Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Ärztlicher und Geschäftsführender Direktor: Univ.-Prof. Dr. med. H. Bürkle
ALF-186 wirkt in vivo neuroprotektiv über die Aktivierung der löslichen Guanylatzyklase
I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät
der
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
vorgelegt 2016 von Claus Hagmann
geboren in Köln
Dekanin: Prof. Dr. Kerstin Krieglstein 1. Gutachter: Prof. Dr. med. Ulrich Göbel 2. Gutachterin: PD Dr. med. Julia Biermann
Betreuer: Prof. Dr. med. Ulrich Göbel, Dr. med. Felix Ulbrich Jahr der Promotion: 2016
meiner Oma & meinem Opa gewidmet
Diese Arbeit entstand im Rahmen des Projektes
Retinale Neuroprotektion durch die Applikation von Kohlenmonoxid freiset- zenden Molekülen (CORM) nach Ischämie-/Reperfusionsschaden in der Re-
tina
und wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG)
im Rahmen einer Sachbeihilfe (GO 2158/3-1 & BI 1567/2-1) gefördert.
Inhaltsverzeichnis ... IV 1 Abbildungsverzeichnis ... VIII 2 Tabellenverzeichnis ... IX 3 Abkürzungsverzeichnis ... X
4 Einleitung ... 14
4.1 Klinische Bedeutung und Einordnung ... 14
4.1.1 Einleitung ... 14
4.1.2 Schlaganfallproblematik in der Anästhesiologie ... 16
4.2 Pathophysiologie ... 17
4.2.1 Ischämie/Reperfusionsschaden ... 18
4.2.2 Neuronale Apoptose ... 21
4.3 Neuroprotektion ... 23
4.4 Anatomische Grundlagen ... 24
4.4.1 Netzhaut ... 24
4.4.2 Sehbahn – afferentes System zur Sehrinde... 26
4.4.3 Retinale Ganglienzellen (RGZ) ... 28
4.5 Physiologische und molekularbiologische Grundlagen ... 29
4.5.1 Kohlenstoffmonoxid (CO) ... 29
4.5.2 Kohlenstoffmonoxid freisetzende Moleküle (CORMs) ... 34
4.5.3 ALF-186 ... 36
4.5.4 Die lösliche Guanylatzyklase (sGC)... 37
4.6 Das Versuchsmodell ... 48
4.6.1 Sprague-Dawley Ratten ... 48
4.6.2 Das I/R-Versuchsmodell ... 48
4.6.3 Postkonditionierung ... 49
4.7 Ziele der Studie/Hypothesen ... 49
4.7.2 Hypothesen ... 50
5 Material & Methoden ... 51
5.1 Tiere ... 51
5.2 Narkose ... 51
5.2.1 Anästhesie zum retrograden Färben (RF) der retinalen Ganglionzellen (RGZ) ………51
5.2.2 Anästhesie zum Ischämie/Reperfusion-Versuch ... 52
5.3 Operative Eingriffe ... 52
5.3.1 Retrogrades Färben (RF) der retinalen Ganglionzellen (RGZ) ... 52
5.3.2 Ischämie-Reperfusionsschaden der Retina und Injektion von ALF-186... 55
5.4 Tötung der Tiere und Enukleation ... 59
5.4.1 Tötung der Tiere ... 59
5.4.2 Blutentnahme und Blutanalyse ... 59
5.4.3 Enukleation ... 59
5.5 Morphometrische Quantifizierung der RGZ-Dichten... 60
5.5.1 Herstellung von Retinaflachpräparaten ... 60
5.5.2 Erstellung von Netzhautfotografien mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops . 62 5.5.3 Auswertung der Netzhautfotografien ... 63
5.6 Gewinnung von zellulärem Gesamtprotein und RNA für molekularbiologische Analysen ... 64
5.6.1 Probenaufbereitung für die Bestimmung des zellulären Gesamtproteins ... 65
5.6.2 Probenaufbereitung für die Bestimmung der RNA ... 65
5.7 Proteinanalyse mittels Western Blot ... 65
5.7.1 Proteinbestimmung durch die Bradford-Methode ... 65
5.7.2 Western Blot ... 66
5.8 RNA-Analyse mittels Polymerase Kettenreaktion ... 71
5.9 Statistik ... 73
6.1 Ergebnisse der morphometrischen Quantifizierung der RGZ-Dichten ... 76
6.1.1 Gabe von ALF-186 nach I/R-Schaden führt zu weniger Zelltod von RGZ .. 76
6.1.2 Wirkung von ALF-186 auf RGZ ist bei Gabe mit 3-stündiger Verspätung nach I/R-Schaden abgeschwächt ... 77
6.1.3 Inaktiviertes iALF-186 wirkt nicht schützend auf RGZ nach I/R-Schaden .. 79
6.1.4 ALF-186-Wirkung auf RGZ nach I/R-Schaden ist bei Inhibierung der sGC abgeschwächt ... 80
6.2 Ergebnisse der Proteinanalyse mittels Western Blot ... 83
6.2.1 ALF-186 erhöht die Proteinexpression der β1-Untereinheit der sGC in RGZ nach I/R-Schaden ... 84
6.2.2 Bei Vorbehandlung der RGZ mit ODQ erhöht sich die sGC-Expression durch Gabe von ALF-186 oder iALF-186 nicht ... 86
6.3 Ergebnisse der RNA-Analyse mittels Polymerase Kettenreaktion... 88
6.3.1 Einfluss von ALF-186 und sGC auf Apoptoseproteine... 91
6.3.2 Einfluss von ALF-186 und sGC auf proinflammatorische Zytokine ... 94
6.3.3 Einfluss von ALF-186 und sGC auf Transkriptionsfaktoren ... 96
6.3.4 Einfluss von ALF-186 und sGC auf Hitzeschockproteine ... 97
6.4 Ergebnisse der Blutuntersuchungen ... 99
6.4.1 Gabe von ALF-186 zieht keine hämatologischen Veränderungen nach sich 99 7 Diskussion ... 101
7.1 Diskussion der Ergebnisse ... 101
7.1.1 ALF-186 wirkt auch bei Postkonditionierung neuroprotektiv ... 101
7.1.2 Eine neuroprotektive Wirkung von ALF-186 ist auch nach Gabe mit 3- stündiger Verspätung gegeben, jedoch abgeschwächt ... 104
7.1.3 ALF-186 ist nach Verlust von CO (iALF-186) nicht neuroprotektiv wirksam ………..106
7.1.4 Die neuroprotektive Rolle der sGC und ihre erhöhte Expression durch ALF- 186 ………..108
7.1.6 ALF-186 senkt die Expression inflammatorischer Marker ... 113
7.1.7 ALF-186 senkt die Expression des Transkriptionsfaktors NF-κB ... 114
7.1.8 ALF-186 verändert die Expression der Chaperone HSP-70 und HSP-90 ... 115
7.1.9 Blutuntersuchungen ergeben keinen Hinweis auf Immunreaktion... 116
8 Zusammenfassung ... 118
9 Literaturangaben ... 119
10Danksagung ... 130
Abbildung 1: Histologischer und schematischer Aufbau der Retina ... 25
Abbildung 2: Die menschliche Sehbahn im Schema (Quelle: Grieshaber, 2010)... 27
Abbildung 3: Symptome einer steigenden CO-Hb-Konzentration im Blut (modifiziert nach Romão et al., 2012) ... 30
Abbildung 4: CO-Inhalation vs. CORM oral (modifiziert nach Romão et al., 2012) ... 35
Abbildung 5: Chemische Struktur von ALF-186 (Quelle: Romão et al., 2012) ... 36
Abbildung 6: Schematischer Aufbau der sGC Domänen (Quelle: Campbell et al., 2014) . 39 Abbildung 7: 3D-Struktur der sGC und ihrer Domänen (Quelle: Campbell et al., 2014) .. 40
Abbildung 8: Anatomie des Rattenschädels und Bohrlöcher ... 54
Abbildung 9: Ischämie-Reperfusions-Versuch ... 56
Abbildung 10: Herstellung von Retinaflachpräparaten (Quelle: Grieshaber, 2010) ... 61
Abbildung 11: Morphometrische Quantifizierung der RGZ-Dichten in Retinaflachpräpa- raten (Quelle: Grieshaber, 2010) ... 63
Abbildung 12: Effekte unterschiedlicher Injektionen nach I/R-Schaden auf die RGZ- Dichte ... 82
Abbildung 13: Einfluss von ALF-186 auf die Proteinexpression der sGC-β1 24 bzw. 48 Stunden nach I/R-Schaden ... 86
Abbildung 14: Einfluss von ALF-186 und iALF-186 auf die Proteinexpression der sGC-β1 nach I/R-Schaden bei vorheriger Inhibierung durch ODQ ... 88
Abbildung 15: Einfluss von ALF-186 und sGC auf die Expression der Caspase 3 ... 91
Abbildung 16: Einfluss von ALF-186 und sGC auf die Expression von Bcl-2 ... 92
Abbildung 17: Einfluss von ALF-186 und sGC auf die Expression von Bax ... 93
Abbildung 18: Einfluss von ALF-186 und sGC auf die Expression von Bad ... 94
Abbildung 19: Einfluss von ALF-186 und sGC auf die Expression von IL-6 ... 95
Abbildung 20: Einfluss von ALF-186 und sGC auf die Expression von TNF-α ... 96
Abbildung 21: Einfluss von ALF-186 und sGC auf die Expression von NF-κB ... 97
Abbildung 22: Einfluss von ALF-186 und sGC auf die Expression von HSP-70 ... 98
Abbildung 23: Einfluss von ALF-186 und sGC auf die Expression von HSP-90 ... 99
Tabelle 1: Zusammensetzung der FG-Lösung... 53
Tabelle 2: Herstellung der ODQ-Stammlösung ... 58
Tabelle 3: Morphologische Unterschiede retinaler Zellen unter Fluoreszenzmikroskopie (RGZ vs. AMZ) ... 64
Tabelle 4: 10 % Trenngel ... 67
Tabelle 5: 4 % Sammelgel ... 67
Tabelle 6: 10x SDS-Laufpuffer ... 67
Tabelle 7: 10x Wet-Blot-Buffer ... 68
Tabelle 8: 10x TBS-Waschlösung ... 69
Tabelle 9: 1x TBST (0,1 % Tween) ... 69
Tabelle 10: Primärantikörper und Ladungskontrolle... 70
Tabelle 11: Mastermix-Ansatz ... 72
