Aus der Klinik für Herz-, Thorax-, Transplantation und Gefäßchirurgie der Medizinische Hochschule Hannover
Leiter: Prof. Dr. med. Dr. h. c. Axel Haverich
Orthotoper Aortenklappenersatz mittels Tissue-Engineerten Grafts
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Alexandru Florin Calistru
aus Bukarest, Rumänien
Hannover 2014
Angenommen vom Senat der Medizinische Hochschule Hannover am 21.04.2015
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. med. Christopher Baum
Betreuer: Prof. Dr. Dr. h. c. Axel Haverich
Referent: Prof. Dr. med. Heiko von der Leyen
Korreferent: Prof. ’in Dr. med. Renate Kaulitz
Tag der mündlichen Prüfung: 21.04.2015
Prüfungsausschussmitglieder:
Prof. Dr. med. Christian Krettek
Prof. Dr. med. Axel Stuart Merseburger
Prof. Dr. med. Dirk Berens von Rautenfeld
Meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
Dissertation 5
Zusammenfassung 14
Literaturverzeichnis 21
Lebenslauf 23
Danksagung 28
Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nrn. 6 und 7 29
Dissertation
Orthotopic Replacement of Aortic Heart Valves with Tissue-Engineered Grafts
Igor Tudorache, MD,1,* Alex Calistru, MD,1,* Hassina Baraki, MD,1Tanja Meyer, DVM,1Klaus Ho¨ffler,1 Samir Sarikouch, MD,1Christopher Bara, MD,1Adelheid Go¨rler, MD,1Dagmar Hartung, MD,2
Andres Hilfiker, PhD,1Axel Haverich, MD,1and Serghei Cebotari, MD1
Aims:Heart valve tissue engineering aims to create a graft with improved durability compared to routinely used valve substitutes. This study presents the function and morphological changes of a tissue-engineered aortic valve (TEV) compared to the cryopreserved valve (CPV), aortic valve (AV) allografts in an orthotopic position in sheep.
Methods and Results:Ovine AV conduits (n=5) were decellularized with detergents. Autologous endothelial cells (ECs) were seeded onto the valve surface and cultured under physiological conditions using a high pulsatile flow.
Grafts were implanted as a root with reimplantation of coronary ostia in sheep. Crystalloid cardioplegia and isogenic blood transfusions from previous sacrificed sheep were used. Only antiplatelet aggregation therapy was used postoperatively. CPVs (n=4) served as controls. The grafts were investigated for function (echocardiography, magnetic resonance investigation), morpho/histological appearance, graft rejection, and calcification at 3 months.
Decellularization led to cell-free scaffolds with preserved extracellular matrices, including the basement mem- brane. TEVs were covered with ECs expressing typical endothelial markers. Neither dilatation, stenosis, reductions of cusp mobility nor a significant transvalvular gradient, were observed in the TEV group. Explanted valves exhibited normal morphology without signs of inflammation. An endothelial monolayer covered cusps and the valve sinus. In the CPV group, sporadic, macroscopic, calcified degeneration with mild AV insufficiency was noted. Histology revealed signs of rejection and incipient calcification of the tissue.
Conclusion:Tissue-engineered AV based on decellularized valve allografts satisfy short-term requirements of the systemic circulation in sheep. Although results of long-term experiments are pending, the lack of degenerative traits thus far, makes these grafts a promising alternative for future aortic heart valve surgery.
Introduction
V
alve replacement is the common treatment in ad- vanced aortic valve (AV) disease and biological and mechanical valve prostheses are the most used substitutes.Limited durability of biological valves and life-long antic- oagulation therapy for mechanical prostheses are the major concerns in their clinical use.1,2Accelerated degeneration of biological allo- and xenovalves is partially attributed to re- maining cells within the valve tissue, cytotoxicity of chemical crosslinking agents as well as incomplete biocompatibility if referred toaGal epitopes masking.3,4Preserved antigenicity induces a chronic inflammatory response with subsequent valve failure.5,6In addition, all described grafts have a lim- ited acceptance in patients that are still growing. Im- munological responses are avoided by the use of the patient’s own pulmonary valve in replacement of the dis- eased AV, as in the Ross operation. The pulmonary autograft
is also advantageous, as it has been shown to grow along with the child, resulting in fewer reoperations. Factors con- tributing to a limited acceptance of this procedure include operation complexity and the replacement requirement of both aortic and pulmonary valves. Moreover, cryopreserved allografts undergo degenerative processes, the leading cause for reoperation in 20% of patients after 10 years.7,8Subse- quently, implantation of acellular or with patients’ own cells reseeded heart valves may solve the immune response problems and facilitatein vivograft remodeling.
Over the last decade, tissue engineering (TE) has become a promising strategy by which to obtain such valves. The use of pulmonary valve homografts, proceeded by methods of TE before implantation, showed excellent hemodynamic parameters in the pulmonary valve position, limited degen- eration and capacity to grow in pediatric patients.9,10At the aortic position, AV replacements with TE grafts are currently tested at the preclinical level. In sheep, a model considered to
Departments of1Cardiothoracic, Transplant and Vascular Surgery, and2Radiology, Hannover Medical School, Hannover, Germany.
*Both authors contributed equally to this work.
TISSUE ENGINEERING: Part A Volume 19, Numbers 15 and 16, 2013 ªMary Ann Liebert, Inc.
DOI: 10.1089/ten.tea.2012.0074
1686
be the standard in predicting calcification of biological heart valves, the decellularized AV demonstrated superior dura- bility as compared to unprocessed allografts in long-term experiments.11The aim of this study was twofold. First, to create a tissue-engineered aortic valve (TEV) based on detergent decellularized ovine AV scaffolds reseeded with autologous endothelial cells (ECs) and second, to compare the TEVs with standard cryopreserved allograft valves (CPVs) after orthotopic implantation at three months.
