Bestimmung der Immunglobulin G-Konzentration mittels Refraktometrie, Kolostrometrie und ELISA-Technik sowie Untersuchung weiterer Inhaltsstoffe im Stutenkolostrum
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines DOKTORS DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Ralf Georg Markus aus Quakenbrück
Hannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. E. Klug
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. E. Klug
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr., Dr. h.c. W. Leibold
Tag der mündlichen Prüfung: 2. Juni 2005
Diese Arbeit wurde durch Mittel der Gesellschaft der Freunde der Tierärztlichen Hochschule Hannover e. V. gefördert.
meinen Eltern
und Hilke
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
2 Literaturübersicht 3
2.1 Anatomie 3
2.2 Immunglobuline 4
2.2.1 Immunglobuline des Pferdes 6
2.2.1.1 IgG 7
2.2.1.2 IgM 9
2.2.1.3 IgA 9
2.2.1.4 IgE 10
2.2.1.5 IgD 10
2.2.2 Immunglobulinvorkommen im Kolostrum 10
2.2.3 Passiver Immunitätstransfer 13
2.2.4 Fehlerhafter passiver Transfer (FPT) 15
2.2.5 IgG-Bestimmungsmethoden 16
2.2.5.1 Spezifische IgG-Bestimmungsmethoden 16
2.2.5.2 Unspezifische Bestimmungsmethoden 19
2.3 Hauptinhaltsstoffe des Kolostrums 23
2.3.1 Eiweiß 25
2.3.2 Laktose 25
2.3.3 Fett 26
2.3.4 Harnstoff 27
2.4 Mastitis der Stute 28
2.5 Somatische Zellen, NAGase-Aktivität und Chloridgehalt 29
2.5.1 Somatische Zellen und Analytik 29
2.5.2 NAGase-Aktivität 30
2.5.3 Chloridgehalt 31
3 Material und Methode 32
3.1 Material 32
3.1.1.1 Haltung 32
3.1.1.2 Fütterung 33
3.1.1.3 Impf- und Entwurmungsprogramm 33
3.1.1.4 Abfohlmanagement 33
3.1.2 Probenmaterial 34
3.1.2.1 Blutserumgewinnung 35 3.1.2.2 Kolostrumgewinnung 35
3.2 Methoden 36
3.2.1 Untersuchungen im Gestütslabor 36
3.2.1.1 Refraktometrie 36
3.2.1.2 Dichtebestimmung mittels Aräometer 38
3.2.2 Untersuchungen in der IVD GmbH 41
3.2.2.1 Bestimmung von Antikörperkonzentrationen im Kolostrum und Serum
mittels ELISA 41
3.2.2.2 Direkter Sandwich-ELISA zur Bestimmung von IgG
in equinem Serum und Kolostrum 41
3.2.2.2.1 Vorversuche 42
3.2.2.2.2 Herstellung der IgG-ELISA-Testplatten 49
3.2.2.2.3 Durchführung des IgG-ELISA 49
3.2.2.2.4 ELISA-Auswertung 51
3.2.3 Untersuchungen im Regionallabor 52
3.2.3.1 Milchinhaltsstoffbestimmung 52
3.2.3.2 Bestimmung der somatischen Zellen 52
3.2.4 Chemisch-physikalische Untersuchungen 53
3.2.4.1 Dichtebestimmung mittels Wägung 53
3.2.4.2 Bestimmung der NAGase-Aktivität 54
3.2.4.3 Chloridbestimmung 56
3.2.5 Statistische Auswertung 58
4 Ergebnisse 59
4.1 Beschreibung des Untersuchungsmaterials 59
4.2 Vergleich von rechter und linker Euterhälfte 60
4.3 Kolostrumvolumen 62
4.4 IgG im Kolostrum und Blutserum 64
4.4.1 IgG-Konzentration im Kolostrum 64
4.4.2 Gesamt-IgG-Menge im Kolostrum 66
4.4.3 Korrelation von IgG-Konzentration und Gesamt-IgG-Menge
im Kolostrum 68
4.4.4 Beziehungen zwischen IgG-Konzentration im Blutserum
und im Kolostrum 68
4.5 Vergleich zwischen Feldmethoden und ELISA-Verfahren
zur Bestimmung der kolostralen IgG-Konzentration 71 4.6 Eiweiß, Laktose, Fett und Harnstoff im Kolostrum 76 4.6.1 Eiweißgehalt differenziert nach Stutengruppen 77 4.6.2 Laktosegehalt differenziert nach Stutengruppen 79 4.6.3 Fettgehalt differenziert nach Stutengruppen 80 4.6.4 Harnstoffgehalt differenziert nach Stutengruppen 82 4.7 Somatische Zellen, NAGase-Aktivität und Chloridgehalt 83
4.7.1 Gehalt somatischer Zellen im Kolostrum 85
4.7.2 NAGase-Aktivität im Kolostrum 86
4.7.3 NAGase-Aktivität im Blutserum 88
4.7.4 Chloridgehalt im Kolostrum 88
4.7.5 Chloridgehalt im Serum 90
5. Diskussion 91
5.1 Intention der Untersuchung 91
5.2 Stutenkontingent und Probenmaterial 91
5.3 Analytik 93
5.4 Ergebnisse 94
5.4.1 Vergleich von rechter und linker Euterhälfte 94
5.4.2 IgG im Stutenkolostrum 95
5.4.3 Methodenvergleich 98
5.4.4 Inhaltsstoffe im Kolostrum 102
5.4.4.2 Gehalt somatischer Zellen, NAGase-Aktivität und Chloridgehalt 105
5.5 Schlussfolgerungen 108
6 Zusammenfassung 110
7 Summary 113
8 Literaturverzeichnis 116
9 Anhang 132
9.1 Tabellen 132
9.2 Analysenvorschriften 134
Abbildungsverzeichnis:
Abb. 1: Sagittalschnitt durch das Euter der Stute (halbschematisch) 3 Abb. 2: Immunglobulinstruktur und Aufbau der verschiedenen
Immunglobulinklassen 5
Abb. 3: Digital Hand-held ‘Pocket’ Refractometer PAL-1, Fa. ATAGO CO, LTD,
Tokyo, Japan, abgebildet mit einer 1 € - Münze und zwei Streichhölzern 37 Abb. 4: Warzenaräometer abgebildet mit einer 1 € - Münze
und zwei Streichhölzern 39
Abb. 5: Warzenaräometer in dem mit Milch gefüllten Standzylinder 39 Abb. 6: Darstellung von Linearität und Parallelität der logarithmierten OD-Werte
in den jeweiligen Verdünnungsstufen des IgG-Standards
und eines Stutenblutserums (Stute der Gruppe I) 46 Abb. 7: Darstellung von Linearität und Parallelität der logarithmierten OD-Werte
in den jeweiligen Verdünnungsstufen des IgG-Standards
und der Kolostrumproben einer Stute (Stutengruppe II) für vier Melkzeiten
(0 h, 3 h, 6 h, 12 h p.p.) 46
Abb. 8: Korrelation und Regression der NAGase-Aktivität zwischen rechter und
linker Euterhälfte 61
Abb. 9: Mittleres Kolostrumvolumen und Standardabweichung beider Euterhälften der drei ersten Stunden p.p. getrennt nach Stutengruppen 62 Abb. 10: Mittleres Kolostrumvolumen und Standardabweichung beider Euterhälften
der drei Stutengruppen differenziert nach Melkzeiten 63 Abb. 11: Verlauf der mittleren IgG-Konzentration im Kolostrum
der drei Stutengruppen 65
Abb. 12: Mittlere Gesamt-IgG-Menge und Standardabweichung beider Euter-
hälften der drei ersten Stunden p.p. getrennt nach Stutengruppen 66 Abb. 13: Mittlere Gesamt-IgG-Menge und Standardabweichung beider Euter-
hälften der drei Stutengruppen differenziert nach Melkzeiten 67 Abb. 14: Korrelation und Regression zwischen IgG-Konzentration im Blutserum
Abb. 15: Korrelation und Regression zwischen IgG-Konzentration im Blutserum
und kolostraler Gesamt-IgG-Menge der drei ersten Stunden p.p. 70 Abb. 16: Korrelation und Regression zwischen ELISA- und Refraktometrie-
ergebnissen im Gesamtmaterial 73
Abb. 17: Korrelation und Regression zwischen ELISA- und Dichteergebnissen (K)
im Gesamtmaterial 73
Abb. 18: Korrelation und Regression zwischen ELISA- und Dichteergebnissen (W)
im Gesamtmaterial 74
Abb. 19: Mittlerer Gehalt an Eiweiß, Laktose, Fett und Harnstoff im Kolostrum der
ersten zwölf Stunden p.p. 76
Abb. 20: Mittlerer Eiweißgehalt und Standardabweichung beider Euterhälften der drei Stutengruppen differenziert nach Melkzeiten 78 Abb. 21: Mittlerer Laktosegehalt und Standardabweichung beider Euterhälften der
drei Stutengruppen differenziert nach Melkzeiten 80 Abb. 22: Mittlerer Fettgehalt und Standardabweichung beider Euterhälften der
drei Stutengruppen differenziert nach Melkzeiten 81 Abb. 23: Mittlerer Harnstoffgehalt und Standardabweichung im Kolostrum beider
Euterhälften der drei Stutengruppen differenziert nach Melkzeiten 83 Abb. 24: Mittlerer Gehalt somatischer Zellen (log SCC), Chloridionen und
NAGase-Aktivität im Stutenkolostrum der ersten zwölf Stunden p.p. 84 Abb. 25: Mittelwert (log xa) der logarithmierten Einzelwerte (log x) und Standard-
abweichungen (± SD) somatischer Zellen [SCC/ml] im Stutenkolostrum
beider Euterhälften der drei Stutengruppen differenziert nach Melkzeiten 85 Abb. 26: Mittlere NAGase-Aktivität und Standardabweichung im Stutenkolostrum
