Die Ergebnisse der Western Blots wurden densitometrisch evaluiert und als „x-fache Induk-tion“ im Vergleich zur Kontrolle angegeben. Es wurde die Expression der sGC-β1-Unterein-heit (70 kDa) mit der Expression der Ladungskontrolle mit β-Aktin (42 kDa) verglichen. Bei jeder Versuchsgruppe wurden sowohl (linke) Augen mit I/R-Schaden, als auch deren nicht-ischämische Kontrollen (rechte Augen) auf den Western Blots betrachtet und ein Quotient aus den Messungen der densitometrischen Farbtondichtebestimmungen aus ischämischen und nicht-ischämischen Augen gebildet. Als Referenz wurden die Ergebnisse der Farbton-dichtemessung der MB Kontrolle/24-Gruppe bestimmt. Die Ergebnisse der Farbtondichte-messungen der anderen Versuchsgruppen wurden in Relation zu den Ergebnissen dieser Gruppe als „x-fache Induktion“ bestimmt. In jeder Versuchsgruppe wurden n=6 Tiere ver-wendet. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± Standardabweichung angeben und einheitslos, da sie ein Verhältnis zur Referenz (MB Kontrolle/24) beschreiben.
Aufzählung und absolute Ergebnisse der verglichenen Versuchsgruppen
MB ODQ/ALF/24 Hemmung der sGC durch ODQ
ALF-186 sofort
24 h 1,09 ± 0,08
MB ODQ/iALF/24 Hemmung der sGC durch ODQ
iALF-186 sofort
24 h 0,89 ± 0,10
Tabelle 18: Versuchsgruppen und Ergebnisse der molekularbiologischen (MB) Untersuchunge n
6.2.1 ALF-186 erhöht die Proteinexpression der β1-Untereinheit der sGC in RGZ nach I/R-Schaden
Verglichen wurde die unterschiedliche Expression der sGC bei Versuchsgruppen, welche nach I/R-Schaden ausschließlich PBS injiziert bekommen hatten, mit denen, an welchen nach I/R-Schaden eine Intervention mit ALF-186 durchgeführt worden war. Für die Injek-tion dieser beiden unterschiedlichen Substanzen wurden Versuchsgruppen gewählt, welche 24 bzw. 48 Stunden nach beendetem I/R-Schaden und durchgeführter Injektion enukleiert worden waren.
Bei allen ischämischen Augen (Abbildung 13, Western Blot - Spur 2, 4, 6 und 8) war im Vergleich zu ihren Kontrollaugen (Abbildung 13, Western Blot, Spur 1, 3, 5 und 7) eine relative Erhöhung der Expression der sGC zu erkennen.
Als Referenz dazu wurde die MB Kontrolle/24-Gruppe angegeben (Abbildung 13, Western Blot - Spur 2/1, Histogramm - Säule 1: 1,0 ± 0,14). Die Expression der sGC war in der MB Kontrolle/48-Gruppe im Vergleich zur Referenz etwas erniedrigt (Abbildung 13, Western
Blot - Spur 6/5, Histogramm - Säule 3: 0,93 ± 0,12). Signifikant erhöht war die sGC-Expres-sion in den Gruppen, an welchen eine Injektion mit ALF-186 nach I/R-Schaden durchgeführt worden war, wobei die Expression der sGC nach 24 Stunden (31 % Steigerung) stärker aus-geprägt war, als nach 48 Stunden (21 % Steigerung) (Abbildung 13, MB ALF/24 (Western Blot - Spur 4/3, Histogramm - Säule 2): 1,31 ± 0,12, p<0.001*** bzw. MB ALF/48 (Western Blot - Spur 8/7, Histogramm - Säule 4): 1,21 ± 0,09, p<0.001***) im Vergleich zur jeweili-gen Kontrolle (24 bzw. 48 Stunden).
Im Vergleich der Gruppen, welchen beiden ALF-186 appliziert worden war, welche jedoch zu unterschiedlichen Zeitpunkten enukleiert worden waren, zeigte sich eine nicht signifikant erhöhte Expression der sGC von 7,6 % bei der 24h-Gruppe im Vergleich zur 48h-Gruppe (MB ALF/24: 1,31 ± 0,12 vs. MB ALF/48: 1,21 ± 0,09, p>0.1).
Abbildung 13: Einfluss von ALF-186 auf die Proteinexpression der sGC-β1 24 bzw. 48 Stunden nach I/R-Schaden
Repräsentativer Western Blot: Gezeigt ist die Proteinexpression der ALF- und Kontrollgruppen nach I/R-Scha-den. Verglichen wurde die Expression der sGC (70 kDa) mit der Ladungskontrolle mit β-Aktin (42 kDa).
In jedem Auge mit I/R-Schaden (Spur 2, 4, 6, 8) zeigt sich eine leicht erhöhte sGC-Expression im Vergleich zu den Kontrollaugen (Spur 1, 3, 5, 7). In den ALF-Gruppen (Spur 4 und 8) zeigt sich sowohl 24 als auch 48 Stunden nach I/R-Schaden eine hochsignifikante Erhöhung (***p < 0,001) der β1-Untereinheit der sGC im Vergleich zu den Wasser-Gruppen (Spur 2 und 6).