Tabelle 12: Verwendete Primer bei der qRT-PCR ... 73
Tabelle 13: Versuchsgruppen und Ergebnisse der morphometrischen Quantifizierung der RGZ-Dichte ... 76
Tabelle 14: FG Kontrolle vs. FG ALF ... 77
Tabelle 15: FG ALF 3h vs. FG Kontrolle vs. FG ALF ... 78
Tabelle 16: FG iALF vs. FG Kontrolle vs. FG ALF ... 80
Tabelle 17: FG ODQ/ALF vs. FG Kontrolle vs. FG ALF ... 81
Tabelle 18: Versuchsgruppen und Ergebnisse der molekularbiologischen (MB) Untersu- chungen ... 84
Tabelle 19: Versuchsgruppen und Ergebnisse der PCR Untersuchungen ... 90 Tabelle 20: Untersuchung der Gesamtleukozytenzahl (WBC) in den Versuchsgruppen . 100
AC Adenylatzyklase (adenylyl cyclase) ADP Adenosindiphosphat
AIS akuter ischämischer Schlaganfall (acute ischemic stroke) ALF-186 Alfama-186 (Na[Mo(CO)3(histidinato)])
ANP Atriales-Natriuretisches-Peptid
ARVO Association for Research in Vision and Ophthalmology ATP Adenosintriphosphat
Bad Bcl-2 antagonist of cell death Bax Bcl-2 associated X protein Bcl B-cell lymphoma
BHS Blut-Hirn-Schranke
BNP B-Typ-Natriuretisches-Peptid BSA bovines Serumalbumin
°C Grad Celsius Ca2+ Kalzium
cAMP zyklisches 3'-5'-Adenosinmonophosphat (cyclic adenosine monophos- phate)
CBF kranieller Blutfluss (cranial blood flow)
cCT CT-Bild des Kopfes (cranial computer tomography) cDNA complementary DNA
CEMT Center for Experimental Models and Transgenic Service Freiburg CGL Corpus geniculatum laterale
cGMP zyklisches 3'-5'-Guanosinmonophosphat (cyclic guanosine monophos- phate)
CHEST-1 Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension Soluble Guanylate Cyclase–Stimulator Trial -1
cm Zentimeter
cMRT MRT-Bild des Kopfes (cranial magnetic resonance tomography) CNG cyclic nucleotid-gated channels
CNP C-Typ-Natriuretisches-Peptid
Co Cobalt
CO Kohlenstoffmonoxid CO2 Kohlenstoffdioxid CO-Hb Carboxy-Hämoglobin
CORM Kohlenmonoxid freisetzendes Molekül (carbon monoxide releasing molecule)
Cr Chrom
CREB cAMP response element-binding protein CRP C-reaktives Protein
CT Schwellenwerte pro Durchlauf (cycle threshold)
DFG Deutsche Forschungsgemeinschaft DGN Deutsche Gesellschaft für Neurologie
DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid) DMSO Dimethylsulfoxid
DTPP 2,2-Dithiopyridin
et al. unter anderen (lat.: et alii/aliae/alia)
f Frequenz
Fe2+ Eisen FG Fluorogold
g Gramm
G Gauge
GABA Gamma-Aminobuttersäure (gamma-aminobutyric acid) GAPDH Glycerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase
GC Guanylatzyklase (guanylyl cyclase) GTP Guanosintriphosphat
GZS Ganglienzellschicht (Stratum ganglionicum) h Stunde/n (hour/s)
Hb Hämoglobin
HBSS Hank’s balanced salt solution Hmox Hämoxygenase kodierendes Gen
HO Hämoxygenase
H2O2 Hydrogenperoxid HSF Heat shock factor
HSP Hitzeschockprotein (heat shock protein) iALF-186 inaktiviertes ALF-186
ICB intrazerebrale Blutung (intracerebral bleeding)
ICH intrazerebrale Hämorrhagie (intracerebral hemorrhage) IFA Institut für Arbeitsschutz
IL Interleukin i.p. intraperitoneal
Ir Iridium
I/R Ischämie/Reperfusion
IRAG Inositoltriphosphat(IP3)-Rezeptor-assoziiertes cGMP-Kinase-Substrat
i.v. intravenös
K+ Kalium
kDa Kilodalton
kg Kilogramm
KG Körpergewicht
KO Knockout
l Liter
LCA linke Koronararterie (left coronary artery) LDH Laktatdehydrogenase
LPS Lipopolysaccharide
mA Milliampere
MABP mittlerer arterieller Blutdruck (mean arterial blood pressure) MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase
MB molekularbiologisch
MCA Arteria cerebri media (middle cerebral artery) mg Milligramm
Mg2+ Magnesium min Minute/n Mio. Million/en ml Milliliter μl Microliter
MLCK Myosin-Leichtketten-Kinase (myosin light chain kinase)
MLCP Myosin-Leichtketten-Phosphatase (myosin light chain phosphatase) mm Millimeter
mm² Quadratmillimeter
mmHg Millimeter-Quecksilbersäule μm Micrometer
μM Micromol
Mn Mangan
Mo Molybdän
mRNA Messenger ribonucleic acid MW Mittelwerte
n Anzahl
Na+ Natrium
NaCl Natriumchlorid
NADPH Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat
NF-κB nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells NGL Nucleus geniculatum laterale
NIRS Nahinfrarotspektroskopie (near-infrared spectroscopy)
nm Nanometer
NO Stickstoffmonoxid (nitric oxide)
NOND natürlicher Zelltod (naturally occurring cell death) NT-
proBNP
B-type natriuretic peptide
O2 Sauerstoff
O2- Hyperoxidanionenradikale
ODQ 1H-[1,2,4]Oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one
PAIS perioperativer ischämischer Schlaganfall (perioperative acute ischemic stroke)
PATENT-1 Pulmonary Arterial Hypertension Soluble Guanylate Cyclase–Stimula- tor Trial 1
PBS Phosphat-gepufferte Lösung (phospate buffered saline)
PDE Phosphodiesterase
PET Positronen-Emissions-Tomographie
pGC Partikuläre Guanylatzyklase (particular guanylyl cyclase) pH potentia Hydrogenii
PK(G/A) Proteinkinase (G/A) ppm parts per million
PVR pulmonaler vaskulärer Widerstand
qRT-PCR quantitative Echtzeit-Polymerase Kettenreaktion (real time quantitative polymerase chain reaction)
RAAS Renin-Angiotensin-Aldosteron-System
Re Rhenium
RF Retrogrades Färben RGZ Retinale Ganglienzellen
RNA Ribonukleinsäure (ribonucleic acid)
ROS reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species) rpm Umdrehungen pro Minute (revolutions per minute)
Ru Ruthenium
rtPA recombinant tissue Plasminogen Activator SD Standardabweichung (standard deviation)
SERCA Sarkoplasmatische/endoplasmatische Retikulum-ATPase sGC lösliche Guanylatzyklase (soluble guanylate cyclase) SR sarkoplasmatisches Retikulum
SV Schlagvolumen t½ Halbwertszeit
TNF-α Tumornekrosefaktor α V Vanadium oder Volt
W Wolfram
WBC Gesamtleukozytenzahl (white blood cells) ZNS Zentrales Nervensystem
4 Einleitung
4.1 Klinische Bedeutung und Einordnung
4.1.1 Einleitung
Aktuelle epidemiologische Daten besagen, dass in Deutschland jährlich annähernd 270.000 Menschen einen Schlaganfall erleiden. Knapp 200.000 dieser Patienten sind erstmals von einem Schlaganfall betroffen (Heuschmann et al., 2010). Betrachtet man die gesamte west- liche Welt, bilden Schlaganfälle die zweithäufigste Todesursache des Menschen (Feigin et al., 2014). Dazu sind sie weltweit der häufigste Grund für erworbene Behinderungen (Johns- ton et al., 2009). Laut Angaben der Stiftung Deutsche Schlaganfall-Hilfe bleiben etwa 64 % aller Betroffenen auch noch ein Jahr nach dem Ereignis pflegebedürftig – 15 % davon sind gar auf die Versorgung in einer Pflegeeinrichtung angewiesen (Pressemitteilung, Stiftung Deutsche Schlaganfall-Hilfe). Ganz unabhängig von der mit diesem Krankheitsbild erlebten Erfahrung von massiver körperlicher Einschränkung und Abhängigkeit von Pflege, sind die Folgekosten von Schlaganfällen entsprechend hoch: Schätzungen zufolge belaufen sich die durch Schlaganfälle verursachten Ausgaben in westlichen Industrienationen auf 2-5 % der gesamten Gesundheitskosten (Saka et al., 2009).
Bedenkt man, dass Inzidenz und Prävalenz von Schlaganfällen im höheren Alter ansteigen, zeichnen sich hinsichtlich des demographischen Wandels in Deutschland deutlich steigende Fallzahlen und Kosten ab, welche in Zukunft auf die Gesellschaft zukommen. In der Zukunft wird die weiter alternde Gesellschaft in Europa, bei gleichbleibender Inzidenz von Schlag- anfällen, ein bedeutend größeres Patientenkollektiv dafür darbieten. In Zahlen drücken sich Schätzungen dazu wie folgend aus: In der Europäischen Union wird die Anzahl der jährlich neu aufgetretenen Schlaganfälle möglicherweise von 1,1 Mio. im Jahr 2000 auf ca. 1,5 Mio.
im Jahr 2025 ansteigen (Truelsen et al., 2006). Allein in Deutschland könnten sich die durch Schlaganfälle verursachten und anfallenden Gesamtkosten im Zeitraum von 2010 bis 2030 auf ca. 108 Milliarden Euro erhöhen (Kolominsky-Rabas et al., 2006).