Materials and Methods
All animal experiments and surgical procedures were performed in compliance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals as published by the US National Institutes of Health (NIH Publication 85-23, revised 1996) and were approved by the local animal care committee (Experiment # 06/1186).
Aortic allografts
AV conduits were harvested from sheep (30–40 kg) under sterile conditions and were either immediately decellularized (n=5 for in vitro, n=5 forin vivo experiments) or cryopre- served (n=4).
Decellularization
Decellularization of AVs was performed as described.11
Cell source and culture
Isolation and cultivation of autologous ECs from ovine jugular veins were performed as previously described.12 In brief, jugular veins were harvested from future recipient ju- venile sheep. ECs were removed from the vessel wall by digestion with 2% collagenase A and resuspended afterward in a culture medium (CM) composed from the Endothelial Cell Basal Medium-2 (Clonetics), supplemented with Sin- gleQuot Kit (Clonetics), 10% FCS (Biochrom), 100mg/mL P/
S (Biochrom), and finally seeded into a culture flask. Cells from 2nd or 3rd passage were used for reseeding of the valve conduit. Prior seeding, cells were checked microscopically for cobblestone morphology and expression of endothelial markers as endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and CD31 (Polyclonal Rabbit IgG,) by immunohistochemistry (NOS Type III, BD Bioscience; CD31, Santa Cruz).
Reseeding and cultivation under pulsatile conditions For recellularization of AVs, dynamic bioreactors were used as described.12
Rotation conditions. Decellularized AVs (DAV; n=10) were inserted into bioreactors and incubated in the CM for 24 h. The lumen of the conduits was filled with the CM supplemented with 500 ng of the recombinant human proangiogenic factor CCN1. ECs (0.5·107cells/valve) were injected precisely into the valve lumen through specially designed cell-seeding inlets in two rounds. After the first seeding, the bioreactor remained in the vertical position for 6 h to allow the EC to attach in the valve sinuses. The second reseeding step was followed by a slow rotation of the bio- reactor (0.05 rpm) for another 6 h, exposing the entire valve surface to achieve optimal attachment conditions.
Dynamic conditions. Following the reseeding, the biore- actors were attached to a pulsatile pump. The pulsatile cir- culation was started at 0.1 L/min. The flow rate was increased by 0.05 L/min, twice a day, until day 4. After day 4, a maximal flow of 1.0 L/min was achieved by repeatedly increasing the flow by 0.2 L/min/day until day 7. The mean system pressure was maintained at 80 mm/Hg during the entire duration of dynamic cultivation. The morphology of reseeded AVs (n=5) was analyzed. The remaining AVs (n=5) were transported to the operation room in closed, but disconnected bioreactors at 37!C where they were removed from the bioreactor and used for implantation.
Cryopreservation and thawing
After harvesting, the grafts were placed in the cryopro- tectant solution containing 10% dimethyl sulfoxid and 20%
FCS. AVs were cryopreserved at a controlled rate (-1!C/
min) from 15!C to -120!C, and then rapidly cooled, and finally stored in the -196!C gas phase of liquid nitrogen (Kryo 10/Serie III; Messer Griesheim). Thawing was per- formed in two steps. In step 1, the CPVs were placed in a cooler containing dry ice without direct contact to the ice and warmed slowly to -100!C. In step 2, CPVs were placed in a 37!C water bath, to obtain rapid warming until all ice mac- roscopically disappeared. This type of valve preservation follows current clinical practice.13
Implantation of the AV conduits
TEVs and CPVs were implanted into young sheep (30–
40 kg), obtained from the local breeder (Lower Saxony) in the orthotopic position as described.11 Through a left antero- lateral thoracotomy, a right atrial to the descending aorta cardiopulmonary bypass was established. Crystalloid cardi- oplegia was introduced directly into the ostia. The valve conduit was sutured using single 5.0 polypropylene sutures (Ethicon). Coronary vessels were reimplantated using 6.0 polypropylene sutures. Isogenic blood transfusions from previously sacrificed sheep were used. Daily aspirin (100 mg) was given orally to all animals.
Echocardiography
Transesophageal echocardiography was performed dur- ing the explantation operation and valve function was as- sessed as previously described.11
Magnetic resonance investigation
Cardiac magnetic resonance imaging was performed be- fore explantation under general anesthesia. Examinations were completed in a standard 1.5 Tesla scanner (GE CV/I, General Electric) with retrospective peripheral pulse gating.
Analysis was performed using dedicated software (Qmass MR7.1; Medis).
Explantation of the AV conduits
The animals were euthanized by intravenous pentobarbi- tal (1 mL/kg body weight; WDT) following heparinization.
The grafts were excised, examined macroscopically, and prepared for histological analysis.
AORTIC VALVE REPLACEMENT WITH TISSUE-ENGINEERED GRAFTS 1687
Histology and immunohistochemistry
Formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections (6mm thick) were stained by standard hematoxylin and eo- sin, Movat pentachrome, and von Kossa stains and visual- ized in a bright field using an Olympus BX40 microscope.
Immunohistochemistry was performed as described.11,14In brief, frozen tissue sections were investigated for extracel- lular matrix (ECM) integrity: collagen IV (clone CI22; Dako);
the presence of ECs: the von Willebrand factor (vWF) (polyclonal rabbit IgG; Dako), eNOS (clone 3/eNOS/NOS Type III; BD Bioscience), CD31 (Polyclonal Rabbit IgG; Santa Cruz); the presence of smooth muscle cells and myofibro- blasts: alpha-smooth muscle actin (a-SMA) (clone 1A4;
Dako); and for inflammatory cells, CD45 (clone 1.11.32;
Serotec). Furthermore, the stain against procollagen I (De- velopmental Studies Hybridoma Bank) stands for newly synthetized collagen I and therefore for matrix remodeling.
