9. Anhang
9.1 Geräteverzeichnis
Bezeichnung Firma (Ort, Land) Verwendung Sterilbank HB 2472 Laminar Air (Ingelburn,
Australia) Dezellularisierung Orbitalschüttler 3031 GFL (Burgwedel,
Deutschland) Dezellularisierung Brutschrank
CO2-Incubator Sanyo (Moriguchi, Japan) Zellkultur Mikroskop CKX41 Olympus (Shinjuku, Japan) Zellkultur Sterilbank Typ 18 Hera
Safe
Hereaus (Hanau,
Deutschland) Zellkultur Wasserbad, GFL 1083 GFL (Burgwedel,
Deutschland) Zellkultur
CO2-Incubator MC-20AIC Sanyo (Moriguchi, Japan) Reendothelialisierung im Bioreaktor
Sterilbank Typ KR-200 Kojair (Tampere, Finland) Reendothelialisierung im Bioreaktor
(AESTIVA 5) GE Healthcare (Little
Chalfont, UK) Operativer
Pulmonalklappenersatz Ultraschallgerät Sonis
2500 HP (Palo Alto, USA) echokardiographische
Untersuchung
Kamera AxioCam HSm Zeiss (Jena, Deutschland) MosaiX-Aufnahme Mikroskop Z.1 Zeiss (Jena, Deutschland) MosaiX-Aufnahme Entwässerungsautomat
Histocentre Shandon (Runcorn, UK) Einbettung der Präparate in Paraffin
Rotationsmikrotom
2040 Reichert-Jung Anfertigung von
Paraffinmikroschnitten Streckplatte 14801 Medax (Poggio Rusco,
Italy) Anfertigung von
Paraffinmikroschnitten Wasserbad HI 1210 Leica (Solms,
Deutschland)
Anfertigung von
Paraffinmikroschnitten Kryotom HM 560 Microm (Albano Laziale,
Italy)
Anfertigung von Kryomikroschnitten Farbkamera AxioCam
MPc Zeiss (Jena, Deutschland) Auswertung der
histologischen Färbungen Mikroskop BX40F Olympus (Shinjuku,
Japan)
Auswertung der
histologischen Färbungen Kamera AxioCam MRM Zeiss (Jena, Deutschland) Auswertung der
Immunfluoreszenzfärbungen Mikroskop Observer A1 Zeiss (Jena, Deutschland) Auswertung der
Immunfluoreszenzfärbungen
9.2 Statistische Auswertung
Tabelle 40: Statistische Daten zur Konfluenz der Zellschicht auf der arteriellen Taschenoberflache
Gruppe Mittelwert
Tabelle 41: Statistische Daten zur Konfluenz der Zellschicht auf der ventrikulären Taschenoberflache
Tabelle 42: Statistische Daten zur Rebesiedelung in longitudinalen Schnitten der Allografts
Gruppe Mittelwert
Tabelle 43: Statistische Daten zum TDI der Allografts
Tabelle 44: Statistische Daten zur luminalen Konfluenz der vWF-positiven Zellschicht
Gruppe
9.3 Kontrollen der Immunfluoreszenzfärbungen
In der vorliegenden Arbeit wurden zur Auswertung nur Immunfluoreszenzfärbungen verwendet, die in den Positivkontrollen Fluoreszenz in den erwarteten Zellen bzw.
Bereichen des Gewebes aufwiesen (z.B. vWF-positive Zellen nur an der Oberfläche der Klappentasche, Klappenwand oder MYH11-positive Zellen in der Tunica media der Klappenwand) und keine Anzeichen von unspezifischen Bindungen in den Isotypkontrollen der jeweiligen Antikörper zeigten. In den Abbildungen 45 bis 48 sind Positivkontrollen und Isotypkontrollen der verwendeten Antikörper dargestellt.