beider Euterhälften der drei Stutengruppen differenziert nach Melkzeiten 87 Abb. 27: Mittlerer Chloridgehalt und Standardabweichung im Stutenkolostrum
beider Euterhälften der drei Stutengruppen differenziert nach Melkzeiten 89
Tabellenverzeichnis:
Tab. 1: Alte und neue Nomenklatur der equinen Immunglobuline 6 Tab. 2: Angaben zum IgG-Gehalt im Kolostrum von Stuten 12 Tab. 3: Korrelation zwischen Kolostrometrie- und RIDT-Methode im Kolostrum
für IgG-Konzentrationen 22
Tab. 4: Mittlere Zusammensetzung der Hauptinhaltsstoffe im Kolostrum
verschiedener Tierarten 24
Tab. 5: Mittlere Zusammensetzung der Hauptinhaltsstoffe in reifer Milch
verschiedener Tierarten 24
Tab. 6: Probenentnahmeplan 34
Tab. 7: Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten für die
Refraktometrie in Stutenmischmilchen für drei Zeitpunkte p.p. 38 Tab. 8: Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten für die
Dichtebestimmung in Stutenmischmilchen mittels Kolostrometer für drei
Zeitpunkte p.p. 40
Tab. 9: Mikrotiterplattenbelegung des IgG-ELISA bei gleichzeitiger Einpunkt-
messung im Duplikat und Titration der Probe 48 Tab. 10: Arithmetische Mittelwerte ([a), Standardabweichungen (SD), binomische
Gleichungen und Korrelationskoeffizienten (r) zwischen Ergebnissen der Einpunktmessung und dem Titrationsverfahren für Blutserum- und
Kolostrumproben 49 Tab. 11: Mikrotiterplattenbelegung des IgG-ELISA bei Einpunktmessung
im Duplikat 50
Tab. 12: Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten die Wäg- ung von ermittelten Dichten Stutenmischmilchen für drei Zeitpunkte p.p. 54 Tab. 13: Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten für die
NAGase-Aktivitäts-Bestimmung in Stutenmischmilchen für
fünf Zeitpunkte p.p. 56
Tab. 14: Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten für die
Chloridbestimmung in Stutenmischmilchen für drei Zeitpunkte p.p. 57 Tab. 15: p-Werte zur Darstellung der Signifikanzen 58 Tab. 16: Probenmaterial und Gruppengrößen für die Kolostrumuntersuchungen 59 Tab. 17: Vergleich der Mittelwertberechnungen von rechter und linker Euterhälfte 60 Tab. 18: Vergleich der Signifikanzniveaus auf Basis der Kolostralvolumina
zwischen Stutengruppen und Melkzeiten 64
Tab. 19: Mittelwerte ([a) und Standardabweichungen (SD) der IgG-Konzentratio- nen [mg/ml] im Stutenkolostrum differenziert nach Stutengruppen und
Melkzeiten 65
Tab. 20: Vergleich der Signifikanzniveaus zwischen Stutengruppen und Melk-
zeiten auf Basis der IgG-Mengen im Stutenkolostrum 68 Tab. 21: Korrelation zwischen den Ergebnissen von ELISA und Feldmethoden
getrennt nach Stutengruppen 71
Tab. 22: Regressionsgleichungen zwischen den ELISA- und Refraktometrie- bzw.
Kolostrometrie- bzw. Wägungsergebnissen aufgeteilt nach Stuten-
gruppen (I, II, III) 72
Tab. 23: Regressionsgleichungen zwischen ELISA- und Refraktometrie- bzw.
Kolostrometrie- bzw. Wägungsergebnissen im Gesamtmaterial unter
Berücksichtigung der Standardfehler (± S) 75 Tab. 24: Korrelation zwischen Milchinhaltsstoffen und mittels ELISA bestimmten
kolostralen IgG-Konzentrationen (Mittelwerte beider Euterhälften) 77 Tab. 25 Mittelwerte ([a) und Standardabweichungen (SD) der Eiweißgehalte [%]
im Kolostrum differenziert nach Stutengruppen und Melkzeiten 78 Tab. 26: Mittelwerte ([a) und Standardabweichungen (SD) der Laktosegehalte [%]
im Kolostrum differenziert nach Stutengruppen und Melkzeiten 79 Tab. 27: Mittelwerte ([a) und Standardabweichungen (SD) der Fettgehalte [%]
im Stutenkolostrum differenziert nach Stutengruppen und Melkzeiten 81
Tab. 28: Mittelwerte ([a) und Standardabweichungen (SD) der Harnstoff-
gehalte [mg/l] differenziert nach Stutengruppen und Melkzeiten 82 Tab. 29: Arithmetisches Mittel (log [a) der logarithmierten Einzelwerte (log x) und
Standardabweichungen (SD) somatischer Zellen [SCC/ml] differenziert
nach Stutengruppen und Melkzeiten 85
Tab. 30: Geometrische Mittelwerte ([g) somatischer Zellen x 103 [SCC/ml]
(entlogarithmiert) im Stutenkolostrum differenziert nach Stutengruppen
und Melkzeiten 86
Tab. 31: Mittelwerte ([a) und Standardabweichungen (SD) kolostraler NAGase- Aktivitäten [nmol min-1 ml-1] im Kolostrum differenziert nach Stuten-
Gruppen und Entnahmezeitpunkten 87
Tab. 32: Mittelwerte ([a) und Standardabweichungen (SD) kolostraler Chloridge-
halte [mmol/l] differenziert nach Stutengruppen und Entnahmezeitpunkten 88 Tab. 33: Vergleich der Signifikanzniveaus zwischen Stutengruppen und Melk-
zeiten für den Parameter Chlorid im Kolostrum 90 Tab. 34: Mittlerer IgG-Gehalt [%] vom mittleren Gesamteiweißgehalt [%] im
Stutenkolostrum differenziert nach Stutengruppen und Melkzeiten 103 Tab. 35: Mittelwerte somatischer Zellen [SCC/ml] im Kolostrum von Stuten 105 Tab. 36: Inhaltsstoffe (arithmetische bzw. geometrische Mittelwerte) im Kolostrum
eutergesunder Stuten differenziert nach Melkzeiten 111 Tab. 37: Components (arithmetic and geometric means) in the total colostrum
of the healthy mares collected at different times p.p. 114 Tab. 38: Mittelwerte ([a) und Standardabweichungen (SD) des Brechungsindex [%]
von Stutenkolostrum differenziert nach Stutengruppen und Melkzeiten 132 Tab. 39: Mittelwerte ([a) und Standardabweichungen (SD) der Dichte (K) [g/ml] von
Stutenkolostrum differenziert nach Stutengruppen und Melkzeiten 132 Tab. 40: Mittelwerte ([a) und Standardabweichungen (SD) der Dichte (W) [g/ml]
Abkürzungsverzeichnis:
°C Grad Celsius
µ mikro
Ag Antigen
Ak Antikörper
B Bestimmtheitsmaß bzw. beziehungsweise
ca. circa
cm3 Kubikzentimeter
D Dichte [g/ml]
Dichte (K) mittels Kolostrometrie ermittelte Dichte Dichte (W) mittels Wägung ermittelte Dichte dl Deziliter
DNS Desoxyribonukleinsäure EHV equines Herpes Virus
ELISA Enzym linked immunosorbent assay (Enzym gekoppelter Immunoadsorbtionstest)
EU ELISA Unit
Fa. Firma
FPT Failure of passive transfer (fehlerhafter passiver Transfer) g Gramm
GCT Glutaraldehyde-coagulation-test (Glutaraldehyd-Koagulationstest)
h hora (Stunde)
Ig Immunglobulin
IgA, IgD, IgE, IgG Immunglobulin A, -D, -E, -G
IVD GmbH Gesellschaft für Innovative Veterinärdiagnostik mit beschränkter Haftung
K Kolostrometrie
kDa Kilodalton
kg Kilogramm
LAT Latexagglutinationstest l Liter
log Logarithmus zur Basis 10
log [a Mittelwert der logarithmierten Werte m Masse
M Molar
max. maximal
mg Milligramm
MG Molekulargewicht
min Minute
ml Milliliter
mmol Millimol
MTP Mikrotiterplatte n Anzahl
NAGase N-Acetyl-β-D-glucosaminidase ng Nanogramm
nm Nanometer
nmol Nanomol
OD optische Dichte
p pico
p.p. post partum
r Korrelationskoeffizient
RER raues endoplasmatisches Retikulum RIDT Radialer Immuno-Diffusions-Test
RPM rounds per minute (Umdrehungen pro Minute) s. siehe
SCC somatic cell count (Anzahl somatischer Zellen)
S.I. Système International d’Unités (Internationales Einheitensystem)
s.o. siehe oben
s.u. siehe unten
TBST tris buffered saline with TWEEN 20® (Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit TWEEN 20®-Zusatz)
TMB Tetramethylbenzidin-Substratpuffer V Volumen
VK Variationskoeffizient
[ Mittelwert
[a arithmetischer Mittelwert
[g geometischer Mittelwert, entspricht log [a
xg Faktor der Normfallbeschleunigung (9,80665 m/s2) ZST Zinksulfat-Trübungstest
1. Einleitung
In Deutschland besitzen Pferde als Sport- und Liebhabertiere einen hohen Stellenwert.