All diese Zahlen sollen verdeutlichen, dass Schlaganfälle und ihre Folgen eben keine selte- nen und individuellen Schicksale älterer Menschen sind, sondern eine allgegenwärtige The- matik darstellen, mit immer größer werdenden gesellschaftlichen Problematiken. Das Thema Schlaganfall, mit all seinen Facetten und Folgen, erfordert folglich eine immer größer werdende Aufmerksamkeit im persönlichen Leben, in der Gesellschaft und selbstverständ- lich in der Medizin. In der medizinischen Forschung wird daher seit vielen Jahren mit Nach- druck daran gearbeitet, herauszufinden, was die Ursachen und Folgen von Schlaganfällen sind. Größtes Interesse gilt dabei der Prävention von Schlaganfällen, doch kommt auch der Forschung an neuroprotektiven Substanzen, also Stoffen welche neuronale Zellen nach statt- gefundener Schädigung vor dem Zelltod schützen sollen (Ginsberg, 2008), immer größere Bedeutung zu.
Schlaganfälle werden anhand ihrer Ursache in ischämische Prozesse und Blutungen einge- teilt. Es sollte in diesem Kontext darauf geachtet werden, die Begrifflichkeiten des ischämi- schen Insults und des Schlaganfalls nicht synonym zu verwenden, was in der Praxis leider häufig der Fall ist. Akute ischämische Schlaganfälle (AIS, acute ischemic stroke) nach Ge- fäßverschlüssen machen mit 85 % den Großteil aller Schlaganfälle aus (Beal, 2010). Intra- zerebrale Blutungen (ICB, intracerebral bleeding) sind für die restlichen 15 % aller Schlag- anfälle verantwortlich und sollten in ihrem pathomechanischen Verständnis und ihrer No- menklatur auch klar von ischämischen Schlaganfällen abgegrenzt werden (Beal, 2010). Das klinische Bild eines AIS oder einer ICB kann sich sehr ähnlich darstellen – sodass sich diese nur durch bildgebende Verfahren (cCT, cranial computer tomography oder cMRT, cranial magnetic resonance tomography) voneinander differenzieren lassen. Da wir in unserem Ver- suchsmodell ausschließlich den Einfluss von Ischämie und Reperfusion (I/R) untersuchten, wird im Folgenden auch nur auf die Pathogenese und das Krankheitsbild ischämischer ze- rebraler Vorgänge Bezug genommen.
Laut der Leitlinien der Deutschen Gesellschaft für Neurologie (Stand 2012) gilt der früher häufig verwendete Begriff Apoplex als veraltet und obsolet. Dennoch werden für den ischä- mischen Schlaganfall in der Praxis häufig auch die Begriffe ischämischer Insult oder Hirni- nfarkt synonym verwendet, was unter Berücksichtigung der oben genannten Differenzierung kritisch gesehen werden kann. Der häufig in der Schweiz benutzte Begriff des Hirninfarkts beschreibt dabei eher die in der Bildgebung sichtbare Morphologie der Gehirnparenchym- nekrose, als den Vorgang der Ischämie selbst (Leitlinien der DGN, Stand 2012).
Klinisch präsentieren sich Schlaganfallpatienten typischerweise meist mit schmerzlos und hyperakut (wortwörtlich „schlagartig“) einsetzenden neurologischen Symptomen wie u.a.
Lähmungen, Gefühls-, Seh-, Sprach-, Gleichgewichts- oder Koordinationsstörungen, wobei das klinische Bild und seine Ausprägung stark von der Lokalisation des Gefäßverschlusses (A. cerebri anterior/media/posterior, A. basilaris, A. vertebralis, A. cerebelli inferior poste- rior) und der Größe des Infarktgebietes abhängig ist.
4.1.2 Schlaganfallproblematik in der Anästhesiologie
Akute ischämische Schlaganfälle sind keineswegs nur Phänomene der Notfallmedizin und der Neurologie. Sie sind auch eine bekannte perioperative Komplikation und folglich ein Problem der Anästhesiologie und der Intensivmedizin. In diesem Zusammenhang ist als be- sonders problematisch anzusehen, dass die klinische Diagnose des perioperativen ischämi- schen Schlaganfalls (PAIS, perioperative acute ischemic stroke) häufig erst verzögert ge- stellt werden kann. Gründe dafür sind vor allem der perioperative Einsatz von Sedativa und Analgetika, welche die klinischen Erstsymptome eines PAIS beim Patienten nur zeitlich ver- zögert in Erscheinung treten lassen. Zudem können motorische und sensorische Funktionen durch Operationen ebenfalls beeinträchtigt sein, was die Diagnose eines PAIS zusätzlich verzögern kann (Bartels et al., 2013). Vor allem kardiale und vaskuläre Operationen sind mit einem höheren Risiko für PAIS verbunden (Selim, 2007): Herzklappen- (2,2 %) (Filsoufi et al., 2008) und koronare Bypass-Operationen (1,7 %) (Tarakji et al., 2011) gehen dabei mit dem höchsten Risiko für PAIS einher. Bateman und Kollegen konnten jedoch nachweisen, dass auch nicht-kardiale und nicht-vaskuläre Operationen mit einem nicht zu unterschätzen- den Risiko für PAIS behaftet sind. Je nach Operation schwankt das von ihnen berechnete Risiko für PAIS zwischen 0,2 - 0,7 % pro Eingriff. Der größte Risikofaktor eines PAIS ist laut den Autoren eindeutig höheres Alter, was dadurch verdeutlicht wird, dass für Patienten über 65 Jahren das Risiko eines PAIS auf 0,3 – 1,0 % pro Eingriff steigt (Bateman et al., 2009). Die mit einem PAIS einhergehende Mortalität ist ebenfalls deutlich erhöht, wobei die Angaben verschiedener Autoren dazu zwischen 12 % bis zu 32,6 % stark schwanken (Bateman et al., 2009; Mashour et al., 2011; Bijker et al., 2012).
Perioperative zerebrale Hämorrhagien durch Gefäßrupturen sind im Vergleich zu PAIS ab- solute Raritären, sodass fast alle perioperativen Schlaganfälle auf ischämische Ereignisse zurückgeführt werden (Selim, 2007). Als häufigster Grund für PAIS werden von den Herz-
klappen oder den großen Gefäßen (v.a. Aorta und Karotiden) ausgehende arterielle Emboli- sationen angesehen (Bijker et al., 2012), doch auch paradoxe Embolien venösen Ursprungs bei offenem Foramen ovale werden als Ursachen diskutiert (Ng et al., 2011).
Neben erhöhtem Alter gibt es weitere gesicherte Risikofaktoren für die Entwicklung eines PAIS: Hyperkoagulabilität, postoperatives Kammerflimmern, perioperativer Myokardin- farkt und intraoperative Hypotension gehen nachweislich vermehrt mit PAIS einher (Bartels et al., 2013; Bateman et al., 2009). Hinsichtlich des operativen Monitorings, des mit Hypo- tension einhergehenden limitierten autoregulativen zerebralen Blutflusses, wurde deswegen in den letzten Jahren der Effekt der Nahinfrarotspektroskopie (NIRS, near-infrared spectroscopy) untersucht (Ono et al., 2013), jedoch noch ohne bewiesenen Gewinn für den Outcome der Patienten (Bartels et al., 2013).
4.2 Pathophysiologie
Da in dieser Arbeit Schäden an neuronalen Organen nach Ischämie und Reperfusion (I/R) untersucht wurden, soll im Folgenden zuerst auf die Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfalls und die Schädigungsmuster nach I/R eingegangen werden. Insbesondere die Form des apoptotischen Zelltodes soll in diesem Zusammenhang abschließend genauer be- trachtet werden, da jener beim Krankheitsbild des ischämischen Schlaganfalls von besonde- rer Bedeutung ist.
Ca. 15 % aller Schlaganfälle werden auf ICB zurückgeführt, wohingegen die restlichen 85 % ischämischer Genese sind (Beal, 2010). Innerhalb der letzteren Gruppe werden etwa 75 % aller ischämischen Schlaganfälle auf embolische Ereignisse zurückgeführt (Mergenthaler et al., 2004). Um den ischämischen Schlaganfall genauer zu verstehen, müssen die folgenden Begriffe klar definiert werden: Der Begriff Ischämie ist definiert als die Reduktion des Blut- flusses, aufgrund dessen eine suffiziente Zell- und Organfunktion nicht mehr gewährleistet ist (Woodruff et al., 2011). Zellen des zentralen Nervensystems (ZNS) reagieren auf eine Ischämie besonders sensitiv. Eine Ischämie ruft in der Folge im ZNS zelluläre Signale her- vor, welche letztendlich zum Zelltod führen. Zwischen verschiedenen Zelltypen des ZNS sind hierbei jedoch Unterschiede auszumachen: So zeigen sich etwa Zellen der weißen Sub- stanz bei Ischämie belastbarer, als solche der grauen Substanz (Mattson et al., 2001).
Eine Rekanalisation ist definiert als eine therapeutisch-interventionelle Auflösung der Ischä- mie durch Eröffnung der verschlossenen Arterie, beispielsweise durch Thrombolyse oder Thrombektomie. Unter einer Reperfusion hingegen versteht man das Wiedereinsetzen der Mikrozirkulation distal der rekanalisierten Arterie (Dalkara & Arsava, 2012; Soares et al., 2010). Der Reperfusionsschaden definiert die paradoxe biochemische Kaskade, welche für eine weitere Schädigung des ischämischen Gewebes verantwortlich ist, die parallel zu einer Rekanalisation verläuft und deren positive Effekte antagonisiert (Bai & Lyden, 2015; Pan et al, 2007).
4.2.1 Ischämie/Reperfusionsschaden
Um die Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfalls in Gänze zu verstehen, ist es not- wendig, die nur wenige Minuten nach Eintritt der Ischämie einsetzenden Schäden von Ge- hirnzellen und die Schädigungen, welche erst nach mehreren Stunden bis Tagen eintreten, streng voneinander abzugrenzen. Die Zellen, welche im Bereich der maximalen Ischämie liegen und welche vollkommen (ohne vaskuläre Kollateralen) von der Blutversorgung ab- geschnitten sind, bilden den sogenannten Kern des fokalen Infarkts (Woodruff et al., 2011).