Abbildung 45: Kontrollen der Immunfluoreszenzfärbungen der Kollagene. Das Signal von Kollagen Typ I (rot) wurde in der Lamina ventricularis (oben im Bild) und in der Lamina fibrosa (unten im Bild) der Tasche gefunden. Kollagen Typ IV wurde nur am Saum der Tasche lokalisiert. Die Mehrzahl der Zellen in der ovinen Haut waren positiv (rot) für Prokollagen Typ I. In den Isotypkontrollen (B,D,F) war kein Fluoreszenzsignal sichtbar. (A: Kollagen I, ovine Taschenklappe; B: Isotypkontrolle von Kollagen I, ovine Taschenklappe, ventrikuläre Seite oben und arterielle Seite unten; C: Kollagen IV, ovine Taschenklappe, ventrikuläre Seite oben und arterielle Seite unten; D: Isotypkontrolle von Kollagen IV, ovine Taschenklappe, ventrikuläre Seite oben und arterielle Seite unten; E: Prokollagen I, ovine Haut; F:
Isotypkontrolle von Prokollagen I, ovine Haut) (Rot: positives Signal des gebundenen Antikörpers; Blau:
mit DAPI gefärbte Zellkerne)
Abbildung 46: Kontrollen der Immunfluoreszenzfärbungen der endothelialen Marker auf nativer Pulmonalklappenwand. Die Immunfluoreszenzfärbung von vWF (A) und eNOS (B) zeigten ein konfluentes Signal auf der luminalen Oberfläche. Die Isotypkontrollen (B, D) wiesen keine Fluoreszenz auf. (A: vWF;
B: Isotypkontrolle von vWF; C: eNOS; D: Isotypkontrolle von eNOS; native Pulmonalklappenwand, Lumen oben) (Rot: positives Signal des gebundenen Antikörpers; Blau: mit DAPI gefärbte Zellkerne)
Abbildung 47: Kontrollen der Immunfluoreszenzfärbungen von Markern von Bindegewebszellen der Herzklappen auf nativer Pulmonalklappenwand. Während nahezu alle Zellen der Klappenwand Vimentin-positiv waren (A), waren „weniger“ Zellen sm α-actin-Vimentin-positiv (C). MYH11-immunoVimentin-positiv waren nur Zellen in organisierten „Bündeln“ der Tunica media (E). Die Isotypkontrollen (B, D, F) wiesen keine Fluoreszenz auf. (A: Vimentin; B: Isotypkontrolle von Vimentin; C: sm α-actin; D: Isotypkontrolle von sm α-actin, E:
MYH11; B: Isotypkontrolle von MYH11; native Pulmonalklappenwand, Lumen oben) (Rot: positives Signal des gebundenen Antikörpers; Blau: mit DAPI gefärbte Zellkerne)
Abbildung 48: Kontrolle der CD45-Immunfluoreszenzfärbung in nativen, ovinen Lymphknoten. Die Immunzellen waren in der Positivkontrolle (A) von einem membranständigen, roten Fluoreszenzsignal umgeben, während die Zellen in der Isotypkontrolle (B) keine rote Fluoreszenz aufwiesen. (A: CD45; B:
Isotypkontrolle von CD45; nativer, oviner Lymphknoten) (Rot: CD45; Blau: mit DAPI gefärbte Zellkerne)
10. Abbildungsverzeichnis
Abbildung Titel Seite
1 Ventilebene des humanen Herzens mit Mitralklappe,
Tricuspidalklappe, Aortenklappe und Pulmonalklappe 6 2 Schematischer, longitudinaler Aufbau einer Taschenklappe
am Beispiel der Pulmonalklappe 7
3 Aufbau einer ovinen Klappen- bzw. Sinuswand einer nativen
Pulmonalklappe, gefärbt mit Pentachromfärbung nach Movat 8 4 Ovine, native Klappentasche mit typischem dreichschichtigen
Aufbau 9
5 Mechanische Herzklappenprothesen verschiedener
Hersteller 11
6 Bioprosthetische Herzklappen unterschiedlichen Ursprungs 12 7 Histologische Ergebnisse mittels Hämatoxylin-Eosin Färbung
und Trichromfärbung nach Gomori von Flanagan et al. 15
8 Von Ingram et al. isolierte ECFCs mit
Pflastersteinmorphologie 18
9 Schematische Darstellung des Bioreaktorsystems nach
Lichtenberg et al. 20
10 Chronologische Darstellung des Versuchsaufbaus 26 11 Bioreaktor nach Lichtenberg et al. mit eingenähter Klappe,
Schraubverschluss und Verlängerung des Innenraums 35 12
Bioreaktor nach Lichtenberg et al. im Brutschrank auf einem Stativ, mit eingenähter Pulmonalklappe, angeschlossen an einer Gaskammer und an dem Schlauchsystem für die Mediumzirkulation
38
13 Schema eines longitudinal aufgeschnittenen Allografts nach
Explantation mit geplanter Weiterbearbeitung 45 14 Schematische Darstellung des Implantats mit Sicht auf die
drei Valvulae 45
15
Pentachromfärbung zum repräsentativen Nachweis der Zellfreiheit nach Dezellularisierung mit nativer Pulmonalklappe zum Vergleich
64
16 Die differenzierten Zellen bzw. Zellkolonien wiesen durchgehend in den Passagen 0, 3 und 6 einen pflastersteinähnlichen Phänotyp auf.