FIG. 1. Complete re-en- dothelialization of the aortic valve scaffold after cultiva- tion in a dynamic bioreactor.
Hematoxylin and eosin and immunohistochemical im- ages show complete coverage by cells expressing eNOS (red) and CD31 (green) on the surface of the aortic wall(A, E), the edge of the leaflet(B, F), and the sinus of the valve (C, G). Cell nuclei positive for DAPI. (Bars 200mm) Phalloi- din stain shows homogenous cell distribution over the whole leaflet surface(D, H).
(Scale bars 50mm). eNOS, endothelial nitric oxide syn- thase. Color images available online at www.liebertpub .com/tea
1688 TUDORACHE ET AL.
Phalloidin stain was used to show the subcellular, cytoskel- etal actin filaments of the cells. Tissue samples were fixed with 4% paraformaldehyde, permeabilized with 0.5% Triton, and subsequently labeled with Alexa 488 phalloidin (Mole- cular Probes) as described.15Frozen sections of ovine AVs served as positive controls.
Statistics
All data are reported as the mean–SD. The unpaired studentt-test was used to test for differences among groups.
Ap-value of less than 0.05 was considered significant. The SPSS statistical software package 14.0 for Windows (SPSS) was used for all statistical analyses.
Results
Morphology of decellularized and re-endothelialized AV conduits
After detergent treatment of the AV followed by DNase I digestion, samples showed <5% of residual DNA as com- pared with native tissue samples. Histology and immuno- histochemistry revealed a preserved threedimensional scaffold with preserved collagens, elastic fibers, and glycos- aminoglycans. Complete maintenance of the basement membrane along the inner surface of the aortic wall and on both sides of the leaflet was demonstrated by the presence of Collagen IV.11
After re-endothelialization, the luminal surface of the DAV was covered with a confluent cell monolayer (Fig. 1A–
C). Cobblestone-like morphology with phalloidin staining (Fig. 1D, H), expression of CD31 and eNOS (Fig. 1E–G) demonstrated an endothelial origin. No interstitial cells were detected on the conduit surface or inside the scaffold (data not shown).
Operative results
Both, TEVs and CPVs represent a stable tissue that enables to perform appropriate surgical anastomosis. The cross- clamp time was 98–27 min. All animals survived the oper- ative procedure. In both groups, no signs of neurological deficits were observed.
Echocardiography and magnetic resonance investigation
Echocardiography showed a comparable mean diameter and an effective orifice area. Although the pressure gradient Table1. Functional Analysis of Implanted
Tissue-Engineered Valves and Cryopreserved Allograft Valves
TEVs CPVs p
Orifice area (cm2) 2.0–0.2 2.1–0.6 n.s.
Mean transvalvular systolic pressure gradient (mm/Hg)
0.5–0.5 2.1–0.6 <0.006
Max. transvalvular systolic pressure gradient (mm/Hg)
1.1–0.4 4.2–0.7 <0.001
AV Insufficiency 0.2–0.4 1.5–0.6 <0.001 Mean AV diameter (mm) 19.0–2.0 19.8–1.7 n.s.
Ejection fraction (%) 52.0–10.4 54.0–16.7 n.s.
AV, aortic valve; TEVs, tissue-engineered aortic valves; CPVs, cryopreserved allograft valves; n.s., not significant.
FIG. 2. Representative echocardiography results for tissue-engineered aortic valves (TEVs) and cryopre- served allograft valves (CPVs) at 3 months. De- generated aortic valve cusps of CPV with vegetation (ar- row)(A)and valve insuffi- ciency(B). Thin aortic valve cusps of the TEV without signs of degeneration(C)or insufficiency(D). Color images available online at www.liebertpub.com/tea AORTIC VALVE REPLACEMENT WITH TISSUE-ENGINEERED GRAFTS 1689
was low in both groups, it was significantly higher in CPVs (Table 1). In the CPV group, evident leaflet thickening and trivial to mild insufficiency was observed (Fig. 2A, B). In contrast, TEVs appeared normal with no valvular insuffi- ciency or stenosis (Fig. 2C, D). No signs of cusp thickening or reduction of cusp’s mobility were observed. This data cor- relate with magnetic resonance investigation results where no aortic regurgitation was noticed on flow measurements in the aorta. The volumetric analysis showed regular end- diastolic and end-systolic volumes of the left ventricles as well as adequate ejection fractions. There were no signs of left ventricular hypertrophy. Stroke volumes by volumetry matched stroke volume analysis by phase-contrast flow measurements, thereby, ruling out significant mitral regur- gitation (Fig. 3).
Characterization of the explanted grafts
None of the explanted conduits exhibited signs of rupture, aneurysmatic dilatation, or infection. By explantation, there
was a sizeable difference in the adhesion reaction with sur- rounding tissues. The CPVs showed more adhesions due to inflammation and the cusps were visibly thickened and shrunken (Fig. 4A, B). Vegetation spots, as well extensive macroscopic calcification were observed in the wall and an- nulus of explanted CPVs (Fig. 4C, D). In contrast, the TEVs had a smooth aortic wall surface. The leaflets remained tender, translucent, and without vegetations, calcification, or signs of degeneration. (Fig. 4E, F). Some small hematoma spots were observed on the cusps surface of both types of grafts.
Histology and immunohistochemistry
Explanted grafts had the preserved, typical layered orga- nization of the leaflets and dense scaffold organization of the arterial wall. CPVs showed massive inflammation and leu- kocyte infiltration into the entire graft tissue (Fig. 5A, B).