Von den Tierhaltern wird daher eine umfassende und intensive veterinärmedizinische Betreuung gefordert. Bereits die Überwachung der neonatalen Gesundheit und Vitalität spielt in diesem Zusammenhang eine wichtige Rolle.
Das Stutenkolostrum nimmt vor diesem Hintergrund eine Schlüsselstellung ein, weil es mit seinem hohen Gehalt an Antikörpern gegen spezifische Krankheitserreger und einer Reihe unspezifisch wirksamer Abwehrsubstanzen die passive Immunisierung des Neugeborenen garantiert (DUFFUS und O`BRIEN 1990). Antikörper werden vom mütterlichen Organis- mus in der Auseinandersetzung mit vielen in seiner Umwelt vorkommenden Mikro- organismen und weiteren Noxen gebildet. Diese Antikörper sind somit geeignet, das neugeborene Fohlen, das mit seiner Geburt von einem praktisch keimfreien in ein keimhaltiges Milieu wechselt, gegen die Erreger seiner neuen Umgebung zu schützen.
Eine nicht ausreichende Immunitätsübertragung von der Stute auf ihr Fohlen wird als fehlerhafter passiver Transfer (FPT) bezeichnet, welcher ohne tierärztliche Intervention schwer verlaufende Infektionen mit häufig letalem Ausgang zur Folge haben kann (STONEHAM et al. 1991). Mehr als die Hälfte der Fälle von FPT sind dabei auf einen zu geringen kolostralen Antikörpergehalt zurückzuführen (CRAWFORD et al. 1977).
Die qualitative Bewertung eines Kolostrums erfolgt in diesem Zusammenhang anhand der enthaltenen Antikörperkonzentrationen. Dabei wird in den allermeisten Fällen die Konzentration von Immunglobulinen der Klasse G bestimmt, da diese im Vergleich zu IgM und IgA sowohl quantitativ als auch funktionell dominieren (EISENHAUER 1981, KÄHN 1991a, TYLER-McGOWAN et al. 1997).
Als Schwerpunkt dieser Arbeit sollen für ein großes Gestüt mit etwa 2000 Pferden zwei
„auf der Stallgasse“ einsetzbare physikalische Methoden (Refraktometrie, Aräometrie) zur Abschätzung der kolostralen IgG-Konzentration mit einer nur im Laboratorium durchzuführenden immunologischen Methode (ELISA) verglichen und der Verlauf der kolostralen IgG-Konzentration in den ersten zwölf Stunden post partum (p.p.) untersucht werden.
Aufgrund der herausragenden alimentären Funktion des Kolostrums (MEYER und KAMPHUES 1990) werden neben dem kolostralen Gesamtvolumen der ersten drei Stunden p.p. die Hauptinhaltsstoffe Eiweiß, Fett, Laktose und Harnstoff innerhalb der ersten 12 Stunden p.p. ausgewertet.
Zur Charakterisierung der Eutergesundheit werden neben der klinischen Untersuchung zusätzlich die entzündungsrelevanten Parameter Gehalt somatischer Zellen, NAGase- Aktivität und Chloridgehalt (SCHÜTTEL 1999) berücksichtigt.
Insgesamt stand ein Abfohlungszeitraum von ca. zwei Monaten zur Probennahme zur Verfügung. Dabei sollten insgesamt 36 Stuten, eingeteilt in drei Paritätsgruppen, innerhalb der ersten 12 Stunden p.p. fünfmal gemolken werden.
2. Literaturübersicht
2.1 Anatomie
Die Milchdrüse der Stute zählt zu den sekundären Geschlechtsorganen. Sie entsteht aus der Epidermis und stellt eine modifizierte Schweißdrüse dar (ZEROBIN 1987, SCHNOOR 1996, Abb. 1).
Abb. 1: Sagittalschnitt durch das Euter der Stute (halbschematisch)
1: Mündung des cranialen Zitzenkanals 2: Mündung des caudalen Zitzenkanals 3: Zitzenteil der cranialen Zisterne 4: Zitzenteil der caudalen Zisterne
5: Drüsenteil der cranialen Zisterne 6: Drüsenteil der caudalen Zisterne 7: Milchgänge 8: Drüsenparenchym (aus: WENDT et al. 1994)
Die equine Milchdrüse besteht aus je einem rechten und einem linken in der Leiste ge- legenen abgeflachten, halbkugeligen Drüsenkörper, welcher mit einer seitlich kompri- mierten, stumpfkegelförmigen Zitze ausgestattet ist. Jede Euterhälfte besteht aus einem
craniale das größere ist. Somit weist das Stuteneuter regulär vier Hohlraumsysteme auf (HABERMEHL 1996). Die Euterhälften werden durch einen Sulcus intermammarius voneinander getrennt. In der Regel ist die fein behaarte Euterhaut schwarz pigmentiert und enthält eine Vielzahl von apokrinen Schlauchdrüsen, deren schwarzgraues, schmieri- ges Sekret, die die Entstehung eines Intertrigos verhindert. Die milchsezernierenden, alveolären Drüsenendstücke vereinigen sich zu Drüsenausführungsgängen und münden schließlich in größeren Milchgängen. Letztere, als Ductus lactiferi bezeichnet, sind mit Myoepithelien ausgestattet und treten in die Sinus lactiferi genannte Milchzisterne ein, welche sich aus einem Drüsen- und einem Papillenteil zusammensetzt (MICHEL 1994).
Auf der Zitzenspitze befinden sich in flachen Vertiefungen saggital hintereinander zwei (selten drei) Strichkanalöffnungen, sogenannte Ostia papillaria, durch die die Milch die Milchzisterne verlassen kann.
Als anatomische Besonderheit lässt sich am Stuteneuter im Gegensatz zu anderen Tier- arten an der Zitzenöffnung kein Musculus sphincter papillae nachweisen (HABERMEHL 1996).
2.2 Immunglobuline
Immunglobuline, auch als Antikörper bezeichnet, sind komplexe Glykoproteine und bilden die humorale Komponente der adaptiven Immunität des Säugetierorganismus. Sie werden ausschließlich von Zellen der B-Lymphozytenreihe synthetisiert und sezerniert und können im Serum und anderen extrazellulären Flüssigkeiten (Speichel, Schweiß, Milch), sowie auf Schleimhautepithelien des Darm- und Respirationstraktes nachgewiesen werden.
Aufgrund ihrer spezifischen Bindung an Antigene können mittels verschiedener Mechanismen, z.B. durch Aktivierung des Komplementsystems und phagozytierender Zellen, diese „antigentragenden“ Strukturen unschädlich gemacht werden. Auf diese Weise verteidigen sie den Körper gegen zahlreiche pathogene Noxen und erfüllen somit wichtige Funktionen im Rahmen der Immunabwehr. Daneben spielen sie auch bei regulatorischen Mechanismen der Immunantwort (Feedback-Mechanismen) eine entscheidende Rolle (TIZARD 2004).
Der prinzipielle Aufbau funktionsfähiger Immunglobuline besteht aus zwei identischen schweren H-Ketten und zwei identischen leichten L-Ketten, die über Disulfidbrücken kovalent miteinander verbunden und stabilisiert werden (Abb. 2). Das Molekulargewicht (MG) der schweren Ketten beträgt etwa 50.000 Dalton und das der leichten ca. 25.000 Dalton. Durch das Enzym Papain kann das Antikörpermolekül proteolytisch in drei Teile gespalten werden. Es entstehen zwei identische Fragmente mit antigenbindenden Eigenschaften (Fab-Fragmente; fragment antigen binding) und ein kristallisierbares, nicht antigenbindendes Fragment (Fc-Fragment; fragment crystallizable). Letzteres ist für die Sekundärfunktionen des Antikörpermoleküls verantwortlich, die Fab-Fragmente binden Antigen (JANEWAY und TRAVERS 2002a).