Dieser Bereich geht durch Nekrose zugrunde und ist unwiderruflich abgestorben. Der nek- rotische Kern des Infarkts ist jedoch umgeben von Gewebe, welches zwar dysfunktional, jedoch noch metabolisch aktiv ist (Broughton et al., 2009). Dieser Bereich, Penumbra (lat.:
Halbschatten) genannt, nimmt ca. die Hälfte des Gesamtvolumens eines durch ischämischen Insult verursachten Infarktgebietes ein und ist im Gegensatz zum Kerninfarkt potentiell funktionell wiederherstellbar (Ginsberg, 1997). Die Penumbra bildet sich langsamer aus als der Kern eines fokalen Infarkts und ist abhängig von der Aktivierung bestimmter Gene, wel- che u.a. die Apoptose triggern (Dirnagl et al., 1999; Lipton, 1999; Zheng & Yenari, 2004).
Morphologisch muten die Vorgänge der Nekrose chaotisch an, da auch die unmittelbare Umgebung der nekrotischen Zellen durch die Freisetzung von Zellinhalt in Mitleidenschaft gezogen wird. Der pathologische Prozess der Nekrose ist initial geprägt von Organellen- und Zellschwellung, welche in der Folge zu einer Zerstörung der Membranen in und an der Zelle führen. Darauf folgen der Zerfall nukleärer Strukturen und zytoplasmatischer Organellen, sowie eine Freisetzung des Zellinhalts in den Extrazellulärraum (Majno & Joris, 1995;
Broughton et al., 2009). Die aufgehobenen Zellgrenzen führen zu einer Kolliquation, einer Aufweichung (lat.: colliquescere – flüssig werden) des Gewebes. Der Ablauf der Apoptose mutet im Vergleich dazu geradezu geregelt an: Er ist energieabhängig und der apoptotische
Zelltod vollzieht sich abgekapselt in der jeweiligen Zelle, ohne Einbezug der Zellumgebung (Broughton et al., 2009).
Um die durch die Ischämie hervorgerufenen Schädigungen zu unterbrechen, ist therapeu- tisch so früh wie möglich eine Wiederherstellung des Blutflusses anzustreben. Mittel der Wahl für die Lysetherapie einer thrombembolischen Komplikation ist dabei rtPA (recombi- nant tissue Plasminogen Activator) (Leitlinien der DGN, Stand 2012). Jedoch bringt die Re- perfusion nicht nur die Aufhebung der Ischämie mit sich, was therapeutisch per se positiv ist, sondern hat darüber hinaus nachweislich schädlichen Einfluss auf die Zellen des ZNS (Molina & Saver, 2005; Bai & Lyden, 2015). Noch immer sind die komplexen und teilweise parallel verlaufenden Prozesse von I/R nicht abschließend geklärt, doch hat sich durch in- tensive Forschung der letzten Jahre ein immer deutlicheres Bild von in Wechselbeziehung zueinanderstehenden und aufeinander abgestimmten Prozessen ergeben, welche letzten En- des zum Zelltod nach I/R, etwa als Folge eines ischämischen Schlaganfalls, führen (Bai &
Lyden, 2015; Woodruff et al., ,2011; Pandya et al., 2011). Auch ist nicht klar voneinander abzugrenzen, welche Schäden durch Ischämie und welche durch Reperfusion entstehen, wo- bei angenommen werden darf, dass sich einige Effekte synergistisch zueinander verhalten oder Folge voneinander sind (Bai & Lyden, 2015).
Die zeitlich zuerst einsetzende Ischämie ist in erster Linie gekennzeichnet durch einen rapi- den Verlust an Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP). Dieser kommt zustande, da der durch die Ischämie bedingte Verlust an Sauerstoff (O2) den Elektronentransport über die Atmungskette in den Mitochondrien blockiert. Da somit keine suffiziente oxidative Phosphorylierung mehr gewährleistet ist, wird die Produktion von ATP gehemmt. Dies er- fordert einen Wechsel vom aeroben zum anaeroben Stoffwechsel, doch ist auch die Glyko- lyse durch den Stopp der Substratzufuhr abgeschwächt. Die erniedrigte intrazelluläre ATP- Konzentration verursacht eine Dysfunktion der Na+/K+-ATPase, was in der Folge zu einem Influx von Na+ und Ca2+ über spannungsabhängige Kanäle führt, woraufhin die Zelle depo- larisiert (Chavez et al., 2009, Woodruff et al., 2011). Das intrazellulär erhöhte Kalzium sorgt für eine Aktivierung von zu Zellabbau führenden Proteasen, Kinasen, Lipasen und Endo- nukleasen, welche nun den intrinsischen Weg der Apoptose triggern und somit letztendlich zum Zelltod führen können (Lipton, 1999; Mattson et al., 2000).
Die Akkumulation von Ca2+ fördert die Freisetzung des exzitatorisch wirksamen Neuro- transmitters Glutamat (Siesjö, 1992). Gleichzeitig ist die ATP-abhängige Wiederaufnahme von Glutamat gehemmt (Chan et al., 1983), worauf es zu einer extrazellulären Akkumulation
des Glutamats kommt. Die Aktivierung von Glutamatrezeptoren fördert die Kalziumauf- nahme der Zelle weiter, was paradox klingt, wenn man bedenkt, dass sich die Zelle auf diese Weise selbst verletzt (sog. Glutamat-Exzitotoxizität) (Won et al., 2002; Martin & Wang, 2010).
Auch kommt es während der Ischämie zu Gewebeschäden, welche sich durch morphologi- sche Änderungen an Neuronen, wie etwa der Bildung von Mikrovakuolen im Zytosol, zei- gen. Kommt es zu einer Reperfusion, bilden sich diese in empfindlichen Neuronen schon nach kürzester Zeit aus (Sato et al., 1990).
Ein weiterer Schädigungsmechanismus von I/R ist die während dieser Prozesse massiv an- steigende Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS, reactive oxygen species) (Bai &
Lyden, 2015; Woodruff et al., 2011). Während der Ischämie bleiben viele Abbauprodukte, der durch diese hervorgerufenen Lipolyse, im gebundenen Zustand. Kommt es jedoch zur Reperfusion, werden diese schlagartig vermehrt freigesetzt: Es bilden sich ROS (Krause et al., 1988). Im gesunden Neuron fallen ROS wie Hyperoxidanionenradikale (O2-) oder Hyd- rogenperoxid (H2O2) ganz natürlich bei der Bereitstellung von Energie in den Mitochondrien an. Sie werden im gesunden Organismus darauf von antioxidativen Molekülen aufgefangen (Boveris & Chance, 1973). Dies ist von großer Wichtigkeit, da oxidativer Stress sonst zel- luläre Schäden und Dysfunktionen auslösen kann (Choi et al., 2009). Die während der Re- perfusion jedoch massiv anfallenden ROS übersteigen die Kapazität der Antioxidantien (Saito et al., 2005; Li et al., 2012), sodass es in der Folge zu oxidativen Schäden an zellulären Makromolekülen (Proteinen, Nukleinsäuren, Lipiden) kommt. Die Folgen sind mitochond- riale Schwellung, Zellverletzungen und Zelltod (Chan, 2001; Bai & Lyden, 2015).
Weitere pathologische Veränderungen können nach I/R an Zellen beobachtet werden, wie etwa eine Unterdrückung der Proteinbiosynthese (Kleihues & Hossmann, 1971) oder die Aktivierung und Biosynthese von Komplement (Arumugam et al., 2009). Auch kommt es während der Ischämiephase zur Verletzung des Gefässendothels mit Freilegung der sub- endothelialen Extrazellulärmatrix. Beim Wiedereinsetzen der Perfusion kommt es, den Ge- setzen der Gerinnungskaskade folgend, zur Adhäsion von Blutplättchen, was eine weitere Plättchenadhäsion in der Mikrozirkulation auslösen und somit zu weiterer Thrombosierung führen kann (Choudhri et al., 1998; del Zoppo, 1998). Begünstigt wird diese durch bei der Reperfusion angespülte aktivierte Leukozyten, welche für eine zusätzliche Akkumulation
von Leukozyten, Erythrozyten und Plättchen im Mikrogefäßsystem sorgen. Folgen sind mik- rovaskuläre Obstruktion, erneut herabgesetzte Perfusion und somit eine sekundäre zerebrale Ischämie (del Zoppo et al., 1991; Hallenbeck et al., 1986).
Der Antwort des Immunsystems auf einen ischämischen Schlaganfall wurde in der For- schung der letzten Jahre immer mehr Aufmerksamkeit zuteil. So konnte in Tiermodellen nachgewiesen werden, dass eine Suppression des Immunsystems (und somit eine abge- schwächte Immunantwort) mit kleineren Infarktarealen korreliert (Hurn et al., 2007). Vor allem der neuroinflammatorischen T-Zellantwort (weniger der B-Zellantwort) wird in die- sem Zusammenhang die Verantwortung für größere Infarktareale zugesprochen (Yilmaz et al., 2006).
Ein weiterer Verletzungsmechanismus ist die Schädigung der Blut-Hirn-Schranke (BHS), welche während der Ischämie geschädigt werden und danach eine erhöhte Permeabilität auf- weisen kann (Gu et al., 2011). Yang & Betz konnten in ihrer Studie sogar nachweisen, dass die BHS umso stärker geschädigt wird, je größer das reperfundierte Volumen ist (Yang &
Betz, 1994). Gründe für eine Verletzung der BHS können Schädigungen an allen Anteilen der neurovaskulären Einheit (Endothelzellen, Perizyten, glatte Muskulatur der Gefäße, Ast- rozyten, Mikroglia und Neurone), sowie perivaskuläre Ödeme sein (Bai & Lyden, 2015;
Chen et al., 2009).