Over the luminal surface of CPVs, CD31- and vWF-positive cells could be identified (Fig. 5C, D). The explanted TEVs FIG. 3. Direct planimetric
analysis of the aortic valve orifice area (red line) using a modulus(A)and phase- contrast images(B), show- ing symmetric opening of the valve. Color images available online at www .liebertpub.com/tea
FIG. 4. Macroscopic morphology of explanted valves. Fibrous degeneration and thickening(A, B), as well as cusp vegetation (arrows) on the leaflet surface of the CPV(C). Macroscopic calcification (arrows) of the CPV wall(D). Translucent leaflets(E) and complete compliance of the valvular apparatus(F)of the TEV. Color images available online at www.liebertpub.com/tea
revealed neither signs of rejection nor inflammation (Fig. 5E, F). The luminal surface of the aorta, sinus, and cusps re- mained covered by the endothelium. These cells expressed eNOS, CD31 (Fig. 5G), and vWF (Fig. 5H), supporting an endothelial character. The EC covered the luminal surface up to the free margin of the leaflet as a monolayer (Fig. 6).
The area around all suture lines exhibited a typical subendothelial neointima formation (panus). The degree of panus was relatively equal in both groups. Cells expressing a-SMA and procollagen I repopulated approximately one third of the TEV adventitial site (data not shown).
Von Kossa staining showed signs of leaflet calcification and massive deposits of calcium in the wall of the CPVs (Fig.
7A, C) In contrast, no histological signs of calcification were observed inside the explanted TEV cusps or the arterial wall (Fig. 7B, D).
Discussion
In this study, we show for the first time, the results of an orthotopic implantation of TE aortic allografts. Our concept is based on the re-endothelialization of detergent DAV
FIG. 5. Immun-
histochemical micrographs from explants. Massive leukocyte infiltration of the CPV wall(A)and leaflet(B) with CD45 cells (red). The preserved endothelial cell layer over the CPV wall (C)positive for CD31/eNOS (green/red) and cusp (D)-positive for vWF (green).
The TEV wall(E)and leaflet (F)without leukocyte infil- tration (red—classified as background staining in the absence of concomitant staining of cell nuclei in blue).
The TEV cusp(G)covered by CD31/eNOS (green/red)- positive cells. Expression of vWF by cells over the TEV wall(H). (Scale bars 200mm).
vWF, von Willebrand factor.
Color images available online at www.liebertpub.com/tea AORTIC VALVE REPLACEMENT WITH TISSUE-ENGINEERED GRAFTS 1691
conduits with the vascular EC. We demonstrated in our previous study that the DAVs, possess excellent hemody- namic parameters and are able to withstand systemic pres- sures without suffering structural dilatation or deterioration for as long as 9 months.11However, the process of in vivo remodeling that occurs after implantation required a longer period of time for complete re-endothelialization of the graft lumen. In the pulmonary position,in vitrocultivation of the EC seeded onto decellularized pulmonary valve scaffolds using a pulsatile bioreactor system improves graft compati- bility and shows the maintenance of an EC monolayer after implantation.14Subsequent to these data, we used the same principle to obtain a TE aortic graft. We used the sheep model as considered to be ideal to test heart valve durability, as these animals exhibit increased calcium metabolism and reach full size by 2 years of age. Consequently, estimation of cardiovascular implant durability is possible in a shorter period of time.16
Autologous venous ECs were used to have cells with a stable and unvariable phenotype for reseeding procedures.
Because of the invasiveness, this method of cell acquisition is
not ideal, since the TE grafts should be primarily used in pediatric patients. To this point, several groups have dem- onstrated the use of human marrow stromal cells, amniotic fluid, and blood-derived progenitor cells for heart valve TE17,18; however, the use of these cells in the sheep model remains to be determined. Currently, method development for the isolation and stable cultivation of ovine blood-derived ECs for TE purposes is underway.
To avoid the wash-off of the reseeded cells from the lu- minal surface, we slowly increase the flow in the pulsatile bioreactor system trying to adapt ECs to higher shear stress.
The final protocol, used in this study, resulted in the main- tenance of a confluent EC layer at flows up to 1.0 L/min. In our previous studies, we demonstrated persistence of the EC layer after transportation in the operating room as well as operative stress for 24 h (data not shown).
Since Dr. Ross implanted the first aortic allograft in 1961,19 the methods of valve procurement and graft preservation have changed substantially. Maintenance of the graft via- bility appears to have a major importance in long-term functionality of cryopreserved or homovital allografts.20In FIG. 6. Phalloidin stain of
the TEV leaflet. Homoge- nous cells cover the cusp surface(A)and free edge (B). (Scale bars 100mm). Color images available online at www.liebertpub.com/tea
FIG. 7. Von Kossa stain shows calcium spots (ar- rows) within the CPV cusp (A)and massive CPV wall (C)calcification. In contrast, no signs of calcification were observed in TEV tissue (B, D). (Scale bars 100mm).
Color images available online at www.liebertpub .com/tea
1692 TUDORACHE ET AL.
this study, cryopreserved allografts were used as controls.
Although functional investigations did not reveal major differences in hemodynamic parameters between the grafts in both groups, considerable signs of degeneration, both macro- and microscopically, in the CAVs were observed as early as 3 months following implantation. These data con- firm that the presence of allogenic cells and disorganization of ECM components as a result of storage or mechanical stress can predict tissue degeneration and secondary graft failure. Lack of calcification in TEV grafts, can be explained in part by an effective decellularization process and scaffold preservation. Previously, we noted that mechanical stress, at the level of leaflet coaptation, did not permit complete re- endothelialization of cusp edges in unseeded grafts.11 This observation may be correct as the leaflets of TEVs in this study, showed ECs covering the entire cusp surface. Lack of thrombotic formation in grafts of both groups, highlights the importance of a functional endothelial layer before implan- tation. This is in line with our findings with implanted TE pulmonary valves.14 Coverage of the matrix with cells demonstrates once again that the use of detergents for de- cellularization of allografts is feasible, even supposed that traces remain likely entrapped in the matrix. Intimal hyper- plasia observed predominantly in coronary sinuses and in close proximity to anastomoses was in a decreasing thickness from the suture lines. This occurred in both types of grafts and was interpreted as a physiological panus, secondary to surgical trauma.