Abb. 2: Immunglobulinstruktur und Aufbau der verschiedenen Immunglobulinklassen,
2.2.1 Immunglobuline des Pferdes
An den schweren und leichten Ketten der Immunglobuline können variable und konstante Domänen unterschieden werden. Aufgrund unterschiedlicher Antigenität der konstanten Domäne der schweren Ketten werden die Immunglobuline in die fünf Klassen IgG, IgM, IgA, IgE und IgD unterteilt. Bei den Immunglobulinklassen IgG und IgA werden weiterhin verschiedene Subklassen unterschieden (JANEWAY und TRAVERS 2002a). Eine aktuelle Einteilung der equinen Immunglobuline wurde auf dem 6. Internationalen Veterinary Immunology Symposium in Uppsala, Schweden 2001 präsentiert (Tab. 1).
Tab. 1: Alte und neue Nomenklatur der equinen Immunglobuline (aus WEGE 2004) Alte Nomenklatur Neue Nomenklatur
IgM IgM
IgGa IgG1
IgG2
IgG(T) IgG3
IgGb IgG4 IgG5
IgG6
IgE IgE
IgA IgA
Statt in Klassen und Subklassen kann aufgrund funktioneller und serologischer Parameter auch eine Einteilung in verschiedene Immunglobulin-Isotypen erfolgen. Allotypen hingegen kommen nur bei einzelnen Individuen einer Spezies vor und werden durch alternative Formen (allelische Polymorphismen) codiert. Weiterhin existieren sogenannte Idiotypen, dabei handelt es sich um individualspezifische Epitope in den variablen Domänen, insbesondere in den hypervariablen Regionen, des Immunglobulinmoleküls. Idiotypen entstehen durch eine individuelle Rekombination der variablen Gensegmente eines einzelnen B-Zellklones und kommen somit nur auf von diesem Klon gebildeten Antikörpern vor (JANEWAY und TRAVERS 2002c).
2.2.1.1 IgG
Immunglobuline der Klasse G werden von ausdifferenzierten B-Lymphozyten (Plasmazellen) der Milz, der Lymphknoten und des Knochenmarks synthetisiert und sezerniert. Mit einer Halbwertzeit von ca. 18 bis 23 Tagen stellen sie die haltbarste Antikörperfraktion dar (TRAUTWEIN 1990) und weisen im Blutserum mit ca. 10 bis 15 mg/ml die höchsten Gehalte von allen Immunglobulinen auf (TIZARD 2004). Auch im equinen Kolostrum stellen sie die quantitativ dominierende Immunglobulinfraktion dar (MACDOUGALL 1975). Wegen ihres geringen Molekulargewichtes von 180.000 Dalton können Immunglobuline der Klasse G im Verlauf einer Immunreaktion leicht in die extravasalen Räume hinübertreten.
Zwar stellt die differenzierte Betrachtung der equinen IgG-Isotypen seit langem einen Schwerpunkt der veterinärimmunologischen Forschung dar (ROCKEY et al. 1964, ROCKEY 1967, McGUIRE et al. 1972), jedoch war der Kenntnisstand über die Verhältnisse bei Pferden im Vergleich zu dem bei Mäusen oder Menschen bis vor wenigen Jahren noch recht unvollständig. Bekannt ist, dass die verschiedenen IgG-Isotypen entsprechende Effektorfunktionen bei den antikörpervermittelten Abwehrvorgängen des Körpers vermitteln. Hierzu zählen im Wesentlichen die Opsonierung von Pathogenen für die Aufnahme durch Phagozyten, die Neutralisation von Toxinen, die Sensibilisierung von Mastzellen und die Aktivierung von B-Lymphozyten zur Antikörperproduktion (RAVETCH und KINET 1991). Wie beim Menschen durch die Isotypen IgG1 und IgG3 (DILLMANN et al. 1995) kann auch beim Pferd durch einige IgG-Isotypen eine Aktivierung des Komplementsystems erfolgen. So wiesen McGUIRE et al. (1973) eine Aktivierung durch die damals als IgGa, IgGb, IgM und IgG(B), nicht aber durch die als IgGc und IgG(T) bezeichneten Isotypen nach. Diese Aktivierung kann zur Lysis der Zielzelle oder zur Erleichterung der Phagozytose des Antigens führen. Das Komplementsystems vermag ebenfalls die Beseitigung von Viren und Immunkomplexe zu ermöglichen, indem Komplementprotein an die Oberflächen dieser Bestandteile anlagert und sie somit für eine Phagozytose im Retikuloendothelialen System erkennbar macht (TIZARD 2004). Einige Spaltprodukte des Komplementsystems (C3a, C4a u. C5a) bewirken als biologisch hoch aktive Substanzen Entzündungsreaktionen (Kontraktion glatter Muskulatur, Vasodilatation
u. Chemotaxis) und werden daher als Anaphylatoxine bezeichnet (FRANK u. FRIES 1991).
Funktionelle Unterschiede zwischen den verschiedenen equinen IgG-Isotypen wurden ebenfalls von SHEORAN u. HOLMES (1996) demonstriert, indem sie für die verschiedenen Isotypen unterschiedliche Affinitäten zu bakteriellen Zellwandbestandteilen nachwiesen. So binden IgGa, IgGb, IgGc und IgG(T) sehr stark an Protein G (Zellwandbestandteil von Streptokokken der Lancefield-Gruppe G und C), jedoch lediglich IgGa an Protein A (Zellwandbestandteil von Staphylococcus aureus). Besonders wichtig für die Ausübung von Sekundärfunktionen der IgG-Isotypen ist ihre Fähigkeit zur Bindung an Fc-Rezeptoren. So können Immunglobuline der Klasse G über ihre Fc-Region mit phagozytierenden Zellen des Immunsystems (neutrophile u. eosinophile Granulozyten, Monozyten, Makrophagen, Natural Killer (NK)-Zellen) interagieren. Der Nachweis isotypspezifischer Affinitätsunterschiede hinsichtlich verschiedener Fc-Rezeptoren wurde für die Spezies Mensch im Gegensatz zum Pferd bereits erbracht (VAN DE WINKEL u.
CAPEL, 1993). Nach Vergleich der Aminosäuresequenzen von IgG-Isotypen bei Mensch und Pferd kann vermutet werden, dass beim Pferd nur IgG1, IgG3 und IgG6 an Fcγ–
Rezeptoren binden können und somit wichtige Aufgaben in der Immunantwort erfüllen (WAGNER et al. 2002b).
Die verschiedenen IgG-Isotypen dienen weiterhin der gegenseitigen Regulation, da sie über negative Rückkopplungsmechanismen (Feedback-Mechanismen) die fortgesetzte Expression von Antikörpern inhibieren. Eine große Anzahl löslicher Immunglobuline führt zu einer ausgeprägten Abdeckung der Antigenepitope und verhindert somit die weitere Bindung dieser Epitope an B-Zellrezeptoren. Diese Zellen stellen daraufhin die erneute Produktion entsprechender Antikörper ein.
In den letzten Jahren wurden mit der erfolgreichen Charakterisierung von Genen, die die Verschiedenartigkeit der equinen IgG-Isotypen bedingen (WAGNER et al. 1997 u. 2002a u. 2002b u. 2003) und der Herstellung monoklonaler Antikörper gegen einzelne IgG- Isotypen (WAGNER et al. 1995 u. 2003, SHEORAN et al. 1998, SUGIURA et al. 1998, WEGE et al. 2003, WEGE 2004) große Fortschritte auf dem Gebiet der equinen Isotypen- Charakterisierung erzielt, die zukünftig diesbezüglich eine genauere funktionelle Beschreibung der einzelnen Isotypen erwarten lassen
2.2.1.2 IgM
Mit durchschnittlich 1,2 mg/ml ist das IgM als zweithäufigstes Immunglobulin im equinen Blutserum nachzuweisen (McGUIRE et al. 1973). Es wird ebenfalls von Plasmazellen der Milz, der Lymphknoten und des Knochenmarks synthetisiert und abgegeben. Auch IgM besteht aus einer Grundeinheit von zwei schweren und zwei leichten Ketten, kann jedoch Multimere bilden. IgM-Moleküle liegen im Serum als Pentamere, manchmal auch als Hexamere vor. Aufgrund dieser Tatsache stellt es mit einem Molekulargewicht von 900.000 Dalton das schwerste und zugleich größte Immunglobulin dar. Im Verlauf einer Immunantwort steigt die Konzentration von IgM grundsätzlich zuerst an, bleibt aber deutlich unter den erst später nachweisbaren IgG-Mengen (STEVENSON 1999).