4.2.2 Neuronale Apoptose
Viele neuronale Zellen durchlaufen nach I/R den apoptotischen Zelltod. Die Apoptose be- ginnt nicht unmittelbar nach Einsetzen der Ischämie, sondern erst mit einer Latenz von meh- reren Stunden, was ein therapeutisches Zeitfenster zur Unterbrechung des Zelltods eröffnet (Woodruff et al., 2011). Während der postischämischen Reperfusion steigt die Apoptoserate in Neuronen nachweislich an (MacManus & Buchan, 2000). Chelluboina und Kollegen konnten in Versuchen an Ratten nachweisen, dass bei einer fokalen zerebralen Ischämie mit Reperfusion die Expression sowohl von proapoptotischen, als auch antiapoptotischen Mole- külen auf Transkriptions- und Translationsebene erhöht ist. Die proapoptotischen Mediato- ren (Bax, Bad, Bid, Caspase 3, Cytochrom C) zeigen sich dabei in der Frühphase (24 h nach Reperfusion) erhöht, während die antiapoptotischen Moleküle (Akt, Erk 1/2, ph-Erk 1/2, Bcl-2, XIAP, Naip 2, survivin, livin, HSP27, HSP60, HSP70 und IAP) erst in einer späteren Phase des Ereignisses (bis 7 Tage nach Reperfusion) erhöht sind (Chelluboina et al., 2014).
Die Apoptose wurde zu Beginn ihrer Erforschung als „Schrumpfnekrose“ bezeichnet und erstmals von Kerr und Kollegen (1972) unter ihrem jetzigen Namen (griech.: apóptosis – das Fallen der Blätter) beschrieben. Der Name soll dabei die Natürlichkeit des Vorgangs betonen und ihn vom pathologischen Zelltod abgrenzen (Lossi et al., 2015). Beschrieben wurden die charakteristischen ultrastrukturellen Eigenschaften der Apoptose, bei welchen es zu nukleärer und zytoplasmatischer Kondensation kommt, was zu Zellfragmentierung und letztlich zur Phagozytose führt (Kerr et al., 1972). Während die Apoptose häufig als eine Form des programmierten Zelltods (PCD, programmed cell death) beschrieben wird, kommt in der neueren Literatur der Begriff des natürlichen Zelltods (NOND, naturally occurring cell death) immer häufiger zur Anwendung. Diese beiden Formen unterscheiden sich jedoch dahingehend, dass NOND den physiologisch ablaufenden Zelltod im Rahmen der Neuro- embryologie beschreibt (Lossi et al., 2015), ohne welche eine natürliche neurologische Ent- wicklung nicht möglich ist, wohingegen der Begriff PCD die Apoptose an sich nicht genauer klassifiziert. Häufig werden die Begriffe NOND und PCD jedoch synonym verwendet, was zu Abgrenzungsschwierigkeiten führen kann. Die im Rahmen dieser Arbeit untersuchte Apoptose muss jedoch als PCD angesehen werden, da der Zelltod in diesem Fall durch den zugeführten I/R-Schaden ausgelöst wird.
Für die Apoptose kann ebenfalls kein singulärer Signalweg skizziert werden, der letztendlich zum Zelltod führt. Bei der Apoptose handelt es sich um verschiedene, wechselseitige und aufeinander abgestimmte Prozesse, mit teilweise unterschiedlich starkem Einfluss auf das endgültige Absterben von Zellen. Zwei Signalwege, über welche die Apoptose eingeleitet werden kann, können jedoch voneinander unterschieden werden: Der extrinsische Weg, wel- cher die Aktivierung eines „Todesrezeptoren“ voraussetzt und der intrinsische Weg, häufig auch mitochondrialer Weg genannt (Lossi et al., 2015). Bekannt ist, dass der extrinsische und der intrinsische Signalweg eng miteinander verknüpft sind und Moleküle des einen die jeweils andere Signalkaskade beeinflussen können. Beide Signalwege resultieren letztlich in einer gemeinsamen Endstrecke, der Spaltung der proteolytischen Pro-Caspase 3, was zu ei- ner Fragmentierung der DNA führt. Es folgen der Zerfall von Zytoskelett und nukleären Proteinen. Proteine innerhalb der Zelle vernetzen und formieren sich zu apoptotischen Zell- körpern. Liganden für phagozytotische Zellrezeptoren werden exprimiert und die Zelle wird letzten Endes durch eine phagozytotische Zelle aufgenommen und beseitigt (Lossi & Me- righi, 2003; Blatt & Glick, 2001; Adams & Cory, 2002). Der extrinsische Signalweg unter- scheidet sich vom intrinsischen durch den Zeitpunkt der Caspasen-Aktivierung bzw. durch die Freisetzung von mitochondrialem Cytochrom C. Beim extrinsischen Weg, welcher die
Aktivierung eines Todesrezeptors (von „außen“) voraussetzt, wird die Effektor-Caspase vor jeglichen mitochondriellen Änderungen aktiviert. Beim intrinsischen Weg wird hingegen Cytochrom C vor einer Aktivierung der Caspasen freigesetzt (Lossi & Merighi, 2003). Wäh- rend der extrinsische Weg nur von wenigen strukturell miteinander verwandten Liganden getriggert werden kann, besitzt der intrinsische Weg eine große Bandbreite an strukturell sehr unterschiedlichen Triggern und ist häufig auch auf mehr als einen intrinsischen Stimu- lus angewiesen (Sastry & Rao, 2000).
4.3 Neuroprotektion
Eine einheitliche Definition des Begriffes Neuroprotektion existiert in der Literatur bisher nicht. Dieser Umstand scheint mehrere Gründe zu haben. Zum einen sind die pathomecha- nischen Abläufe, welche neurologischen Erkrankungen bzw. zentralnervösem Zelluntergang zugrunde liegen, bei Weitem noch nicht verstanden, zum anderen sind die bei diesen Krank- heitsbildern zu messende Endpunkte einer Genesung zu uneinheitlich.
Eine grobe, aber pragmatische Definition geben Seidl & Potashkin (2011) und Casson (2012) vor, welche Neuroprotektion als den Erhalt neuronaler Strukturen, sowie deren Funk- tionen definieren (Seidl & Potashkin, 2011; Casson et al., 2012). Unter diese Definition fal- len therapeutische Strategien oder Kombinationen therapeutischer Strategien, die sowohl primär auf direktem Weg versuchen, in die Kaskade der neuronalen Apoptose einzugreifen (Ginsberg, 2008), als auch sekundär auf indirektem Weg versuchen, neuronale Strukturen vor Schaden zu bewahren, beispielsweise durch Erhaltung der Blutzirkulation oder durch entzündungshemmende Wirkung (Wiendl et al., 2015).
Einschränkend muss jedoch angefügt werden, dass obwohl schon für mehr als 1000 Sub- stanzen auf experimenteller Ebene ein neuroprotektiver Effekt nachgewiesen werden konnte, in mittlerweile mehr als 280 klinischen Studien (Stand 2011) keine einzige Substanz entdeckt werden konnte, deren Wirkung an den (zugegebenermaßen niedrigen) Effekt der indirekten Neuroprotektion durch Thrombolyse mit rtPA heranreicht (Young et al., 2007;
Macrez et al., 2011).
4.4 Anatomische Grundlagen
4.4.1 Netzhaut
Die innerste Wandschicht des menschlichen Auges wird durch die Netzhaut oder Retina (lat.
rete = Netz) gebildet. Mit einer durchschnittlichen Dicke von 200 μm bildet sie den licht- wahrnehmenden Teil des Auges, wobei in ihren Zellen die Umwandlung eines optischen Signals (Licht) in ein neuronales Signal (elektrischer Impuls) stattfindet. Die Aufgabe der retinalen Zellen beschränkt sich jedoch nicht auf die alleinige Weiterleitung optischer Sig- nale an höhere visuelle Zentren des Gehirns, sondern beinhaltet auch schon deren Vorverar- beitung.
Die inneren zwei Drittel der Netzhaut (Ganglienzellen bis äußere plexiforme Schicht) wer- den von Netzhautarterien aus der A. centralis retinae mit Blut versorgt, wohingegen das in- nere Netzhautdrittel (Pigmentepithel und Photorezeptoren bis äußere plexiforme Schicht) durch Diffusion aus dem venösen Plexus der Aderhaut des Auges versorgt wird.
Funktionell kann die Netzhaut in zwei Teile eingeteilt werden: die Pars optica (welche aus neuronalen Zellen besteht) und die Pars caeca (welche ausschließlich aus Pigmentepithel besteht). In dieser Arbeit bezeichnet der Begriff Retina oder Netzhaut, wenn nicht anders vermerkt, ausschließlich den neuronalen Anteil der Netzhaut. Histologisch besteht die Pars optica aus neun Zellschichten (Lüllmann-Rauch, 2012, s. Abbildung 1).
Abbildung 1: Histologischer und schematischer Aufbau der Retina
LINKS: Histologischer Querschnitt durch die Retina (Quelle: http://webvision.med.utah.edu/)
gelber Pfeil: Weg des Lichts durch die Retina / roter Pfeil: Weg der neuronalen Signaltransduktion durch die Retina
RECHTS: Schematische Zeichnung der Retina mit Verschaltungsmuster der einzelnen Zelltypen (frei nach M.
Trepel – Neuroanatomie, 4. Auflage 2008, S. 346)
Auf das Pigmentepithel der Pars caeca (nur in der Schemazeichnung angedeutet) folgen die Photorezeptoren (Stratum segmentorum), bestehend aus farbwahrnehmenden Zapfen und hell-dunkel-wahrnehmenden Stäbchen. Während die Stäbchen (ca. 120 Mio. pro Netzhaut) ausschließlich in der Peripherie der Netzhaut vorkommen, befinden sich die Zapfen (ca. 6 Mio. pro Netzhaut) v.a. in der Fovea centralis. Bei Photorezeptoren handelt es sich im Ge- gensatz zu Sinneszellen in Haut, Innenohr oder Zunge um sogenannte primäre Sinneszellen, was bedeutet, dass sie funktionell das erste Neuron der Sehbahn bilden. Auf die Photorezep- toren folgt die äußere Grenzschicht (Stratum limitans externum), welche aufgrund der dort gelegenen Fortsätze retinaler Gliazellen auch als äußere Gliagrenzmembran bezeichnet wird.