65
17 Nachweis des endothelialen Charakters der kultivierten,
ovinen Zellen mittels Immunfluoreszenzfärbung 66
18 Mit ECs reendothelialisierte Klappentasche 67
19 Lokalisation von VE-Cadherin zwischen den Zellen einer
exemplarisch mit ECs reendothelialisierten Tasche 68
20 In situ Darstellung einer CCN1-beschichteten
Pulmonalklappe 12 Monate post OP im Schaf #7703 76 21 Zwei Implantate wiesen bei der Explantation Veränderungen
auf 77
22 Bedeckung der Taschenoberfläche eines dezellularisierten
Allografts mit Zellen, 6 Monate post OP 79
23 Prozentuale Bedeckung der arteriellen und ventrikulären
Seite der Klappentaschen mit Zellen 79
24 Matrixrebesiedelung in vivo 82
25 Bewertung der Rebesiedelung der Implantate 84
26 Versilberung nach von Kossa an longitudinalen Schnitten der
Implantate 86
27 Verkalkungen eines Allografts 87
28 Verkalkte Klappenwand 87
29 Struktur der ECM 89
30 TDI der Taschenklappen der Implantate 92
31 Nachweis von Kollagen Typ I mittels
Immunfluoreszenzfärbung 94
32 Nachweis von Kollagen Typ IV mittels
Immunfluoreszenz-färbung 96
33 Nachweis von vWF mittels Immunfluoreszenzfärbung 98 34 Konfluenz der vWF-positiven Zellschicht auf den
Klappentaschen 100
35 Nachweis von eNOS mittels Immunfluoreszenzfärbung 102 36 Nachweis von Vimentin mittels Immunfluoreszenzfärbung 104 37 Nachweis von sm a-actin mittels Immunfluoreszenzfärbung 106 38 Darstellung von sm a-actin mittels Immunfluoreszenzfärbung
in der distalen Anastomose 106
39 Nachweis von MYH11 mittels Immunfluoreszenzfärbung 108 40 Nachweis von Prokollagen Typ I mittels
Immunfluoreszenz-färbung 109
41 Nachweis von CD45-positiven Zellen mittels
Immun-fluoreszenzfärbung 111
42 Vaskularisierung der Allografts 112
43 Histologische Darstellung der Neointima mittels
Pentachrom-färbung 115
44 Darstellung der Neointima mittels Immunfluoreszenzfärbung 116 45 Kontrollen der Immunfluoreszenzfärbungen der Kollagene 161 46 Kontrollen der Immunfluoreszenzfärbungen der endothelialen
Marker auf nativer Pulmonalklappenwand 162
47 Kontrollen der Immunfluoreszenzfärbungen von Markern von Bindegewebszellen der Herzklappen auf nativer Pulmonalklappenwand
163
48 Kontrolle der CD45-Immunfluoreszenzfärbung in nativen,
ovinen Lymphknoten 164
11. Tabellenverzeichnis
Tabelle Titel Seite
1 Reagenzien für die Dezellularisierung 28
2 Sonstige Materialien für die Dezellularisierung 28 3 Zusammensetzung der Lösungen für die EC-Kultivierung 30
4 Reagenzien für die EC-Kultivierung 31
5 Sonstige Materialien für die EC-Kultivierung 31
6 Lösungen für die Immunfluoreszenzfärbung der kultivierten ovinen Zellen
33 7 Verwendete Antikörper für die Immunfluoreszenzfärbungen
der kultivierten ovinen Zellen 33
8 Verwendete Reagenzien für die
Immunfluoreszenzfärbungen der kultivierten ovinen Zellen
34 9 Sonstiges Material für die Immunfluoreszenzfärbungen der
kultivierten ovinen Zellen
34 10 Benutzte Passagennummer und Zellanzahl für die
Reendothelialisierung
37 11 Material für die Reendothelialisierung im Bioreaktor 38 12 Gruppeneinteilung der 18 überlebenden Schafe nach
Implantat und Standzeit
40