Aufgrund seiner zehn Antigenbindungsstellen besitzt das IgM-Pentamer eine relativ effektive Bindungsstärke (Avidität), vermutlich um an repetitive Epitope, beispielsweise Polysacchariden bakterieller Zellwände, zu binden und seine agglutinierenden, komplementaktivierenden und zytotoxischen Effektorfunktionen zu erfüllen (TRAUTWEIN 1990, JANEWAY und TRAVERS 2002a).
2.2.1.3 IgA
Der Blutserumgehalt von IgA schwankt beim Pferd zwischen 0,6 und 3,5 mg/ml. Es kann weiterhin in relativ hohen Konzentrationen in den seromukösen Körpersekreten nachgewiesen werden, da es außer in den regionalen Körperlymphknoten von in der Submukosa der Körperschleimhäuten gelegenen B-Zellen produziert wird. Im Gegensatz zu Blutserum kommt es in den Oberflächensekreten hauptsächlich als Dimer mit einem Molekulargewicht von 360.000 Dalton vor (TIZARD 2004).
Ein Protein, welches auch von den Epithelzellen des Euters synthetisiert wird und als sekretorische Komponente bezeichnet wird, schützt das mit dem Kolostrum sezernierte IgA (sekretorisches IgA = sIgA) vor dem proteolytischen Abbau im Verdauungssystem des Fohlens (TRAUTWEIN 1990). Durch die orale Aufnahme von sekretorischem IgA mit dem Kolostrum erfährt das neugeborene Fohlen eine lokale passive Immunität, da das sIgA sowohl Toxine neutralisiert, als auch an Bakterien und Viren haftet und dadurch deren Bindung an die Schleimhautoberfläche und ihren Eintritt in den Körper verhindert
2.2.1.4 IgE
IgE kommt im Blutserum lediglich in äußerst geringen Konzentrationen vor (< 0,1%), die Halbwertzeit beträgt etwa zwei bis drei Tage. Es besitzt ein Molekulargewicht von 200.000 Dalton und wird von den Körperoberflächen benachbarten Plasmazellen produziert (SUTER und FEY 1981). IgE spielt eine besondere Rolle in der Abwehr parasitärer Erkrankungen und bei allergisch bedingten Reaktionen vom Typ 1 (HALLIWELL u.
GORMAN 1989, TIZARD 2004).
2.2.1.5 IgD
Beim Pferd war das Vorkommen der Antikörperklasse IgD bislang nicht bekannt (TIZARD 2004). Vor kurzem jedoch konnte die für das equine IgD codierende Gensequenz und sogar das entsprechende Transkript, nicht jedoch das IgG-Molekül selbst, nachgewiesen werden (WAGNER et al. 2004).
2.2.2 Immunglobulinvorkommen im Kolostrum
Während der letzten Trächtigkeitswochen kommt es im Hohlraumsystem des Stuteneuters zu einer Konzentrierung von IgG, IgA und IgM (SMITH et al. 1971, JEFFCOTT 1974a).
Das sekretorische IgA wird direkt im Euter gebildet. Das im Kolostrum enthaltene IgG und IgM jedoch stammt aus dem maternalen Blutkreislauf (JEFFCOTT 1975), weshalb dem Stutenkolostrum diesbezüglich eher der Charakter eines Transsudates als der eines Sekretes zugewiesen werden sollte (BACHMANN et al. 1982). SMITH et al. (1971) zeigten, dass beim Rind die Bindung von Östrogen und Progesteron aus dem Blutplasma an Rezeptoren der Drüsenmembran eine wichtige Rolle im Konzentrierungsmechanismus der Immunglobuline einnimmt. In Analogie zu den Verhältnissen beim Rind geht THEIN (2003) beim Pferd ebenfalls von einer entscheidende Einflussnahme dieser beiden Hormone aus.
Ca. 90% der im equinen Kolostrum vorkommenden Immunglobuline gehören der Klasse des IgG an. In wesentlich geringeren Konzentrationen sind die Immunglobuline der Klassen A und M enthalten (KOHN et al. 1989). Mit dem Übergang vom Kolostrum zur Milch kommt es allerdings zu einer prozentualen Verschiebung der
Isotypenzusammensetzung, sodass im weiteren Laktationsverlauf IgA zur quantitativ vorherrschenden Immunglobulinfraktion des equinen Eutersekretes wird (TIZARD 2004).
Im Kolostrum jedoch kommt den Immunglobulinen der Klasse G nicht nur wegen ihrer mengenmäßigen Dominanz, sondern auch aufgrund ihrer funktionellen Bedeutung für das Immunsystem eine Schlüsselstellung zu. Nach KÄHN (1991a) stellt die Klasse des IgG die meisten antibakteriellen, antiviralen und antitoxischen Antikörper bereit. EISENHAUER (1981) und TYLER-McGOWAN et al. (1997) sehen das IgG als hauptverantwortlich für den Infektionsschutz des Fohlens binnen der ersten zwei Lebensmonate an und beurteilen es daher als die wichtigste Immunglobulinklasse im Kolostrum der Stute. Diese Einschätzung spiegelt sich auch in der klinischen Anwendung kommerziell verfügbarer Testkits (z.B. SNAP® Foal IgG Test, Fa. Idexx GmbH, Wörrstadt) zur Kontrolle des IgG- Transfers von der Stute auf das Fohlen wieder (HARPS und KLUG 1995). Bereits 1977 dokumentierten McGUIRE et al. die herausragende klinische Relevanz von Immunglobulin G. In einer umfangreichen Studie an insgesamt 87 Fohlen wurde im postkolostralen Blutserum von 21 Fohlen ein IgG-Gehalt < 4 g/l festgestellt. Im Verlauf der Studie erkrankten insgesamt 10 dieser Fohlen an schwerwiegenden Infektionskrankheiten, die eine veterinärmedizinische Intervention erforderlich machten. Bei den übrigen 66 Fohlen mit IgG-Konzentrationen von > 4 g/l Serum erkrankten lediglich 2 Fohlen, bei denen allerdings aufgrund des milden Krankheitsverlaufes keine Therapie notwendig wurde.
Dieser Zusammenhang zwischen dem Mangel an Immunglobulin G und der Inzidenz von neonatalen Infektionserkrankheiten wurde seitdem mehrmalig nachgewiesen (CRAWFORD et al. 1977, BUNTAIN 1981, McCLURE 1981, THEIN et al. 1983, WHITE 1985, GÈNIN und CLÈMENT 1989).
Die Untersuchung von Stutenkolostrum hinsichtlich seines Gehaltes an IgG war bereits wiederholt Ziel wissenschaftlicher Untersuchungen. Dabei wurden zum Teil sehr unterschiedliche Durchschnittswerte von 10,8 mg/ml bis 113 mg/ml ermittelt (Tab. 2).
Tab. 2: Angaben zum IgG-Gehalt im Kolostrum von Stuten
Autor mg/ml Rasse
ROUSE und INGRAM 1970 45,01) Shetland Pony
McGUIRE und CRAWFORD 1973 10,81) Quarter Horse
McGUIRE et al. 1977 23,51) Englisches Vollblut
NORCROSS 1982 6-102) keine Angaben
SHIDELER et al. 1986 61,81) Warmblut Pferd
THEIN et al. 1989 34,71) Arabisches Vollblut
THEIN et al. 1989 52,61) Warmblut Pferd
MASSEY et al. 1991 113,21) diverse Rassen
CASH 1995 53,01) keine Angaben
DASCANIO et al. 1995 541) keine Angaben
CHAVATTE et al. 1998 75,11) Kaltblut
CHAVATTE et al. 1999 67,71) Warmblut Pferd
LUFT 2000 54,51) diverse Rassen
BUSCHMANN 1990 15-502) keine Angaben
PEARSON et al. 1984 46,11) Englisches Vollblut
PEARSON et al. 1984 96,91) Arabisches Vollblut
PERRYMAN 1980 108,51) Arabisches Vollblut
1) Mittelwert der untersuchten Population, 2) Referenzbereich
Die Bewertung der IgG-Gehalte und die sich daraus ergebende Kolostrum-Qualität erfolgt durch die aufgeführten Autoren unterschiedlich. LeBLANC et al. (1992) bezeichnen Kolostrum mit einem IgG-Gehalt von mehr als 50 mg/ml als hochwertig, wohingegen KÄHN (1991b) erst eine Konzentration von mehr als 70 mg/ml als hoch einstuft, aber bereits 30 mg/ml als ausreichend erachtet.