Die äußere Körnerschicht (Stratum nucleare externum) beherbergt die Perikaryen der Pho- torezeptoren. In der äußeren plexiformen Schicht (Stratum plexiforme externum) liegen die nach innen gerichteten Axone der Photorezeptoren, sowie die Dendriten der Bipolarzellen.
In dieser Schicht findet die synaptische Übertragung (Transmitter: Glutamat) der visuellen
Impulse vom ersten Neuron auf das zweite Neuron der Sehbahn statt. Die innere Körner- schicht (Stratum nucleare internum) enthält nicht nur die Perikaryen der Bipolarzellen, son- dern auch gliale Müller-Zellen und die inhibitorisch wirkenden Horizontalzellen und ama- krinen Zellen. Durch hemmenden Einfluss dieser Interneurone (Transmitter: GABA und Glycin) sind diese an der intraretinalen Integration visueller Impulse beteiligt. Diese bereits erwähnte Vorverarbeitung des optischen Impulses auf Netzhautebene dient der Kontrastver- stärkung. Während die Horizontalzellen in der äußeren plexiformen Schicht an den Synap- sen wirken, bilden die amakrinen Zellen vornehmlich in der inneren plexiformen Schicht (Stratum plexiforme internum) hemmende Synapsen aus. Diese Schicht besteht außerdem vorrangig aus den Axonen der Bipolarzellen und den Dendriten der multipolaren Ganglien- zellen. In dieser Schicht findet somit die synaptische Übertragung (Transmitter: Glutamat) der visuellen Impulse vom zweiten auf das dritte Sehbahnneuron statt. Die Perikaryen der glutamatergen retinalen Ganglienzellen liegen in der Ganglienzellschicht (GZS, Stratum ganglionicum), deren, im Bereich der Netzhaut noch marklose Axone, die Nervenfaser- schicht (Stratum neurofibrarum) bilden, welche zudem die großen Blutgefäße der Netzhaut enthält. Die Axone ziehen gemeinsam zur Sehnervenpapille (Papilla nervi optici), wo sie sich zum II. Hirnnerven, dem Sehnerven (Nervus opticus), bündeln. Die letzte Schicht der Netzhaut bildet die innere Grenzschicht (Stratum limitans internum oder innere Gliagrenz- membran), welche die Retina vom Glaskörper abschließt. Sie besteht aus langen Fortsätzen der glialen Müller-Zellen.
4.4.2 Sehbahn – afferentes System zur Sehrinde
Die Netzhaut des menschlichen Auges bildet wie angesprochen den lichtwahrnehmenden Anteil des zentralen Nervensystems (ZNS). Die Bereiche an welchen das Sehen, also die Wahrnehmung der empfangenen Lichtreize, stattfindet, liegen jedoch im Okzipitallappen des Großhirns. Den Weg von der Wahrnehmung eines Lichtreizes an der Retina, bis hin zum letztendlichen Sehen dieses Reizes im Okzipitallappen, bildet die sogenannte Sehbahn, wel- che im Folgenden skizziert werden soll.
Abbildung 2: Die menschliche Sehbahn im Schema (Quelle: Grieshaber, 2010)
H: Hypothalamus, AP: Area pretectalis, CS: Colliculi superiores, CGL: Corpus geniculatum laterale
Der Sehnerv beginnt mit dem Austritt der Axone aus der Sehnervenpapille und tritt aus der Orbita durch den Canalis opticus in die Schädelhöhle ein. Über der Hypophyse vereinigt er sich mit Anteilen des gegenüberliegenden Sehnervs zum Chiasma opticum, wobei im Chiasma alle Fasern der medialen Netzhauthälfte, welche folglich das laterale Gesichtsfeld darstellen, zur Gegenseite kreuzen (s. Abbildung 2). Im sich an das Chiasma opticum an- schließenden Tractus opticus verlaufen nun jeweils die Fasern der ipsilateralen temporalen und der kontralateralen nasalen Netzhauthälften, welche das entsprechende entgegenge- setzte Gesichtsfeld repräsentieren. Im Corpus geniculatum laterale (CGL) des Thalamus en- den die Fasern des Tractus opticus und werden dort auf das 4. Neuron der Sehbahn umge- schaltet. Zuvor gibt der Tractus opticus noch Kollateralen an Hypothalamus, Area pretectalis und zum Tectum des Mittelhirnes ab, was erklärt, warum auch bei Zerstörung des CGL oder der nachgeschalteten Sehbahn bestimmte optische Reflexe erhalten bleiben. Vom CGL aus- gehend läuft die Sehbahn über die weit gestreute Gratiolet-Sehstrahlung (Radiatio optica)
weiter zur Sehrinde im Okzipitallappen. Die Sehstrahlung verläuft entlang der medialen und lateralen Wände des Hinter- und Unterhorns der Seitenventrikel im Temporallappen.
Von den Zellen der Retina bis zur Großhirnrinde am Okzipitalpol lassen sich die Sehbahn- fasern in ein magnozelluläres und ein parvozelluläres System einteilen (siehe Kapitel 1.4.3).
Beide Systeme unterscheiden sich funktionell dahingehend, dass das magnozelluläre System vor allem der Bewegungswahrnehmung und der nicht-farbwahrnehmenden groben Objekt- wahrnehmung dient, wohingegen hochauflösendes Sehen und Farbwahrnehmung Aufgabe des parvozellulären Systems ist. Die beiden Systeme verlaufen in ihren Strängen von der Retina bis zum Kortex weitgehend getrennt von- und dennoch parallel nebeneinander. Bis zum Kortex ist dieser Verlauf vor allem retinotopisch, also nach der Lokalisation des Impul- ses auf der Retina, geordnet. Die topische Trennung beider funktioneller Systeme findet erst im Kortex statt. Die Efferenzen der Sehstrahlung aus dem CGL verlaufen zur primären Sehrinde (Area striata, Area 17 nach Brodmann) und enden dort retinotopisch gegliedert.
Somit kann, zumindest theoretisch, jedem Bereich der Retina ein bestimmtes Areal im visu- ellen Kortex zugeordnet werden. Die Fovea centralis, als Ort des schärfsten Sehens, nimmt dabei schon ca. 80 % der gesamten primären Sehrinde ein. Die Area 17 ist der zerebrale Ort, an welchem nun erstmals die visuellen Impulse aus der Netzhaut „bewusst werden“. Integ- rative Verarbeitung bzw. erkennendes Zuordnen des nun „Gesehenen“ finden erst in der se- kundären Sehrinde (Areae 18 und 19) statt, wohin die Efferenzen der primären Sehrinde verlaufen. Die Areae 18 und 19 umranden die primäre Sehrinde am Okzipitalpol, von wo aus ihre Efferenzen, entsprechend ihrer Aufgabe als Zuordnungsorgane des visuellen Inputs, mit zahlreichen kortikalen Arealen verknüpft sind, welche die erhaltenen Informationen ver- arbeiten und entsprechende „Maßnahmen“ zur Integration und Weiterverarbeitung einleiten.
4.4.3 Retinale Ganglienzellen (RGZ)
Da die RGZ die untersuchten Zellen dieser Arbeit darstellen, sollen deren Klassifikation, Eigenschaften und Besonderheiten im folgenden Abschnitt genauer erläutert werden. Wie schon angesprochen liegen die Perikaryen der RGZ in der Ganglienzellschicht (GZS, Stra- tum ganglionicum) der Netzhaut neben amakrinen Zellen, Astrozyten, Endothelzellen und Perizyten. Ihre Dendriten verzweigen sich in feinen, genau definierten Schichten in der in- neren plexiformen Schicht und ihre Axone enden in der magno- oder parvozellulären Schicht des Nucleus geniculatum laterale (NGL) im gleichnamigen Corpus des Thalamus. In der menschlichen Retina befinden sich ca. 1,2 Mio. RGZ, wobei jedoch große Variabilität
herrscht. Ca. 69 % der RGZ befinden sich in ihrer Lage in direkter Nachbarschaft zur Fovea centralis, wo sie für etwa 30° des zentralen Gesichtsfeldes sorgen.
RGZ lassen sich in ihrem in ihrem zellulären Aufbau, sowie in ihrem ausdifferenzierten physiologischen Verschaltungsmuster in verschiedene Subtypen unterteilen. Hierbei sei je- doch auf die entsprechende Fachliteratur verwiesen.
Abschließend bleibt zu erwähnen, dass vor allem das Verständnis wichtig ist, dass visuelle Wahrnehmung nicht nur die Aufnahme und Weiterleitung optischer Reize durch die Pho- torezeptoren, sondern mit all ihren Facetten (Kontrast, farbliche Zusammensetzung, Objekt- form und Bewegung) eine integrative Leistung des retinalen/zentralen Neuronensystems als Ganzes ist.
4.5 Physiologische und molekularbiologische Grundlagen
4.5.1 Kohlenstoffmonoxid (CO) Allgemeine Eigenschaften
Kohlenstoffmonoxid beschreibt die chemische Verbindung von Sauerstoff und Kohlenstoff mit der Summenformel CO, welche unter anderem bei der unvollständigen Verbrennung organischer Materie entsteht. Es ist ein farb-, geruch-, sowie geschmackloses Gas mit einem Schmelzpunkt von -205,0 °C und einem Siedepunkt von -191,5 °C und seine Reaktivität steigt bei erhöhter Temperatur (GESTIS-Stoffdatenbank des IFA).
Exogene Entstehung und Toxizität
CO entsteht auf natürlichem Wege bei der Verbrennung kohlenstoffhaltiger Stoffe. Somit ist eine CO-Vergiftung häufig Bestandteil einer Rauchvergiftung. Da CO ein relativ schwach wasserlösliches Gas darstellt, gelangt es per inhalationem leicht in die Alveolen, von wo es dann rasch ins Blut gelangt. Da CO eine bis zu 210-fach höhere Affinität für Hämoglobin (Hb) (Ganong, 1995) als Sauerstoff (O2) besitzt, besetzt es leichter als dieses die Fe2+-Bin- dungsstelle am Häm, wodurch der O2-Transport ins Blut unterbrochen wird (Schmidt, 2010).
