Ischämie-Reperfusionsschaden der Retina und Injektion von ALF-186

Nach Einleitung der Narkose wurde der Schwanz der Ratten mit einem alkoholischen Hau-tantiseptikum (Kodan® Tinktur - Schülke & Mayr GmbH, Norderstedt) desinfiziert. Dann wurde in die Schwanzvene der Tiere ein 24 G i.v.-Katheter (BD-Insyte-W™ - Becton Dick-onson, Franklin Lakes/NJ, USA) gelegt, über welchen im Weiteren intravenöse Applikatio-nen (Gabe von ODQ/PBS/ALF-186/iALF-186) möglich waren. Der i.v.-Katheter wurde mit-hilfe von hypoallergenem Fixierpflaster (Leukoflex® - BSN medical, Hamburg) am Schwanz des Tieres befestigt. Stets wurde der i.v.-Katheter vor Benutzung mit 0,9 % NaCl gespült, um eventuellen Paravasatkomplikationen vorzubeugen.

Die Tiere wurden nun in einer stereotaktischen Vorrichtung fixiert und das zu punktierende linke Auge wurde mit lokalanästhetisch wirksamen Augentropfen (Ophtocain®-N - Dr.

Winzer Pharma, Berlin) zusätzlich betäubt. Das nicht-punktierte Auge des Tieres wurde da-gegen mit regenerierender Augensalbe vor Austrocknung geschützt.

Die Schmerzfreiheit der Tiere wurde nach gleichem Prinzip wie beim RF evaluiert. Nur wenn die Tiere keine Reaktion (Zucken, Tachypnoe, Vibrieren der Schnurrhaare) auf diesen Schmerzreiz zeigten, erfolgte der Eingriff.

I/R-Schaden der Retina

Nach Anästhesie, entsprechenden präoperativen Maßnahmen und eventueller Vorbehand-lung mit ODQ mit einstündiger Vorlaufzeit, folgte die Schädigung der Retina via Ischä-mie/Reperfusion. In unserem Modell wurde am linken Auge des Tieres der I/R-Schaden er-zeugt, während das rechte Auge als Kontrolle diente.

Unter Zuhilfenahme einer 30 G-Kanüle (Sterican® - Ø 0,30 x 12 mm, B. Braun, Melsungen) und unter mikroskopischer Ansicht wurde nun die Vorderkammer des linken Auges punk-tiert. An die Kanüle war ein Infusionssystem, bestehend aus zwei Schläuchen (Perfusor-Leitung/Intrafix Primeline Classic® - B. Braun, Melsungen) und einer 0,9 % NaCl 500 ml-Infusionsflasche (B. Braun, Melsungen), angeschlossen. Die ml-Infusionsflasche war zuvor in einer Höhe von 163 cm über der Arbeitsfläche angebracht worden, sodass durch Öffnen der Infusion ein konstanter hydrostatischer Druck von 120 mmHg entstand. Aufgrund des nun erzeugten höheren hydrostatischen Druckes im Vergleich zum systolischen Blutdruck des Tieres, folgte eine Unterbrechung der Blutversorgung der Retina (Jehle et al., 2008). Unter mikroskopischer Einsicht wurde die unter diesem äußeren Druck einsetzende Ischämie der Netzhaut überprüft. Die retinale Durchblutung wurde auf diese Weise für exakt 60 Minuten unterbrochen, worauf man nach Ablauf der Zeit durch Abziehen der Kanüle aus dem Auge eine Reperfusion, der die Netzhaut versorgenden Gefäße unter mikroskopischer Ansicht, beobachten konnte.

Wenn innerhalb von drei Minuten nach Ende der Ischämie keine vollständige Reperfusion festgestellt werden konnte, wurden die entsprechenden Tiere aus der Versuchsreihe genom-men. Ebenso geschah es mit Tieren, die im Zuge der Vorderkammerpunktion oder beim Entfernen der Kanüle, eine Luxation der Linse erlitten, da in einer Arbeit von Fischer et al.

(2000) nachgewiesen wurde, dass aufgrund einer Linsenverletzung neuroprotektive Fakto-ren freigesetzt werden, welche den Untergang von RGZ verhindern.

Abbildung 9: Ischämie-Reperfusions-Versuch (Eigenhändige Zeichnung/Fotografie)

LINKS: schematischer Aufbau des I/R-Versuchs / RECHTS: Punktion der Augenvorderkammer

Injektionen von Wasser, ALF-186 und iALF-186

Nach Beendigung der Ischämie und Einsetzen der Reperfusion wurden über den Katheter verschiedene Injektionen durchgeführt, abhängig von der jeweils zu untersuchenden Ver-suchsgruppe. Die Injektionen wurden sofort nach Einsetzen der Reperfusion durchgeführt, eine Ausnahme hiervon stellte die Gruppe FG ALF 3h dar, bei welcher erst mit dreistündiger Verzögerung ALF-186 injiziert wurde.