Da für den Erfolg des passiven Immunitätstransfer von der Stute auf das Fohlen (KÄHN 1991a: IgG-Gehalt im Fohlenplasma > 8 g/l) letztlich die Aufnahme einer ausreichend großen Menge von Immunglobulinen Voraussetzung ist, beurteilten LAVOIE et al. (1989) neben der kolostralen IgG-Konzentration auch die insgesamt mit der Kolostralmilch bereitgestellte IgG-Menge. So konnten LAVOIE et al. (1989) im Gesamtkolostrum von sechs multiparen Stuten im Alter von 5 bis 13 Jahren in den ersten 20 Stunden p.p. eine mittlere IgG-Menge von 440 g ± 106 g nachweisen
2.2.3 Passiver Immunitätstransfer
Aufgrund der erst langsam anlaufenden Eigensynthese von Immunglobulinen ist das neonatale Säugetier auf die maternale Zufuhr einer ausreichend großen Antikörpermenge angewiesen, um einen baldigen humoralen immunologischen Schutz zu erlangen. Dabei besteht neben der Möglichkeit des diaplazentaren Imports nur noch der Weg der oralen Aufnahme. Ob und in welchem Umfang maternale Immunglobuline bereits intrauterin auf den Fetus übertragen werden können, wird durch den Plazentationstyp der jeweiligen Tierart bestimmt (SCHNORR 1996).
Die Plazenta des Pferdes ist eine Placenta epitheliochoriales und weist nach MICHEL (1983) einen sechsschichtigen Aufbau auf: Endothel, Bindegewebe und Epithel der Placenta materna (Uterus), sowie Epithel, Bindegewebe und Endothel der Placenta fetalis (Chorion).
Alle Stoffe, die intrauterin vom maternalen in den fetalen Kreislauf übertragen werden sollen, müssen durch diese Schichten der Plazenta hindurchdiffundieren. Stoffe mit großen Molekulargewichten können die Plazenta aufgrund der relativ weiten Diffusionsstrecke nicht durchdringen. Aus diesem Grund findet beim Pferd kein nennenswerter diaplazentarer Immunglobulintransfer statt (JEFFCOTT 1974a u. 1975, GERHARDS 1986, SCHNORR 1996). Nach SAMUEL et al. (1976) und MICHEL (1983) kommt es aber im letzten Drittel der Trächtigkeit bedingt durch die Auflockerung des Chorionepithels und durch den Abbau maternaler Epithelanteile zu einer Verkürzung des Diffusionsweges und damit möglicherweise zu einem geringfügigen Immunglobulintransfer über die Plazenta.
Tatsächlich konnten McGUIRE und CRAWFORD (1973) und LUFT (2000) im Gegensatz zu MASSEY et al. (1991) schon vor erster Kolostrumaufnahme geringe Immun- globulinkonzentrationen im Blutserum der neugeborenen Fohlen nachweisen. LUFT (2000) ermittelte für präkolostrale IgG-Konzentrationen im Blutserum von 53 Fohlen durchschnittliche Werte von 0,3 mg/ml.
Da der Fetus jedoch selbst ca. ab dem 185. bzw. 200. Gestationstag auf einen entsprechenden Reiz hin mit der Bildung von spezifischen Antikörpern reagieren kann (PERRYMAN 1980, BACHMANN et al. 1982, THEIN et al. 1989), ist der Immun-
Beweis für deren diaplazentare Übertragung. Quantitativ betrachtet, findet die intrauterine Antikörperproduktion des Fetus nur in einem sehr geringen Umfang statt. Nach THEIN (1989) ist der resultierende Schutz daher nur sehr begrenzt und kaum in der Lage , den neonatalen Organismus adäquat vor auf ihn einwirkenden Noxen zu schützen.
Zum Geburtszeitpunkt muss das Fohlen als vollständig immunkompetent betrachtet werden (PERRYMAN 1981, TYLER-McGOWAN et al. 1997, TIZARD 2004). Sein Immunsystem ist zu diesem Zeitpunkt jedoch noch nicht vollständig ausgereift (TYLER- McGOWAN et al. 1997), da nach postnataler Erstexposition eines infektiösen Agents (Primärreaktion) ein Zeitraum von zehn bis 14 Tagen zum Aufbau einer belastbaren humoralen Immunität benötigt wird (PERRYMAN 1981).
Wenngleich die Auffassungen über die An- bzw. Abwesenheit von Antikörpern sowie deren Herkunft im Blutserum von Fohlen unmittelbar p.p. divergieren, besteht Einigkeit darüber, dass sich der Neonat unmittelbar p.p. aufgrund einer unzureichenden Versorgung mit Antikörpern in einer inadequaten immunologischen Situation befindet und daher auf den passiven Transfer maternaler Immunglobuline durch die orale Aufnahme mit dem Kolostrum angewiesen ist (BANKS 1982).
Neben der kolostralen Konzentration geeigneter Immunglobulin-Isotypen und dem jeweiligen Kolostralvolumen entscheidet auch der Zeitpunkt der Kolostralmilchaufnahme über die Effektivität des humoralen Immuntransfers.
Im Verlauf der ersten Stunden p.p. kommt es im Stutenkolostrum, bedingt durch den Saugakt, zu einer stetigen Abnahme der Immunglobulinkonzentration (LAVOIE et al. 1989, MASSEY 1991, WARKO et al. 1993). Bereits nach sechs Stunden p.p. stellten WARKO et al. (1993) einen starken Abfall der IgG-Konzentration im Kolostrum fest. Nach LAVOIE et al. (1989) kommt es acht Stunden p.p. zu einer signifikanten Abnahme der kolostralen IgG-Konzentration. Zwölf bis 15 Stunden p.p. finden sich nur noch 10 bis 20% der ursprünglichen Antikörperkonzentration im Eutersekret der Stute wieder (KÄHN 1991a).
MASSEY et al. (1991) konnten mit dem von Ihnen verwendeten Testsystem (RIDT) im Milchdrüsensekret von 18 Stuten nach zwölf Stunden p.p. überhaupt kein IgG mehr nachweisen. Vor diesem Hintergrund ist der Verlust von Kolostralmilch aufgrund praematurer Laktation oder spontaner Milchejektion ein Risikofaktor für den zukünftigen Immunstatus des Fohlens.
Andererseits verringern sich in den ersten Lebensstunden p.p. auch die immun- globulinspezifischen Resorptionseigenschaften der neonatalen Darmschleimhaut. Unter dem Einfluss von Nebennierenhormonen werden die neonatalen Darmzellen binnen 38 Stunden p.p. durch spezialisierte epitheliale Darmzellen ausgewechselt, die dann keine Fähigkeit zur Absorption von Makromolekülen mehr besitzen (JEFFCOTT 1975).
Beim Kalb kommt es durch Wegfall von Trypsininhibitoren zeitgleich zum Einsetzen der enzymatischen Verdauung von Immunglobulinen (KIM u. SCHMIDT 1983). Inwieweit dieses Phänomen auch beim Fohlen eine Rolle spielt, ist noch unklar.
Die Resorption der Immunglobuline erfolgt durch Pinozytose, ihr Abtransport über das lymphatische System (JEFFCOTT 1974a u. 1975). In Fütterungsversuchen mit spezifischen Immunglobulinen und einem synthetischen Polymer ähnlichen Molekular- gewichtes (Iodiniertes Polyvinyl Pyrrolidone, 125I-PVP K.60) konnte JEFFCOTT (1974b) nachweisen, dass nach drei Stunden p.p. ein Absorptionsmaximum besteht, wohingegen nach 20 Stunden p.p. die Absorption weniger als 1% beträgt. Nach KÄHN (1991a) erfolgt der Schluss der Darmschranke nach ca. 14 Stunden p.p..
Im Gegensatz zu JEFFCOTT (1975) geht TIZARD (2004) beim Fohlen von einer selektiven Immunglobulinaufnahme aus. Dabei soll bevorzugt IgG und IgM resorbiert werden, wohingegen IgA überwiegend im Intestinum verbleibt. Eine selektive Aufnahme von Immunglobulinen aus dem Darmlumen wird bei zahlreichen Säugetierspezies durch den sogenannten FcRn-Rezeptor vermittelt. Dieser Rezeptor, der in sehr ähnlicher Form auch am Dottersack des Huhnes vorkommt, wurde ebenfalls in der menschlichen Plazenta nachgewiesen und ist dort für den Transfer maternaler Immunglobuline auf den Fötus verantwortlich (JANEWAY und TRAVERS 2002b).
2.2.4 Fehlerhafter passiver Transfer (FPT)
Eine unzureichende kolostrale IgG-Aufnahme und ein daraus resultierender ungenügender IgG-Gehalt im Blut des Fohlens wird als fehlerhafter passiver Transfer (FPT) bezeichnet (KÄHN 1991a). Man kann dabei zwischen partiellem (IgG-Gehalt im Fohlenplasma < 8 g/l) und vollständigem FPT (IgG-Gehalt im Fohlenplasma < 4 g/l) unterscheiden (TYLER-McGOWAN et al. 1997, CHAFFIN und COHEN 1998).
Nach KÄHN (1991a) und CHAVATTE-PALMER et al. (2001) kommt es je nach Pferdepopulation und Nachweisgrenze für IgG bei 3 bis 24% aller Fohlen zum Auftreten von FPT. Der FPT wird als die häufigste postnatale Komplikation bei Fohlen überhaupt angesehen (PERRYMAN und CRAWFORD 1979, PERRYMAN und McGUIRE 1980).