Ebenso sorgt CO für einen Übergang des Hämoglobins in die R-Struktur und somit für eine Linksverschiebung der O2-Bindungskurve. Dies wiederum reduziert die Sauerstofffreiset- zung im Gewebe, was die O2-Partialdrücke in den Gewebskapillaren noch weiter senkt (Schmidt, 2010; Blumenthal, 2001). Während physiologischerweise 1 % des Gesamt-Hbs als Carboxy-Hb (CO-Hb) vorliegt, kann sich bei chronischer oder akuter Exposition dessen
Anteil stark erhöhen. Während bei langjährigen Rauchern der Anteil des Carboxy-Hbs am Gesamt-Hb durch die Entstehung von CO bei der (unvollständigen) Verbrennung zwischen 5-15 % schwanken kann, was per se schon gesundheitsschädlich ist, entstehen bei der akuten CO-Vergiftung schnell CO-Hb-Anteile von > 40 %, was als lebensbedrohliche Intoxikation einzustufen ist (Schmidt, 2010). Die Symptome einer Intoxikation mit Kohlenstoffmonoxid sind vielfältig und vor allem abhängig von Dauer und Konzentration der CO-Exposition (Romão et al., 2012) (s. Abbildung 3).
Abbildung 3: Symptome einer steigenden CO-Hb-Konzentration im Blut (modifiziert nach Romão et al., 2012)
Während die auffallend rosige Hautfarbe von CO-Vergifteten, hervorgerufen durch die hell- rote Farbe des Carboxy-Hbs, ein sehr spezifisches Phänomen der CO-Intoxikation darstellt, scheinen die weiteren zu beobachtenden Leiden von eher allgemeinerer Symptomatik zu sein: So zeigen sich bei CO-Intoxikierten initial häufig Kopfschmerzen, Übelkeit, Erbrechen oder Schwächegefühl. Durch die steigende Hypoxämie offenbart sich dann im Verlauf eine Laktatazidose (Blumenthal, 2001). Da die Bindungsaffinität von CO für Myoglobin sogar noch höher als für Hämoglobin ist, führt die steigende Bindung von CO ans Myoglobin zu verminderter Herzleistung, Hypotension und Arrhythmien (Raub et al., 2000). Kausale The- rapiemöglichkeiten einer CO-Vergiftung sind die Beatmung mit reinem Sauerstoff (100 %) oder die hyperbare Sauerstofftherapie (Weaver, 2014).
Endogene Entstehung und Bedeutung von CO
Die Hypothese, dass CO nicht nur exogen aufgenommen werden kann, sondern auch von Organismen selbst, also endogen, produziert wird, wurde schon vor über einem Jahrhundert aufgestellt, jedoch erst Mitte des letzten Jahrhunderts explizit untersucht (Coburn et al., 1963; Sjostrand, 1970). Das Enzym, welches heute für die endogene Produktion von CO als verantwortlich gilt, wurde jedoch erst 1968 von Tenhunen (Tenhunen et al. 1968 & 1969) beschrieben. In dieser Arbeit wurde auch die bis heute geltende Lehrmeinung aufgestellt, dass CO beim Abbau von Häm durch das Enzym Hämoxygenase (HO) zusammen mit Bi- liverdin und Fe2+ anfällt. Ebenso wurde postuliert, dass die Hämoxygenase bei dieser Reak- tion abhängig von NADPH (Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat) und Sauer- stoff arbeitet. Seit der Entdeckung und Benennung der Hämoxygenase hat die Forschung über dieses Enzym und seine Stoffwechselprodukte, u.a. CO, stark zugenommen. Gerade über das bis dato vorrangig für seine giftigen Eigenschaften bekannte Gas CO wurden im Laufe der Jahre immer mehr Daten veröffentlicht, welche dessen vielfältiges therapeutisches Potential beschreiben (Motterlini & Otterbein, 2010). So wurde in etlichen Veröffentlichun- gen die neurologische und vaskuläre Bedeutung von endogenem CO für das Erinnerungs- vermögen (Zhuo et al., 1993), den zirkadianen Rhythmus (Boehning & Snyder, 2002) oder die hämodynamische Regulation (Kobayashi et al., 2007) beschrieben. Als letztendlich be- weisend für den zytoprotektiven Einfluss von CO und seinem Zusammenspiel mit der HO gelten vor allem Beobachtungen über Organismen, in welchen ein Defekt des Isoenzyms HO-1 beobachtet wurde. So etwa in einem Fallbericht eines 6-jährigen Patienten mit nach- gewiesener HO-1-Defizienz (Yachie et al., 1999), welcher unter anderem an schwerer Wachstumsretardierung, persistierender hämolytischer Anämie und schweren Endothel- schäden bei abnormaler Koagulation und Fibrinolyse litt und in der Folge auch an seiner Erkrankung verstarb.
In einer Veröffentlichung von Poss & Tonegawa (1997), welche mit Knockout-Mäusen ohne funktionelle HO-1 (Hmox1-/-) arbeiteten, wurde die universelle Bedeutung des Enzyms er- neut nachgewiesen. So starben die Hmox1-/- Mäuse schon als Embryonen deutlich häufiger (> 95 %) als die gesunden Kontrolltiere. Auch lebende, erwachsene Mäuse mit einer nicht physiologisch ausgebildeten HO-1 starben signifikant früher, wobei sich vor allem Endorg- anschäden in der Leber (Lebernekrosen durch erhöhten hepatozellulären Eisenanstieg) ver- antwortlich zeigten. Auch waren die Tiere deutlich anfälliger für jegliche Form von Stres- sexposition.
Hämoxygenasen existieren im menschlichen Organismus in zwei Isoformen: die induzier- bare HO-1 und die konstitutive HO-2 (Maines et al., 1986; McCoubrey et al., 1997). Wäh- rend auf Zellebene das Vorkommen der HO-1 ubiquitär (endoplasmatisches Retikulum, Zy- toplasma, Mitochondrien, Peroxisomen) zu sein scheint, wurde die HO-2 bisher vorrangig im endoplasmatische Retikulum nachgewiesen (Mahan, 2012). Die Katalyse von Häm ist für den Organismus von essentieller Bedeutung, da hohe Konzentrationen von Häm sowohl oxidative, als auch toxische Wirkungen erzielen. Durch die Hämoxygenasen werden freie Häm-Moleküle in Konzentrationen gehalten, in deren Bereich sie ihren wichtigen physiolo- gischen Aufgaben als Transportmolekül für Sauerstoff nachgehen können.
Auf Gehirnebene wurde sowohl HO-1 (Gyrus dentatus (Hippocampus), Hypothalamus, Ce- rebellum, Hirnstamm), als auch HO-2 (Bulbus olfactorius, Pyramidenzellen von Cortex und Hippocampus, Granulazellen des Gyrus dentatus, Hypothalamus, Thalamus, Cerebellum, Hirnstamm, Typ-I-Astrozyten) nachgewiesen, doch kommt die Isoform HO-2 im Gehirn in bedeutend höheren Konzentrationen vor und scheint fast für die komplette endogene CO- Produktion im Gehirn zuständig zu sein (Vincent et al., 1994). Einzig im Hoden scheint die HO-2 ebenfalls ein höheres Vorkommen als ihre Isoform HO-1 aufzuweisen. In den meisten Geweben (v.a. Leber und Milz) scheint dagegen jeweils die induzierbare HO-1 stärker ver- treten zu sein, als ihr konstitutives Pendant (Ryter et al., 2006).
Während die HO-2 eine konstitutive und somit nicht induzierbare Isoform der Hä- moxygenase darstellt, können die unterschiedlichsten Faktoren eine Erhöhung der HO-1 in- duzieren. Dabei sind Stickstoffmonoxid (NO) (Datta & Lianos, 1999), Ischämie, Hypoxie (Carraway et al., 2000), bakterielle Lipopolysaccharide (LPS) oder eine Vielzahl an chemi- schen Agenzien nur ein paar Beispiele in einer langen Reihe von Induktoren (Klemz, 2009).
Hinsichtlich der Eigenschaften von CO lässt sich festhalten, dass das Gas in quasi allen Ge- weben nachgewiesenermaßen zytoprotektiv, antiinflammatorisch, vasodilatatorisch, antia- poptotisch, sowie auf ZNS-Ebene neuroprotektiv wirksam sein kann. Nun stellt sich die Frage, auf welchen zellulären Signalwegen diese Eigenschaften von CO beruhen und welche molekularen Erkenntnisse sich darüber in der bisherigen Forschung finden lassen. Ausge- hend von der grundlegenden Arbeit von Klemz (2009) lässt sich sagen, dass die verschiede- nen Wirkungen von CO im Organismus einem Netzwerk von regulatorischen Signalwegen zugrunde liegen und nicht nur ein konkreter Mechanismus dafür verantwortlich gemacht werden kann. Hinsichtlich der antiapoptotischen Wirkung von CO scheint vor allem dessen Beeinflussung auf verschiedene Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPK) eine Rolle zu
spielen (Brouard et al., 2000; Biermann et al., 2010; Schallner et al., 2012), wobei vor allem eine indirekte oder direkte Änderung des Phosphorylierungsstatus der MAPK eine Rolle zu spielen scheint, auch wenn der genaue Mechanismus darüber bisher ungeklärt ist (Morse &
Choi, 2005). Dabei gilt vor allem eine erhöhte Phosphorylierung der β-Untereinheit der MAPK p38 durch CO als Signalweg, über welchen die Expression und Wirkung der proapoptotischen Caspase 3 gesenkt wird (Zhang et al., 2003; Brouard et al., 2000; Biermann et al., 2010; Schallner et al., 2012). Ebenso scheint eine erhöhte Phosphorylierung der MAPK ERK1/2 (Schallner et al., 2012) eine Rolle zu spielen, genauso wie eine Senkung des Tumornekrosefaktors α (TNF-α) über p38 (Brouard et al., 2000).