This study has a limitation. Implantation for three months in the ovine model provided considerable immunological- related data and was sufficient to identify calcification trends in different valvular grafts. However, susceptibility of TE AVs to growth was not determined in this study. Long-term implantations in lambs are pending. Here the in vivo re- population of the grafts by interstitial cells might have an essential role in graft remodeling.
In conclusion, the protocol used for TE of the pulmonary valve was successfully used in this study for engineering of AVs based on allograft scaffolds reseeded with venous ECs.
Despite comparable short-term functionality, cryopreserved allografts revealed considerable degeneration, compared to the tissue-engineered grafts. The lack of degenerative signs makes the TE AV a promising alternative for use in future AV surgery.
Acknowledgments
We are grateful to Rosalinde Katt, Astrid Diers-Ketterkat, Karin Peschel, Slavica Schu¨mann, Petra Zieme, and Jost Do¨rr for their technical assistance. We give special thanks to Do- reen Unger for her excellent and careful completion of his- tological and immunohistochemical staining. This study was supported, in part, by the Cortiss Foundation.
Disclosure Statement
No competing financial interests exist.
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20. Yacoub, M., Rasmi, N.R., Sundt, T.M., Lund, O., Boyland, E., Radley-Smith, R., Khaghani, A., and Mitchell, A. Fourteen- year experience with homovital homografts for aortic valve replacement. J Thorac Cardiovasc Surg110,186, 1995.
Address correspondence to:
Igor Tudorache, MD Department of Cardiothoracic, Transplant and Vascular Surgery, Hannover Medical School Carl-Neuberg-Str. 1 30625 Hannover Germany E-mail:tudorache.igor@mh-hannover.de Received: February 7, 2012 Accepted: February 20, 2013 Online Publication Date: April 26, 2013
1694 TUDORACHE ET AL.
Zusammenfassung
Herz-Kreislauferkrankungen sind die weltweit häufigsten Todesursachen. Angeborene oder erworbene Herzklappen Pathologien gehören zu den bedeutendsten Subgruppen dieser Erkrankungen. Weltweit finden etwa 280.000 Herzklappenoperationen pro Jahr statt. Derzeit stehen zum Ersatz von Herzklappen mechanische oder biologische Prothesen sowie kryokonservierte Allografts zur Verfügung. Die mechanischen Prothesen haben den Vorteil einer langen Haltbarkeit, aber den Nachteil, dass sie eine lebenslange Antikoagulation erforderlich machen. Die Hauptrisiken hierdurch sind Thromboembolien und Blutungen. Diese Klappentypen werden vor allem bei jüngeren Patienten (<60 Jahre) eingesetzt. Im Gegensatz hierzu erfordern biologische Prothesen keine Antikoagulation, haben bessere hämodynamische Eigenschaften, neigen aber zu rascher Degeneration, die je nach Patientenalter und Komorbiditäten unterschiedlich schnell abläuft und im weiteren Lebensverlauf mitunter einen erneuten Klappenersatz notwendig macht. Die strukturellen Veränderungen liegen bei etwa 70% bei den 20-40 jährigen und etwa 10%
bei über 70 jährigen Patienten. Biologische Klappenprothesen sind aus porcinen Herzklappen, bovinen Perikard oder Jugularvenen hergestellt. Biologische Klappenprothesen werden vor allem bei älteren Patienten (>65 Jahre) und bei Patienten implantiert, bei denen eine orale Antikoagulation nicht erwünscht ist (z.B. Schwangere und Frauen mit Kinderwunsch). Langfristig weisen sowohl die mechanische Prothesen als auch die biologische Prothesen ein erhöhtes Infektionsrisiko und kein Wachstum auf.
Als in mehrerlei Hinsicht vorteilhafte Alternative zu mechanischen oder biologischen Xenografts stehen humane Allografts (Homografts) zur Verfügung. Es gibt homovitale und kryopräservierte Homografts. Homovitale Homografts bestehen aus vitalem Gewebe und sind daher resistenter gegenüber Infektionen und haben auch den Vorteil, dass sie physiologische hämodynamische Eigenschaften besitzen. Kryopräservierten Homografts
haben den Nachteil, dass sie, ähnlich den biologischen Xenografts, zu Degeneration neigen, mit der Konsequenz, dass etwa 20% der Patienten nach 10 Jahre re-operiert werden müssen. Ein weiterer Nachteil kryokonservierter Grafts ist, dass auf Grund ihrer fehlenden Wachstumsfähigkeit die Verwendung in der pädiatrischen Herzchirurgie eingeschränkt ist, und implantierte Grafts daher regelmäßig in Folgeoperationen ersetzt werden müssen. Diese rezidivierenden Re-Operationen sind mit einem signifikant erhöhten Mortalitätsrisiko für die Patienten verbunden.