Das aus dem FPT resultierende neonatale Defizit an maternalen Antikörpern steht dabei im direkten Zusammenhang mit der zu erwartenden Infektionshäufigkeit der betroffenen Fohlen (McGUIRE et al. 1977, CRAWFORD et al. 1977, BUNTAIN 1981, McCLURE 1981, THEIN et al. 1983, WHITE 1985, GÈNIN und CLÈMENT 1989). In einer umfangreichen Studie mit 254 Fohlen konnten GÈNIN und CLEMENT (1989) bei 49% der Tiere mit FPT das Auftreten einer Infektionskrankheit diagnostizieren, die wiederum bei 44% dieser Probanden zum Tode führte.
MORRIS et al. (1985), LeBLANC et al. (1992) und WARKO et al. (1993) stellten eine signifikante Korrelation zwischen dem IgG-Gehalt im Kolostrum und dem im Fohlenserum fest. Als wichtige Ursache für das Auftreten von FPT wird neben der verspäteten Kolostrumaufnahme eine unzureichende Kolostrumqualität hinsichtlich des Immunglobulin- gehaltes angesehen (CRAWFORD et al. 1977, CHAVATTE-PALMER et al. 2001).
Schon CRAWFORD et al. (1977) stellten in Ihren Untersuchungen bei mehr als der Hälfte der Fohlen mit diagnostiziertem FPT einen zu geringen Antikörpergehalt im Kolostrum fest.
2.2.5 IgG-Bestimmungsmethoden
Quantitative Bestimmungen des IgG-Gehaltes im equinen Blutserum und Kolostrum können in spezifische und unspezifische Methoden unterteilt werden (KÄHN 1991b).
2.2.5.1 Spezifische IgG-Bestimmungsmethoden
Diese Methoden basieren auf einer Antigen-Antikörperreaktion, bei der gegen IgG gerichtete Antikörper eine Bindung mit dem als Antigen fungierenden IgG eingehen. Die Intensität dieser spezifischen Antigen-Antikörperreaktion kann durch labortechnische Hilfsmittel detektiert werden.
Für die Analyse von IgG in Blutserum und Kolostrum von Pferden wurden der Radiale Immuno-Diffusions-Test (ROUSE und INGRAM 1970), der Latexagglutinationstest
(COWLES et al. 1983) und der Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (LUFT 2000) angewendet.
Radialer Immuno-Diffusions-Test (RIDT)
Der von ROUSE und INGRAM (1970) zur Bestimmung von IgG in equinen Serum- und Kolostrumproben entwickelte Test wurde aufgrund seiner großen Genauigkeit in zahlreichen Studien als Referenzmethode eingesetzt (EISENHAUER 1981, LEBLANC et al. 1986 u. 1992, KOHN et al. 1989, LAVOIE et al. 1989, WAELCHLI et al. 1990, MASSEY et al. 1991, WARKO und BOSTEDT 1993, DASCANIO et al. 1995, CHAVATTE et al.
1998). Von WILKINS und DEWAN-MIX (1993) wurde der RIDT als „gold standard“ zur Bestimmung von equinem IgG bezeichnet. Bei diesem Verfahren wird nach MANCINI et al. (1965) zunächst eine Agarplatte mit einer definierten Menge gegen equines IgG gerichteter Antikörper präpariert. In diesen Agar werden Löcher gestanzt, in die die zu untersuchenden Serumproben überführt werden. Binnen 18 bis 24 Stunden (KÄHN 1991b) bilden sich radial der Stanzlöcher aus Antigen-Antikörper-Komplexen bestehende erkennbare Präzipitathöfe. Über den Vergleich der Präzipitatdurchmesser mit denen einer mitgeführten Standardreihe kann eine Quantifizierung des IgG-Gehaltes der Probe erfolgen. Nachteile dieser Labormethode sind die sehr langen Reaktionszeiten, die Empfindlichkeit gegenüber Temperaturschwankungen und der relativ geringe Probendurchsatz. Nach KÄHN (1991b) erlaubt das Funktionsprinzip des RIDT die Durchführung sehr genauer Messungen. Allerdings können die festgestellten Werte insbesondere bei der Verwendung verschiedener kommerzieller Testkits zum Teil erheblich variieren. Hieraus resultieren Schwierigkeiten beim quantitativen Vergleich von Ergebnissen verschiedener Publikationen.
Latexagglutinationstest (LAT)
Beim LAT-Verfahren bilden gegen equines IgG gerichtete und an Polystyrene (Latex)- Partikel gebundene Antikörper Komplexe mit dem in der Probe enthaltenen IgG. Die Zeit bis zum Ausfällen dieser Komplexe dient als Größe zur Beurteilung des IgG-Gehaltes in der Probe. Es handelt sich um einen Feldtest für die „Stallgasse“, dessen Ergebnis bereits
Zuverlässigkeit dieser Methode zur Bestimmung von equinem IgG wurde erstmals von COWLES et al. (1983) untersucht und nachgewiesen. Nach GERHARDS (1986) soll durch die Mituntersuchung von Standardseren auch ein quantitatives Ergebnis möglich sein.
Prinzipiell ist der LAT jedoch als semiquantitativer Schnelltest konzipiert, dessen Ergebnis lediglich eine grobe Einschätzung der vorliegenden IgG-Verhältnisse gestattet. Neben der Untersuchung von Blut und Serum ist nach einigen Modifikationen auch die Bestimmung von IgG im Kolostrum möglich (THEIN 1989).
WAELCHLI et al. (1990) nennt als Hauptkritikpunkte des LAT die relativ hohen Kosten bei der Untersuchung größerer Probenumfänge, sowie die subjektive Einschätzung des jeweiligen Untersuchers beim Ablesen der Ergebnisse.
Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)
Erst in den letzten Jahren wurde mit der Entwicklung von ELISA-Systemen moderne Diagnostika zur Evaluierung von IgG-Konzentrationen in Blutserum- und Kolostrumproben von Tieren entwickelt. So etablierten STENGEL (1998) und AMON (1999) entsprechende ELISA-Systeme für die Untersuchung des IgG-Gehaltes in Proben boviner Herkunft. Für eine quantitative Analyse von IgG im Blutserum und im Kolostrum von Pferden wurde wenig später ein Verfahren von LUFT (2000) vorgestellt. Hingegen kann ein semiquantitativer IgG-Schnelltest auf ELISA-Basis (SNAP® Foal IgG Test, Fa. Idexx GmbH,Wörrstadt), der für die Anwendung in Serum-, Plasma- oder Vollblut konzipiert ist, bereits seit einigen Jahren kommerziell erworben werden.
Mittlerweile wird die exakte quantitative Bestimmung von equinem IgG in Blutserum- und Kolostrumproben mittels ELISA-Technologie auch als labordiagnostische Dienstleistung angeboten (Fa. Biocheck Labor für Veterinärdiagnostik u. Umwelthygiene GmbH, Leipzig).
Bei der ELISA-Labormethode zur Bestimmung von equinem IgG findet das folgende Funktionsprinzip Anwendung. Zunächst wird die Oberfläche einer Mikrotiterplatte (MTP) mit gegen equines IgG gerichteten Antikörpern in einer bestimmten Konzentration als Fänger-Antikörper beschichtet. Das Probenmaterial wird dann zu den immobilisierten Fänger-Antikörpern in die MTP gegeben, so dass es zur Bildung von Antigen-Antikörper- Komplexen kommt. Anschließend werden enzymmarkierte Sekundärantikörper, die ebenfalls gegen equines IgG gerichtet sind, aufgetragen. Nach dem Abwaschen nicht
gebundener Sekundärantikörper wird ein zunächst farbloses spezifisches Substrat dazugegeben, das durch eine enzymatische Reaktion in ein farbiges Produkt umgesetzt wird. Die entstandene Färbung kann daraufhin photometrisch als Extinktion gemessen werden. Durch den Vergleich der Ergebnisse mit denen einer mitgeführten Standardreihe erfolgt die Berechnung der IgG-Konzentration von Kolostrum- bzw. Blutserumprobe.
Die im Folgenden dargestellten Vorteile des ELISA-Testsystems sollen dessen Eignung für den Einsatz als Standardmethode aufzeigen.
Nach CROWTHER (1995) wird das im Labor durchzuführende ELISA-Verfahren als eine relativ schnelle und effiziente Methode beurteilt, die bereits nach ca. vier Stunden zu genauen Ergebnissen führt, welches beim RIDT erst nach 18 bis 24 Stunden möglich ist (KÄHN 1991b). Auf einer Mikrotiterplatte kann im Vergleich zu einer durchschnittlichen Agarplatte ein deutlich größerer Probenumfang bei zugleich reduziertem Reagenzienverbrauch bearbeitet und die Personalkosten durch Automatisierungsprozesse verringert werden. Die Verwendung von Photometern zur Messung der Extinktion (Messung der optischen Dichte) garantiert eine hohe Objektivität, die zusätzlich durch eine PC-gestützte Datenauswertung mit vorgegebenen Validierungskriterien eine gute Reproduzierbarkeit der Methode ergibt. Weiterhin überzeugt der ELISA mit seiner im Vergleich zum RIDT extrem hohen Sensitivität, so dass selbst die Bestimmung von sehr niedrigen Konzentrationen möglich wird.