Für die Kontrollgruppen wurden den Tieren jeweils 0,3 ml PBS (Life technologies GmbH, Darmstadt) langsam injiziert.

Das CO-freisetzende Molekül ALF-186 wurde freundlicherweise von C. Romão (Alfama Inc., Lissabon, Portugal) zur Verfügung gestellt. Um jedem Tier 10 mg/kg KG intravenös zuführen zu können, wurden jeweils 10 mg des als Pulver gelieferten ALF-186 in 1,0 ml PBS (Gibco® Phospate Buffered Saline - Life technologies GmbH, Darmstadt) zur Lösung gebracht und mit einem Vortex-Schüttler sorgfältig durchmischt. Da das ALF-186 sowohl licht-, als auch sauerstoffempfindlich ist (Motterlini & Otterbein, 2010), fand diese Durch-mischung stets in den dunkel getönten und vakuumverpackten Vials statt. Die 1 ml-Tuber-kulinspritzen (B. Braun, Melsungen), in welche das gelöste ALF-186 danach aufgezogen wurde, wurden mit Aluminiumfolie umhüllt und mit Verschlusskoni (Combi-Stopper - B.

Braun, Melsungen) versiegelt. Das gelöste ALF-186 wurde den Tieren stets unverzüglich langsam intravenös injiziert. Aus Gründen der Durchführbarkeit wurden jedem Tier (unab-hängig vom Körpergewicht) 3,33 mg ALF-186 gelöst in 330 μl PBS verabreicht. Diesem Vorgehen vorausgegangen war die Annahme, einer durchschnittlich schweren SD-Ratte mit einem Körpergewicht von 300 g, besagte 10 mg/kg KG zuzuführen.

Um zu beweisen, dass auch wirklich die CO-Freisetzung durch das ALF-186 Molekül und nicht etwa eine Struktureigenschaft von ALF-186, wie etwa das zentrale Molybdän-Mole-kül, die neuroprotektive Wirkung des Stoffes entfaltet, injizierten wir bestimmten Versuchs-gruppen die inaktivierte Form des Moleküls (iALF-186). Dafür war am Tag vor dem I/R-Schaden und der Intervention mit iALF-186, wie schon beschrieben, ALF-186 in PBS zur Lösung gebracht worden. Dieses wurde jedoch nicht vor Luft- und Sauerstoffexposition ge-schützt, sondern über Nacht unter einer Lampe beschienen und unter Kontakt zur Raumluft exponiert. Ebenso wurde am Tag der Intervention das iALF-186 mithilfe einer Saugpipette nochmals durchmischt, um das sich eventuell noch darin befindende CO zu eliminieren. Au-ßerdem war ein Farbumschlag vom gelblichen ALF-186 hin ins bräunliche iALF-186 zu beobachten, was eine Inaktivierung des Moleküls bedeutet.

Vorbehandlung mit ODQ

Da wir den Nachweis führen wollten, ob ALF-186 neuroprotektive Effekte über die sGC vermittelt, wurde über den selektiven und irreversiblen sGC-Inhibitor ODQ (1H-[1,2,4]O-xadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one - Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) die Gegen-probe durch vorherige Hemmung der sGC vor ALF-186-Applikation vermittelt. ODQ wurde über den in der Schwanzvene des Tieres liegenden Katheter appliziert. Das kristalline ODQ war zuvor in DMSO (Dimethylsulfoxid - Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) in Lö-sung gebracht und in PBS (Gibco® Phospate Buffered Saline - Life technologies GmbH, Darmstadt) verdünnt worden (s. Tabelle 2).

Stoff Hersteller Menge bzw.

Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Stein-heim

150 μl

Phospate Buffered Saline (PBS)

Life technologies GmbH, Darmstadt 2850 μl

Tabelle 2: Herstellung der ODQ-Stammlösung, ausreichend für 6 Tiere

Pro Tier sollten 2,5 mg/kg Körpergewicht ODQ verabreicht werden. Aus Gründen der Durchführbarkeit wurden jedem Tier (unabhängig vom Körpergewicht) 0,83 mg ODQ, ge-löst in 25 μl DMSO und 475 μl PBS, verabreicht. Das gege-löste ODQ wurde, aufgrund seiner zytotoxischen Eigenschaften, langsam über den Katheter, über einen Zeitraum von einer hal-ben Stunde, injiziert. Bei den mit ODQ vorbehandelten Tieren wurde bis zur Einleitung der Ischämie eine Stunde abgewartet, um eine vollständige Hemmung der sGC zu gewährleis-ten.

Nachsorge

Nach Ende des Eingriffes wurden die Augen der Tiere mit einer regenerativen Augensalbe benetzt, um diese vor Austrocknung zu schützen. Vor, sowie am Tag nach den Eingriffen wurden Kontrollen der punktierten Augen, sowie Beobachtungen von eventuellen Schmer-zen oder Infektionen der Tiere (ungepflegtes Fell, Akinese, Gewichtsabnahme) alle 8 Stun-den vorgenommen.