Die ideale Klappenprothese soll deshalb eine exzellente Hämodynamik, hohe Thromboseresistenz und Infektionresistenz, soll wachstumsfähig und nicht immunogen, nicht hämolytisch und wegen fehlender mechanischer Teile geräuscharm sein. Neuste Entwicklungen deuten darauf hin, dass mittels des sogenannten Tissue Engineerings ein solch idealer Klappenersatz hergestellt werden kann. Dies beinhaltet die in vitro Kultivierung verschiedener organotypischer Zelltypen auf dreidimensionalen Herzklappenmatrices. So kann unter kontrollierten Bedingungen eine biokompatible Klappenprothese mit o.g. Eigenschaften erzeugt werden. Zurzeit stehen verschiedene Matrices zur Verfügung, wie biodegradable Polymerstrukturen oder allogene und xenogene dezellularisierte Herzklappen. Dezellularisierten biologische Klappen zeigten eingesetzt in der Pulmonalposition im Tierexperiment gute Ergebnisse. Massgeblich für die Nichtthrombogenität ist das Endothel, das entweder in vitro aufgebracht werden kann oder sich in vivo wieder bildet.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war eine präklinische in vivo Testung im Schafmodell von mit Detergenzien dezellularisierten, in vitro reendothelialisierten Aortenklappenallografts im Vergleich zur Verwendung von kryokonservierten Aortenklappen.
Alle Tierversuche und chirurgischen Eingriffe wurden nach der Deutsche Tierschutzgesetzt und Europäische Richtlinie 2010/63/EU und in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die
Pflege und Nutzung von Labortieren (National Institutes of Health Publication No. 85 - 23, revidiert 1996) durchgeführt und vom zuständigen Landesamt des Landes Niedersachsen LAVES genehmigt.
Klappenkonduits mit Herzmuskelrand, Klappenannulus, Klappensegeln, kurzen Koronararterienansätzen (etwa 3-4 mm Länge) sowie Aortenwand (5 cm Länge) wurden von erwachsenen Schafen mit einem Körpergewicht zwischen 30 und 40 kg unter sterilen Bedingungen entnommen. Sofort erfolgte die Spülung für 24h in einer Mischung aus zwei Detergenzien (0,5% Natrium-Deoxycholat und 0,5% Natrium-Dodecylsulfat) für die Dezellularisierung. Um Zellreste und Detergenzien zu entfernen wurden die dezellularisierte Aortenkonduits (AK) im Anschluss mit PBS mit zusätzlich 100IE/ml Penicillin-Streptomycin gewaschen.
Nach Dezellularisierung der AK gefolgt von DNase I-Verdauung zeigten die Materialproben unter 5% verbliebene DNA im Vergleich mit nativen Gewebe.
Mittels Histologie und Immunhistochemie wurde das erhaltene dreidimensionale Klappengerüst mit präservierten Kollagen, elastischen Fasern und Glykosaminoglykanen nachgewissen. Um autologe Endothelzellen (EC) für die Re-Besiedlung des Klappengerüsts zu erhalten wurden den zukünftigen Empfängerschafen eine Jugularvene entnommen, und die EC daraus mittels Kollagenaseverdaus gewonnen (2% Kollagenase A in Medium M199). Isolierte Zellen wurden in EGM-2 ergänzt mit Wachstumszusätzen (SingleQuot mit 10% fötalem Kälberserum (FCS)) und 100 µg/ml Penicillin-Streptomycin in Kulturflaschen eingesät.
Die Re-Besiedlung wurde mittels eines Bioreaktorsystems durchgeführt, das speziell für die dynamische Kultivierung entwickelt wurde und das die hämodynamisch bedingte Klappenbewegungen ähnlich wie unter physiologischen Bedingungen imitiert. Die AK wurden steril im Bioreaktorsystem eingenäht. Im ersten Schritt der Besiedlung wurden die
dezellularisierten AK mit 500 ng CCN1 imprägniert, um die anschliessende Zellenadhäsion positiv zu beeinflussen. Diese Inkubation dauerte 12h im Brutschrank bei 37°C mit 0,05 rpm in horizontale Position rollend, um eine homogene Bedeckung mit CCN1 zu erreichen.
In der zweite Phase wurden Endothelzellen (0,5 x 107 Zellen/AK) durch einen speziell entwickelten Zellbesiedlungszulauf in das Klappenlumen injiziert. Nach der Re-Besiedlung wurde der Bioreaktor für 6h senkrecht in einen Brutschrank gestellt. Im Anschluss wurde der Bioreaktor nach der Re-Besiedelung für eine homogene Adhäsion der Zellen für weitere 6h bei 37°C auf einen Rollator (0,05 Umdrehungen/min) installiert.
Nach der Besiedelung wurde der AK enthaltende Glasreaktor an eine pulsatile Pumpe angeschlossen. Nach einem initialen pulsatilen Kreislauf von 0,1 l/min wurde der Flussstrom bis zum vierten Tag zweimal täglich um je 0,05 l/min erhöht. Danach wurde bis zum siebten Tag der Fluss täglich um 0.2 l/min erhöht und erreichte am Ende 1l/min.
Während der Kultivierung wurden der Medium - Kreislauf bezüglich Leckagen (kann die Sterilität kompromittieren), Fluss, Druck und Temperatur kontrolliert und reguliert. Der Gasaustausch im Bioreaktor fand durch eine andauernde Belüftung in der Austauschkammer statt. Das Frischgas (94% Luft und 6% CO2) wurde mittels einer Roller- Pumpe transportiert. Während der dynamischen Kultivierung wurden pO2, pCO2, Laktat, Glukose wiederholt kontrolliert. Während der dynamische Kultivierung wurde der Druck bei 80 mmHg gehalten. Parallel konnten so zwei Bioreaktoren im gleichen Zellkulturschrank betrieben werden, so dass am Ende der Kultivierung mit einem die morphologischen Aspekte der Besiedlung analysiert werden konnte. Die AK, die für die in vivo Testung vorgesehen war, wurde mitsamt dem Glasreaktor in den Operationssaal transportiert und dort direkt vor Implantation aus dem Reaktor entnommen. Reendothelialisierte (tissue engineered valves, TEV) und kryopräservierte Aortenklappen wurden in Schwarzkopfschafe orthotop implantiert.