Die normalerweise Lipopolysaccharid-induzierte Erhöhung von TNF-α wird im Rahmen von inflammatorischen Vorgängen beobachtet und kann durch CO nachgewiesenermaßen erniedrigt werden, was zur Minderung der Entzündungsreaktion beiträgt (Otterbein et al., 2000). Weitere Studien beobachten eine in der Folge antiinflammatorisch wirksame Hem- mung von TNF-α durch CO in verschiedenen Geweben - etwa in Hepatozyten in vitro (Sass et al. 2003; Kim et al. 2006) oder in RGZ in vivo (Biermann et al., 2010). Auch scheint CO auf die Expression bestimmter Zytokine eine hemmende (wie auf das proinflammatorische Interleukin-1β) oder fördernde (wie auf das entzündungshemmende Interleukin-10) Wir- kung zu besitzen (Otterbein et al., 2000).
Sowohl hinsichtlich der entzündungshemmenden, als auch der zytoprotektiven Wirkungs- weise von CO, lassen sich in Studien wiederholt Zielmoleküle ausmachen: So wurden in mehreren Studien erhöhte Synthese und DNA-Bindung des Transkriptionsfaktors Heat Shock Factor 1 (HSF-1), sowie einiger seiner Genprodukte, u.a. Heat Shock Protein 70 und 90α (HSP-70, HSP-90α), nach CO-Gabe in verschiedenen Geweben nachgewiesen (Kim et al., 2005; Göbel et al., 2009; Loop et al., 2012; Biermann et al., 2010), die zytoprotektive Effekte mit sich bringen.
Die große strukturelle Ähnlichkeit von Kohlenstoffmonoxid (CO) und Stickstoffmonoxid (NO) wird zudem als Grund angenommen, dass es beiden Stoffen möglich ist, aktivierenden Einfluss auf die lösliche Guanylatzyklase (sGC, soluble guanylate cyclase) zu nehmen (Lee
& Yen, 2009; Li et al., 2009), wodurch nachweislich zytoprotektive Effekte vermittelt wer- den.
Ebenfalls neuroprotektive Effekte werden CO auch im Hinblick auf die Beeinflussung an- derer zellulärer Signalkaskaden zugewiesen, wie etwa die aktivierende Wirkung auf das cAMP response element-binding protein (CREB), einem Transkriptionsfaktor, welcher die
Expression von Genen, die für Plastizität, Wachstum und Überleben neuronaler Strukturen sorgen, positiv beeinflusst (Lonze & Ginty, 2002). Auch Biermann und Kollegen wiesen in ihrer Studie (2010) eine erhöhte DNA-Bindungsaktivität von CREB in RGZ nach I/R-Scha- den nach präkonditionierender Inhalation von CO nach. Die Arbeitsgruppe um Schallner und Kollegen (2012) wies sogar bei Postkonditionierung durch inhalatives CO in RGZ nach I/R-Schaden diverse neuroprotektive Mechanismen nach, etwa eine erniedrigte mRNA- und Proteinexpression des proapoptotischen Bax-Proteins, sowie eine Erhöhung in den Expres- sionen des antiapoptotischen Bcl-2-Proteins. Speziell für retinale Zellen sind wiederholt zy- toprotektive Effekte nachgewiesen worden, etwa durch Senkung des oxidativen oder ischä- mischen Schadens retinaler Zellen nach Induzierung eines CO-Anstiegs durch Flavanoide (Szabo et al., 2004; Hanneken et al., 2006). Eine Studie von Resch und Kollegen (2005) wies zudem erhöhte retinale und choroidale Blutflüsse nach Inhalation von CO bei gesunden Menschen nach, was hinsichtlich der schon beschriebenen vasodilatativen Wirkung von CO nachvollziehbar erscheint (Resch et al., 2005).
Des Weiteren wird von CO, wie auch von NO, angenommen, dass sie als Neurotransmitter fungieren (Snyder et al., 1998), da sie als niedermolekulare, sowie wasserlösliche Gase schnell und relativ unbehindert Biomembranen durchdringen können.
4.5.2 Kohlenstoffmonoxid freisetzende Moleküle (CORMs)
Den nun ausführlich beschriebenen positiven Effekten von CO stehen dessen Toxizität und seine geringe Spezifität im Organismus als größte pharmakologische Hürden gegenüber.
Motterlini und Kollegen schlugen daher als Erste vor, dass CO mithilfe von sogenannten Kohlenmonoxid-freisetzenden Molekülen (CORMs, carbon monoxide releasing molecules) kontrolliert verabreicht werden sollte (Motterlini et al, 2002).
Beim Einatmen von Kohlenstoffmonoxid sind CO-Hb-Level im Blut von unter 10 % symp- tomfrei und somit therapeutisch anzustreben (s. Abbildung 3). Jedoch ist eingeatmetes CO unterhalb dieser Grenze quasi therapeutisch wirkungslos (Romão et al., 2012). Goldbaum zeigte jedoch schon im Jahr 1975 mit Versuchen an Hunden, dass bei intravenöser Gabe von ex vivo hergestelltem CO-Hb, die Tiere bedeutend höhere Carboxy-Hämoglobin-Spiegel im Blut tolerieren, als wenn sie CO inhalieren (Goldbaum et al., 1975). Somit scheint es mög- lich zu sein, dass die 10 %-Hürde für toxische CO-Hb-Spiegel v.a. für inhalativ verabreichtes CO gilt, wohingegen bei intravenös verabreichtem und gebundenem CO möglicherweise bedeutend höhere Spiegel vom Körper toleriert werden können (Romão et al., 2012). Zudem
wird eingeatmetes CO vom eisenhaltigen Häm des Hämoglobins zum größten Teil schon im Blut der Lungengefäße gebunden, was dazu führt, dass das CO überhaupt nicht an seinen therapeutisch erwünschten Wirkungsort gelangt. CORMs können dagegen nach oraler Auf- nahme oder intravenöser Injektion in den Blutkreislauf gelangen und sind in der Lage, das gebundene CO im Zielgewebe abzugeben (s. Abbildung 4) (Romão et al., 2012).
Abbildung 4: CO-Inhalation vs. CORM oral (modifiziert nach Romão et al., 2012)
Eine große Anzahl unterschiedlicher Moleküle ist in den letzten Jahren auf ihre Fähigkeit, CO zu binden und im Gewebe freizusetzen, untersucht worden: In erster Linie metallorga- nische Komplexe (Cr, Mo, Mn, Re, Fe, Ru, V, Co, Ir, W) sowie Elementverbindungen der Hauptgruppen (ɑ,ɑ-Dialkylaldehyde, Oxalate, Borcarboxylate und Silacarboxylate) (García- Gallego & Bernardes, 2014; Romão et al., 2012). Organometallische Kompexe aus Metallen der Nebengruppen 6,7,8 und 9 (Cr, Mo, Mn, Re, Fe, Ru) zeigten sich aufgrund ihrer kineti- schen und thermodynamischen Stabilität dabei als die geeignetsten Verbindungen (Motter- lini et al., 2005; Pitchumony et al., 2010; Zobi, 2013; Romão et al., 2012). Organometalli- sche CORMs können das CO-Molekül relativ stabil binden und schnell im Zielgewebe ab- geben, wo es frei durch Membranen diffundieren kann. Genaue Zielmoleküle konnten für CORMs jedoch noch nicht definiert werden – es besteht aber der Verdacht der Interaktion mit Übergangsmetallen in Enzymen (Romão et al., 2012).
Da die molekularen Zielstrukturen von CORMs noch ungeklärt sind, ist die Bandbreite der Grundlagenforschung daran entsprechend groß. Vor allem wird ihr Potential bei der Wir- kung hinsichtlich inflammatorischer Krankheitsmodelle (Guillén et al., 2008; Nobre et al., 2007; Bani-Hani et al, 2006), sowie hinsichtlich der Zytoprotektion vor Zelltod nach ver- schiedenen Stressreizen wie Hypoxie oder I/R-Schaden untersucht (Schallner et al., 2013;
Yabluchanskiy et al., 2012).
4.5.3 ALF-186
Bei dem in dieser Arbeit untersuchten ALF-186 (Na[Mo(CO)3(histidinato)]) handelt es sich um einen oktaedrischen, nullwertigen Molybdän-Carbonyl-Komplex, dessen Struktur sich wie in der Abbildung 5 darstellt (Seixas et al., 2013; Romão et al., 2012).
Abbildung 5: Chemische Struktur von ALF-186 (Quelle: Romão et al., 2012)
Das wasserlösliche CORM erweist sich unter anaeroben Bedingungen als sehr stabil (anae- rob: t½ ~ 97 min). In Wasser gelöst und im Dunkeln bei Raumtemperatur gelagert, bleibt das Molekül ca. drei Monate lang stabil. Bei Kontakt mit Sauerstoff dekompensiert ALF-186 jedoch rasch und es kommt zur schnellen Freisetzung von CO (aerob: t½ ~ 24 min) (Motter- lini & Otterbein, 2010). Bei intraperitonealer (i.p.) oder intravenöser (i.v.) Injektion von ge- löstem ALF-186 kommt der Komplex in Kontakt mit molekularem Sauerstoff, wodurch das freigesetzte CO in die systemische Zirkulation gelangt, von wo es, an Hämoglobin gebunden oder ungebunden, ins Gewebe wandert (Seixas et al., 2013; Motterlini & Otterbein, 2010).
Die Mo(0)-Anionen lassen CO im sauren Milieu, bei einem pH~2.0 im Vergleich zu einem pH~7.0, etwa nur halb so schnell frei. Diese pH-spezifische Freisetzung erweist sich bei- spielsweise praktisch bei oraler Aufnahme, da das vom CORM freigesetzte CO nicht schon im Magen verloren geht (Romão et al., 2012).
Das CO-Hb-Level nach ALF-186-Injektion (i.p./i.v.) erreicht nach etwa 5-15 min bei einem Anteil von 12-25 % sein Maximum (Sheikh et al., 2011; Motterlini & Otterbein, 2010). ALF- 186 setzt jedoch CO nicht nur durch Oxidation frei. Hämproteine wie Methämoglobin oder Metmyoglobin im Blut und im Gewebe besitzen hohes Redoxpotential, sodass das elektro- nenreiche ALF-186 leicht mit diesen interferiert. Durch CO-Abgabe an diese reduziert ALF-