13 Benutztes Fadenmaterial beim operativen
Pulmonalklappenersatz
43 14 Verwendete Arzneimittel intraoperativ, postoperativ und bei
der Explantation 46
15 Verwendete Reagenzien bei der Explantation 46
16 Herstellen der Lösungen für die Phalloidin-DAPI Färbung 47 17 Verwendete Reagenzien bei der Phalloidin-DAPI-Färbung 47
18 Reagenzien für die Entwässerung 49
19 Sonstige Materialien für histologische Färbungen 51 20 Herstellen der Lösungen für die Modifizierte
Hämalaun-Eosin-Färbung 51
21 Reagenzien für die modifizierte Hämalaun-Eosin-Färbung 52 22 Herstellen der Lösungen für die Versilberung nach von
Kossa 52
23 Reagenzien für die Versilberung nach von Kossa 53 24 Herstellen der Lösungen für die Pentachromfärbung nach
Movat 54
25 Reagenzien für die Pentachromfärbung nach Movat 54 26 Herstellung der Lösungen für die Immunfluoreszenzfärbungen 59
27 Reagenzien für die Immunfluoreszenzfärbungen 59
28 Verwendete Antikörper für die Immunfluoreszenzfärbungen Teil I 60 29 Verwendete Antikörper für die Immunfluoreszenzfärbungen Teil II 60 30 Bewertungsschema der Konfluenz der vWF-positiven Zellschicht
auf der Tasche 61
31 Tierspezifische und operative Daten, Teil I 70
32 Tierspezifische und operative Daten, Teil II 71
33 Echokardiologische Ergebnisse direkt nach Implantation 74 34 Echokardiologische Ergebnisse nach Ablauf der
Beobachtungszeit, unmittelbar vor der Euthanasie 75
35 Prozentuale Bedeckung der Taschenoberfläche 80
36 Bewertung der Rebesiedelung an longitudinalen Schnitten der
Allografts nach dem Bewertungsschema 83
37 Ergebnisse der Taschendicke, des TDI und der Rebesiedelung
der longitudinalen Schnitte 91
38 Ergebnisse der Konfluenz der vWF-positiven Zellschicht auf der
Klappentasche 99
39 Messung der vorhandenen Neointima 114
40 Statistische Daten zur Konfluenz der Zellschicht auf der arteriellen
Taschenoberflache 157
41 Statistische Daten zur Konfluenz der Zellschicht auf der
ventrikulären Taschenoberflache 158
42 Statistische Daten zur Rebesiedelung in longitudinalen Schnitten
der Allografts 158
43 Statistische Daten zum TDI der Allografts 159
44 Statistische Daten zur luminalen Konfluenz der vWF-positiven
Zellschicht 159
Danksagung
Folgenden Personen möchte ich sehr herzlich danken:
Prof. Dr. Axel Haverich für die Gelegenheit in dem sehr interessanten Gebiet des Tissue-Engineerings die vorliegende Arbeit durchführen zu können,
Prof. Dr. Ralph Brehm für die gute Betreuung, Organisation und hilfreiche sowie konstruktive Korrekturvorschläge,
Dr. Andres Hilfiker für die Betreuung, Zusammenarbeit, Unterstützung, für die aufbauenden Gespräche und für das Vertrauen in meine Fähigkeiten,
Tanja und Doreen für die praktische Hilfe in allen Belangen zu früher und später Stunde sowohl im Labor als auch im Tierhaus,
dem OP-Team: Alex, Astrid, Igor, Jost, Karin, Klaus, Petra, Rosie, Serghei und Sandu, für den großartigen Einsatz,
meinen lieben Kollegen, die bei Problemen immer und unverzüglich zur Stelle waren:
Birgit, Dominique, Marco, Michael, Robert, Tibor, Tobias,
und meinen Eltern, meinen Schwestern, meiner Oma, meinen Freunden.