Die Kryopräservierung der Aortenconduits wurde nach dem für die klinische Anwendung etablierten Protokoll durchgeführt. Die frisch explantierten Allografts wurden in eine kryoprotective Lösung aus 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) and 20% FCS eingebettet. Die Aortenconduits wurden kontrolliert kryopräserviert mit einer Kühlrate von -1°C/min von 15°C bis -120°C und anschließend rasch stickstoffgekühlt und in der Gasphase über flüssigem Stickstoff bei -196°C gelagert. Das Auftauen erfolgte in zwei Schritten. Als erstes wurden die kryopräservierten Aortenklappen (CPV) unter sterilen Bedingungen langsam bis -100°C erwärmt Als nächstes wurden die CPV in einem Wasserbad (37°C) erwärmt, bis makroskopisch kein Eis mehr beobachtet werden konnte.
Alle Tierversuche wurden unter tiefe Allgemeinnarkose durchgeführt. Die Einleitung der Narkose erfolgte mittels Midazolam, Propofol und Atracurium gefolgt von endotracheale Intubation des Tiers. Die Aufrechterhaltung der Narkose während des Eingriffs wurde mit einer Mischung aus Narkosegas - Isofluran und Sauerstoff gewährleistet. Die perioperative Schmerztherapie wurde mit der Gabe eines Opiats - Fentanyl, interkostale Nervenblockade mit Carbostesin sowie Gabe von Temgesic und Capriofen durchgeführt.
Eine ausreichende Analgesie wurde durch klinische Untersuchung der Tiere überprüft. Alle Tiere überlebten die Implanationsoperation. Die mittlere Klemmzeit der Aorta war 98 ± 28 min. und bei keinem Tier kam es zu neurologischen Ausfällen. Mittels transösophagealer Echokardiographie (TEE) wurden die hämodynamischen Eigenschaften der implantierten Klappenprothesen quantifiziert. Hier zeigte sich bei den CPV ein deutlich erhöhter transvalvulärer Gradient verglichen mit den TEV.
Nach 3 Monaten, bei Versuchsende, die Entnahme der Herzklappen für die Laboruntersuchungen erfolgte nach oben beschriebene Narkoseeinleitung und balancierte Anästhesie. Die Tötung des Tiers erfolgte mit Eutha-77.
Die CPV Gruppe zeigte eine Eindickung der Klappensegel und eine geringe bis mäßige Klappeninsuffizienz. Im Gegensatz hierzu zeigten sich die TEV morphologisch normal und
ohne Insuffizienz oder Stenose. Die Klappensegel in dieser Gruppe zeigten keine pathologische Veränderungen. Diese Daten, ergänzt durch Magnetresonanztomographie zeigen, dass es keine Aortenklappeninsuffizienz gab. Es gab keine Zeichen der linksventrikulären Hypertrophie und ergab keine signifikante Mitralklappeninsuffizienz.
Keine der implantierten Aortenklappenconduits zeigten Risse, aneurysmatische Dilatationen oder Infektionen. Bei den CPV zeigten sich bei der Explantation deutlich mehr Adhäsionen und die Klappensegel waren geschrumpft und verdickt. Verkalkungen und Vegetationen konnten auch beobachtet werden. Im Gegensatz hierzu zeigten die TEV eine feine Aortenwand. Die Klappensegel waren fein und durchsichtig ohne Zeichen von Verkalkungen, Fensterungen oder Vegetationen.
Die nach drei Monaten explantierten CPV zeigten eine schwere Leukozyteninfiltration und Inflammation sowie Zeichen von Klappensegelverkalkungen und in der Wand Kalziumablagerungen. Die luminale Oberfläche war mit CD31 und vWF-positiven Zellen bedeckt. Auf der luminösen Seite der explantierten TEV konnten keine Zeichen der Inflammation beobachtet werden und die Aortenwand, Sinus und Segel waren mit eNOS, CD31, vWF-positive Zellen bedeckt, was die Zellschicht als es als Endothel identifiziert.
Mit Hilfe der Phalloidin - Färbung konnte die typische kopfsteinpflasterartige EC- Morphologie dargestellt werden.
Diese Beobachtung deutet daraufhin, dass unsere Dezellularisierungsmethode zusammen mit unserer Wiederbesiedelungstechnik eine zuverlässige Methode der in vitro Reendothelialisierung der Aortenconduits mit ausgezeichneten Ergebnisse drei Monate nach der Implantation ist und dass sie hinsichtlich Inflammation gegenüber kryopräservierten Aortenconduits bessere Ergebnisse zeigt. In dieser Studie präsentierten wir den Unterschied zwischen CPV und TEV drei Monate nach Implantation. Obwohl in der CPV-Gruppe funktionell keinen großen Nachteile beobachtet werden konnten, konnten mikroskopisch und makroskopisch Degenerationszeichen dargestellt werden. In der TEV-
Gruppe zeigten sowohl die funktionellen Tests als auch die makroskopischen und mikroskopischen Beobachtungen eine fast komplette endotheltypische Bedeckung der Graftwand, Sinus und Klappensegel.