Histogramm: Dargestellt sind die durch Densitometrie gemessenen Farbtondichten aus jeweils sechs unab-hängigen Experimenten (n=6 Tiere pro Gruppe). Dargestellt sind die Verhältniswerte (Quotient: ischämisches Auge/nicht-ischämisches Auge) der densitometrischen Farbtondichtebestimmung für die unterschiedlichen Gruppen. Als Referenz mit dem Wert 1,0 ± 0,14 wurde die MB Kontrolle/24-Gruppe (Säule 1) festgelegt – die drei weiteren Säulen beziehen sich im durch die Farbtondichte bestimmten Verhältnis zu dieser. Bei Injektion von ALF-186 nach I/R-Schaden zeigte sich sowohl bei Enukleation nach 24 (Säule 2) und 48 Stunden (Säule 4) eine signifikante Erhöhung der Farbtondichten im Vergleich zur Referenz. Im direkten Vergleich dieser zu unterschiedlichen Zeitpunkten enukleierten Gruppen, welche ALF-186 erhalten hatten, zeigte sich eine (nicht signifikante, p>0.1) Erhöhung der sGC bei MB ALF/24.
6.2.2 Bei Vorbehandlung der RGZ mit ODQ erhöht sich die sGC-Expression durch Gabe von ALF-186 oder iALF-186 nicht
Verglichen wurde die unterschiedliche Expression der sGC bei Versuchsgruppen, welche vor I/R-Schaden mit dem sGC-Inhibitor ODQ vorbehandelt worden waren (Abbildung 14, Western Blot - Spur 3-8) mit Tieren der Gruppe MB Kontrolle/24 (Abbildung 14, Western Blot - Spur 1 und 2). Lediglich bei den ischämischen Augen der ALF-Gruppe (Abbildung
MB Kontrolle/24 MB ALF/24 MB Kontrolle/48 MB ALF/48 0,00
0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60
sGC-β1/β-Aktin Proteinexpression ischämes Auge/nicht-ischämes Auge (MW±SD)
*** ***
14, Western Blot – Spur 6) war im Vergleich zu deren Kontrollaugen (Abbildung 14, Wes-tern Blot - Spur 5) eine minimale Erhöhung der Expression der sGC zu erkennen. Bei allen anderen Gruppen war dies nicht der Fall.
Als Referenz wurde die MB Kontrolle/24-Gruppe angegeben (Abbildung 14, Western Blot - Spur 2/1, Histogramm - Säule 1: 0,92 ± 0,14). In keiner der mit ODQ vorbehandelten Gruppen konnte eine signifikant erhöhte Proteinexpression der β1-Untereinheit der sGC im Vergleich zu der Referenzgruppe (MB Kontrolle/24) gemessen werden. Waren die Tiere mit ODQ vorbehandelt worden, konnte bei Injektionen mit ALF-186 (Abbildung 14, Western Blot - Spur 6/5, Histogramm – Säule 3: 1,09 ± 0,08) zwar eine leichte Steigerung der sGC-Expression mittels Farbtondichtebestimmung gemessen werden, diese blieb jedoch unter Signifikanzniveau. Auch Injektionen mit der inaktivierten Form iALF-186 (Abbildung 14, Western Blot - Spur 8/7, Histogramm – Säule 4: 0,89 ± 0,10) zeigten keine erhöhte Expres-sion der sGC, ebensowenig wie Tiere, welche mit ODQ vorbehandelt worden waren und PBS injiziert bekommen hatten (Abbildung 14, Western Blot - Spur 4/3, Histogramm – Säule 2: 0,89 ± 0,19).
Abbildung 14: Einfluss von ALF-186 und iALF-186 auf die Proteinexpression der sGC-β1 nach I/R-Schaden bei vorheriger Inhibierung durch ODQ
Repräsentativer Western Blot: Gezeigt ist die Proteinexpression der ALF-, iALF- und Kontrollgruppen nach I/R-Schaden bei Vorbehandlung mit dem sGC-Inhibitor ODQ. Verglichen wurde die Expression der sGC (70 kDa) mit der Ladungskontrolle mit β-Aktin (42 kDa).
In keinem Auge mit I/R-Schaden (Spur 2, 4, 6, 8) zeigt sich eine relevant erhöhte sGC-Expression im Ver-gleich zu den Kontrollaugen (Spur 1, 3, 5, 7).
Histogramm: Dargestellt sind die durch Densitometrie gemessenen Farbtondichten aus jeweils sechs unab-hängigen Experimenten (n=6 Tiere pro Gruppe). Dargestellt sind die Verhältniswerte (Quotient: ischämisches Auge/nicht-ischämisches Auge) der densitometrischen Farbtondichtebestimmung für die unterschiedlichen Gruppen. Als Referenz mit dem Wert 0,92 ± 0,14 wurde die MB Kontrolle/24-Gruppe (Säule 1) festgelegt – die drei weiteren Säulen beziehen sich im durch die Farbtondichte bestimmten Verhältnis zu dieser. Bei keiner der Injektionen von ALF, PBS oder iALF zeigte sich bei vorheriger sGC-Inhibierung durch ODQ eine signifi-kant erhöhte Expression der sGC im Vergleich zur Referenzgruppe.