhöhung der Insuffizienz auf (1x CCN1-beschichtet, 6 Monate post OP; 1x reendothelialisiert, 6 Monate post OP; 1x dezellularisiert, 12 Monate post OP, 1x
CCN1- beschichtet, 12 Monate post OP). 16 Implantate besaßen bei der Explantation dünne, durchscheinende Klappentaschen ohne Vegetationen. Ein Allograft (dezellularisiert, 12 Monate post OP) zeigte Vegetationen auf den Taschen und wurde deswegen von der weiteren Untersuchung ausgeschlossen. Eine Tasche pro Implantat wurde mit Phalloidin und DAPI in toto gefärbt. Dabei wurde sichtbar, dass die ventrikuläre Taschenoberfläche großflächig mit Zellen bedeckt war. Das Ausmaß der Bedeckung war in allen Gruppen ähnlich. Die arterielle Taschenoberfläche zeigte in der Regel nur wenig adhärente Zellen, allerdings war die Bedeckung der arteriellen Taschenseite bei den reendothelialisierten Implantaten am stärksten. Auch die ECM war in der Gruppe der reendothelialisierten Allografts am stärksten mit Zellen rebesiedelt. Es gab Anzeichen für eine gleichmäßigere Verteilung der Zellen in den reendothelialisierten und CCN1-beschichteten Klappen im Vergleich zu den dezellularisierten Klappen. Ein Implantat besaß eine Kalzifizierungsstelle in der Klappentasche (dezellularisiert, 6 Monate post OP), und drei Implantate in der Klappenwand (1x dezellularisiert, 6 Monate post OP, 1x reendothelialisiert, 12 Monate post OP, 1x CCN1- beschichtet, 12 Monate post OP).
In den rebesiedelten Bereichen der Implantate wurden Vimentin-positive, sm α-actin-positive und MYH11-α-actin-positive Zellpopulationen gefunden. Alle Implantate besaßen eine luminale Zellschicht, die positiv für vWF und eNOS war, jedoch zeigten die reendothelialisierten Implantate eine scheinbar stärkere Konfluenz dieser Schicht.
Gebiete mit mehr CD45-positiven Zellen als in nativen Pulmonalklappen wurden nur gelegentlich gefunden. Die intrazelluläre Darstellung von Prokollagen Typ I deutet den autologen Ursprung der eingewanderten Zellen an und deren Fähigkeit zur Produktion von ECM-Proteinen und Remodeling.
Zusammenfassend zeigten die tissue-engineerten Herzklappen auch nach 12 Monaten in vivo eine zufriedenstellende Funktion. Die Schafe besaßen im Alter von ca. 7 Jahren das Potenzial dezellularisierte Matrices mit autologen Zellen zu rebesiedeln. Trotzdem erscheint das Rebesiedelungspotenzial im Vergleich zu publizierten Ergebnisse von implantierten, dezellularisierten Herzklappen in jungen Schafen und Schweinen reduziert. Die reendothelialisierten Implantate zeigten zwar geringfügig bessere Ergebnisse als die dezellularisierten, die Unterschiede waren jedoch nicht signifikant. Somit wurden keine eindeutigen Vorteile einer Reendothelialisierung von dezellularisierten allogenen Implantaten für den Herzklappenersatz in älteren Individuen gefunden.
6.2 English summary
Generation of tissue-engineered pulmonary valves and their analysis after implantation in the elderly ovine model
Karolina Theodoridis
In industrialized countries the number of patients with heart valve diseases is constantly increasing. Especially the number of elderly patients (>65 years) requiring a heart valve replacement is increasing due to improved medical treatment and increasing life expectancy. Bioprosthetic implants are recommended for older patients due to their good haemodynamic function and because they do not need any anticoagulation therapy. The aim of this study was to analyse the potential of older individuals to repopulate the decellularized matrix of tissue-engineered heart valves, as has been described in younger animals.
Pulmonary valves obtained from the slaughterhouse, were decellularized. Further on they were coated with the proangiogenic factor CCN1 and reendothelialized.
Endothelial-like cells were cultivated from the peripheral blood of 6 sheeps for the reendothelalization of decellularized allografts. Sheep of a german fast-growing breed with an average age of 7 years underwent a pulmonary valve replacement with tissue engineered heart valves. The 18 surviving sheep received either decellularized (group 1, n=6), decellularized and CCN1-coated (group 2, n=6), or decellularized, CCN1-coated and reendothelialized (group 3, n=6) grafts. Functional assessment of the allografts via echocardiography was carried out immediately after implantation and shortly before explantation. The explanted grafts were histologically and immunohistochemically analysed to determine the degree of repopulation and the identity of the participating cells.
None of the animals showed any clinical symptoms. Using ultrasound, four allografts showed increase of the valve insufficiency at explantation (1x CCN1-coated, 6 months post OP; 1x reendothelialized, 6 months post OP; 1x decellularized, 12 months post OP, 1x CCN1-coated, 12 months post OP). At the time point of euthanasia, 16 grafts had translucent, thin cusps with no vegetations and no luminal stenosis. One allograft had to be excluded from further analysis due to extended vegetations (decellularized, 12 months post OP). Staining one cusp per graft in toto with phalloidin and DAPI revealed an extended coverage with cells of the ventricular
cusp surface. The degree of coverage was similar in all groups. On the arterial cusp surface coverage was less extended. Compared to the other groups the reendothelialized allografts showed the highest degree of coverage on the arterial cusp surface. Additionally the reendothelialized allografts showed the highest repopulation of the matrix. Moreover it was shown that cells were distributed more equally in reendothelialized and CCN1-coated grafts than in decellularized valves.
Signs of calcification were found in one cusp (reendothelialized, 12 months post OP) and three times in the conduit wall (1x decellularized, 6 months post OP, 1x reendothelialized, 12 months post OP, 1x CCN1-coated, 12 months post OP).
Vimentin, sm α-actin and MYH11 positive cells were found in the repopulated areas but to different amounts. A luminal layer positive for vWF and eNOS was found on the luminal side of all allografts, however the endothelialized grafts revealed a more complete confluence of the vWF positive cell layer. The immunochemical localisation of intracellular procollagen may verify that cells in the implants are not remaining cells from the donor and should therefore be of autologous origin. In addition, this reveals the capability of the receptor cells to remodel the ECM. Areas with more CD45-positive cells than in native pulmonary valves were found only seldom.
In summary the implanted tissue-engineered heart valves showed even after 12 months in vivo an adequate function. The elderly sheep had the potential to repopulate the allogeneic ECM with autologous cells. However, this capability seems to be reduced compared to young sheep and pigs, which has been described in the literature. Even though the reendothelialized valves showed especially in comparison to the decellularized valves slightly better results, this tendency showed no significance. The time consuming reendothelialization with patient derived cells demonstrate no tremendous benefits.