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Lebenslauf
Name: Dr. Medic Alexandru Florin Calistru Eltern: Petre Iacob Calistru
Elena Calistru
Geburtsdatum: 22.Oktober 1979, Rimnicu Vilcea, Rumänien Staatsangehörigkeit: Rumänisch
Familienstand: Ledig
Anschrift: Sommerberg 20 35394 Gießen
Handy: +49 – 1523 7040996
Email Arbeit: alexandru.calistru@chiru.med.uni-giessen.de Email Privat: alexandrucalistru@yahoo.com
Institution: Klinik für Anästhesiologie und operative Intensivmedizin Universitätsklinikum Gießen und Marburg
Rudolf-Buchheimstr. 7 35392 Gießen
Sprachen: Rumänisch – Muttersprache Deutsch – Fortgeschritten English – Fortgeschritten Französisch – Anfänger Ausbildung:
1994-98 „Matei Basarab“ High School, Bukarest, Rumänien
1998-2004 Medizinische Fakultät – Universität „Titu Maiorescu“, Bukarest, Rumänien Sept. 2004 Diplomarbeit: „Histopathologische Aspekte in HCV Hepatitis“
Berufsausbildung:
Januar 2013 – Assistenzarzt in der Klinik für Anästhesiologie, Operative Intensivmedizin und Schmerztherapie, Universitätsklinikum Gießen und Marburg, Standort Gießen
August 2011 –
Dezember 2012 Assistenzarzt auf der Intensivstation der Klinik für Herz-, Kinderherz- und Gefäßchirurgie, Universitätsklinikum Giessen und Marburg, Standort Gießen
April 2009 –
Dezember 2010 Assistenzarzt in der Klinik für Herz-, Thorax, Transplantations- und Gefäßchirurgie, Medizinische Hochschule Hannover
• Assistenzarzt: Forschung (LEBAO: April 2009 – November 2009) Normal Station (November 2009 – März 2010) Privatassistent (April 2010 – Oktober 2010)
Stationsarzt (November 2010 – Dezember 2010)
• Chirurgische Erfahrung: Erste und zweite Operationsassistent für Herzchirurgische Eingriffe, Thoraxchirurgische Eingriffe, Herz- und Lungentransplantationen, sowie Re-Eingriffe
• Forschungsrotation:
o In vitro Rebesiedelung der Pulmonal- und Aortenklappen o Implantation von tissue engineerte Pulmonalklappen
im Schaf
o Explantationen und Auswertung der implantierten Klappen
April 2008 –
März 2009 Wissenschaftlicher Mitarbeiter im Leibniz Forschungslaboratorien für Biotechnologie und künstliche Organe (LEBAO), Medizinische Hochschule Hannover, Deutschland
• Organentnahme (Schwein und Schaf) für Laboratorienzwecke (z.B. BioVAM, Aorta, a. Thoracica interna (ATI), Aortenklappen, Pulmonalklappen)
• Operateur und Assistent in der tierexperimentelle chirurgische Eingriffe Implantation von tissue engineerte Pulmonalklappen und Aortenklappen im Schaf, vaskularisiertes Magenpatch im Schwein
• ATI: Entnahme beim Schwein und beim Schaf
• Etablierung des Dezellularisierungsprotokoll der ATI
• Tissueengineerte ATI Implantationen
• Explantierung sowie Assistent der ATI Explantationen, Bearbeitung und Lagerung der Proben
März 2007 –
März 2008 Forschungsstipendiat im Leibniz Forschungslaboratorien für Biotechnologie und künstliche Organe, Medizinische Hochschule Hannover, Deutschland
• E n t n a h m e u n d D e z e l l u l a r i s i e r u n g d e r A o r t e n u n d Pulmonalklappen vom Schaf
• In vitro Rebesiedlung der dezellularisierten Aorten und Pulmonalklappen
• Organentnahme für Laboratorienzwecke (z.B. BioVAM, Aorta, a.
Thoracica interna, Aortenklappen, Pulmonalklappen) Raster Elektronen Mikroskopie (Tracheen, Haut, Herzklappen)
• Endothelzellenisolation vom Blut, Arterien und Venen Okt. 2006 –
März 2007 Thoraxchirurgische Rotation, Institut für Pneumologie „Marius Nasta“, Bukarest, Rumänien
April 2006 –
Sept. 2006 Intensivmedizin Rotation, Institut für kardiovaskuläre Krankheiten, „C. C.
Iliescu“, Bukarest, Rumänien April 2005 –
März 2006 Allgemeinchirurgische Rotation: mit mehr als 380 Operationen als Operateur, 1.Assistent und 2.Assistent: klassisch oder laparoskopisch in der Abteilung für Allgemeinchirurgie und Lebertransplantation, Klinische Institut Fundeni, Bukarest, Rumänien
April 2005 –
September 2011 Assistenzarzt für Herzchirurgie in dem Institut für kardiovaskuläre Krankheiten, „C. C. Iliescu“, Bukarest, Rumänien
März 2005 –
September 2011 Universitätsdozent für Chirurgie, Medizinische Fakultät, Universität
„Titu Maiorescu“, Bukarest, Rumänien
Teilnahme an Konferenzen, Symposien:
Februar 2013 Echokardiographie in Anästhesiologie und Intensivmedizin - TEE Kurs, Uniklinikum Gießen und Marburg
August 2012 Echokardiographie-Grundkurs - Pörtschach am Wörthersee
Januar 2012 Intensivmedizin Kompakt – HIFIT 2012 (Heidelberger Interdisziplinäres Forum Intensivtherapie)
Juni 2006 International Conference „Romanian Transplantation“, Klausenburg, Rumänien
März 2006 International Symposion of Romanian Cardiovascular Surgery Society
„Endovascular Procedure – Pros and Cons“, Bukarest, Rumänien Mai 2005 –
April 2006 Vorlesungen und Debatte der rumänische Gesellschaft für Allgemeinchirurgie, Bukarest, Rumänien
Mitgliedschaft: Deutsche Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefäßchirurgie
Veröffentlichungen:
Succesful matrix guided tissue regeneration of decellularized pulmonary heart valve allografts in elderly sheep
K. Theodoridis, I. Tudorache, A. Calistru, S. Cebotari, T. Meyer, S. Sarikouch, C.
Bara, R. Brehm, A. Haverich, A. Hilfiker Biomaterials (52), 221-228, 2015