2.2.5.2 Unspezifische IgG-Bestimmungsmethoden
Bei den unspezifischen Methoden wird der IgG-Gehalt aus der Messung eines mit dem IgG-Gehalt korrelierenden Parameters abgeleitet. Da etwa 90% aller im equinen Kolostrum anzutreffenden Immunglobuline der Klasse IgG angehören (KOHN et al. 1989), kann vom Gesamtimmunglobulingehalt auf den Anteil der IgG-Fraktion geschlossen werden. Als Methoden zur Bestimmung des Gesamtimmunglobulingehaltes in Proben equiner Herkunft werden der Zinksulfat-Trübungstest (JEFFCOTT 1974a) und der Glutaraldehyd-Koagulationstest angegeben (JONES und BROOK 1994).
Weiterhin werden auch die Refraktometrie (CASH 1995) und die Aräometrie/Kolos- trometrie (LeBLANC 1986) zu den unspezifischen Methoden gezählt. Bei diesen
festgestellt, die mit den spezifisch bestimmten kolostralen IgG-Konzentrationen korrelieren und so zur semi-quantitativen Bewertung von IgG genutzt werden können.
Zinksulfat-Trübungstest (ZST)
Der Zinksulfat-Trübungstest zur Bestimmung von IgG in Kolostrum- und Serumproben equiner Herkunft wurde erstmals von JEFFCOTT (1974a) vorgestellt. Beim ZST werden alle hochmolekularen Proteine und somit auch alle Globuline durch Zinkionen kolloidal ausgefällt, so dass es zur Trübung der zuvor klaren Zinksulfatlösung kommt. Die Trübungsintensität ist dabei proportional zum Immunglobulingehalt und wird anhand unterschiedlich gefärbter Fotografien beurteilt, wobei diese visuelle Auswertung nach EBERHARDT und GERHARDS (1992) sehr leicht zu Fehleinschätzungen führen kann.
Weil die Spezifität der Methode nicht mit der der ELISA-Technik vergleichbar ist, können keine exakten IgG-Konzentrationen ermittelt werden. Die Durchführung des Testes beansprucht ca. eine Stunde und kann sowohl mit Blutserum- als auch mit Kolostrumproben durchgeführt werden (KÄHN 1991b).
RUMBAUGH et al. (1978) fanden in Blutseren von 84 Fohlen eine signifikante Korrelation (r=+0,88) zwischen den Ergebnissen von ZST und RIDT und empfahlen zur Erhöhung der Ablesegenauigkeit die Verwendung eines Turbidimeters (optisches Trübungsmessgerät).
MORRIS et al. (1985) fanden nach Auswertung von RIDT- und ZST-Untersuchungen in 136 Serumproben zwar ebenfalls eine signifikante Korrelation, merkten jedoch an, dass der ZST im oberen und unteren Messbereich zu hohe bzw. zu niedrige IgG- Konzentrationen ergab. Weiterhin kann das Ergebnis des ZST durch hämolytische Blutserumproben verfälscht werden. Ein Anteil von 1% lysierter Erythrozyten täuscht aufgrund des bei der Hämolyse freigesetzten Hämoglobins eine Erhöhung der IgG- Konzentration um 2 mg/ml, ein Anteil von 5% bereits um 11,5 mg/ml vor (RUMBAUGH et al. 1978).
Glutaraldehyd-Koagulationstest (GCT)
Dieser Test wurde von JONES und BROOK (1994) als eine praktikable Feldmethode zur Evaluierung von IgG-Gehalten in von Pferden stammenden Proben vorgestellt.
Dabei wird den Proben Glutaraldehyd zugesetzt, woraufhin es bevorzugt zu intermolekularen Bindungen zwischen dem Glutaraldehyd und basischen sowie aromatischen Aminosäuren kommt. Dieses führt somit auch zur Ausfällung der Gammaglobuline und die Zeitspanne bis zur Gelbildung dient als Messgröße zur Berechnung des IgG-Gehaltes. KÄHN (1991b) empfiehlt den GCT nur mit Blutserum durchzuführen, um eine Einflussnahme von Fibrinogen auszuschließen. Nach JONES und BROOK (1994) kann die IgG-Bestimmung mit dem GCT sowohl in Blutserum- als auch in Kolostrumproben vorgenommen werden.
Refraktometrie
Proteinhaltige Lösungen besitzen die Eigenschaft, durch sie hindurch tretende Lichtstrahlen zu brechen. Zur Feststellung des Lichtbrechungsvermögens wird das Substrat auf das Prisma eines Refraktometers aufgetragen und die Brechzahl, auch Brechungsindex genannt, beim Durchtreten des Lichtes als Grenzwinkel der Totalreflexion festgestellt (SEIBT 1987, KUCHLING 1995).
WAELCHLI et al. (1990), CASH (1995) und CHAVATTE et al. (1998) bestimmten mit verschiedenen Refraktometern das Lichtbrechungsvermögen von equinem Kolostrum, wobei sich reproduzierbare Beziehungen zwischen Brechungsindex und IgG- Konzentration der Proben ergaben. Zur Bestimmung der jeweiligen IgG-Konzentration bedienten sich WAELCHLI et al. (1990) und CHAVATTE et al. (1998) des Radialen Immuno-Diffusions-Test, CASH (1995) nutzte hierfür die Detektionsmöglichkeit der Immunoturbidometrie. CASH (1995) und CHAVATTE et al. (1998) fanden zwischen den beiden Messparametern hohe Korrelationskoeffizienten von r=+0,95 bzw. r=+0,92 und beurteilten die Refraktometrie als brauchbare Feldmethode zur Ermittlung des IgG- Gehaltes im Kolostrum von Stuten. Auch WAELCHLI et al. (1990) zeigte die signifikante Korrelation zwischen Brechungsindex und IgG-Gehalt der Proben auf, musste jedoch vor der eigentlichen Messung eine Verdünnung der Kolostrumproben vornehmen. Aus diesem Grund erachtete er die Refraktometrie als Untersuchungsverfahren für die Stallgasse als ungeeignet.
Repräsentative Vergleichsuntersuchungen mit ELISA-Techniken liegen bislang nicht vor.
Aräometrie/Kolostrometrie
Beim Eintauchen eines Körpers in eine Flüssigkeit erfährt dieser eine nach oben gerichtete Auftriebskraft. Dem Betrage nach ist diese gleich der Masse der vom Körper verdrängten Flüssigkeit. Dieser Zusammenhang wird als Archimedisches Prinzip bezeichnet. Da sich bei einem schwimmenden Körper das Gesamtvolumen des Körpers zu dem eintauchenden Teil wie die Dichte der Flüssigkeit zu der Dichte des Körpers verhält, ist die Eintauchtiefe einer Senkspindel (Aräometer) in die zu untersuchende Flüssigkeit ein Maß für die Dichte der jeweiligen Flüssigkeit (SEIBT 1987). Seit 1978 wird die Dichte eines Stoffes nach dem gesetzlich vorgeschriebenen Einheitensystem, dem Système International d’Unités (S.I.) in g/ml angegeben (GIESE 1997). Für die schnell durchführbare Dichtemessung von Flüssigkeiten sind verschiedenartige Senkspindeln mit unterschiedlichen Skalen erhältlich. Zur Bestimmung der Dichte von equinem Kolostrum sind sogenannte „Kolostrometer“ seit längerer Zeit kommerziell verfügbar (Equine Colostrometer, Firma Lane Manufacturing Inc., Colorado, USA). Die Dichte einer Flüssigkeit ist von der Qualität und der Quantität der in ihr gelösten Teilchen und von den sich auswirkenden Oberflächenkräften abhängig. Der Vergleich von Messergebnissen der Kolostrometrie mit Ergebnissen des RIDT (Tab. 3) in identischem Probenmaterial ergab eine hohe Korrelation zwischen diesen Parametern (LeBLANC 1986, WAELCHLI et al.
1990, DASCANIO et al. 1995, CHAVATTE et al. 1998).
Vergleichsuntersuchungen zwischen Kolostrometrie- und ELISA-Methode wurden in der verfügbaren Literatur nicht gefunden.
Tab. 3: Korrelation zwischen Kolostrometrie- und RIDT-Methode im Kolostrum für IgG- Konzentrationen
Autor r n p
LeBLANC et al. (1986) 0,90 100 <0,01
WAELCHLI et al. (1990) 0,97 27 <0,01
DASCANIO et al. (1995) 0,72 30 <0,001
CHAVATTE et al. (1998) 0,43 25 <0,05
r = Korrelationskoeffizient, n = Probenanzahl, p = Irrtumswahrscheinlichkeit
Weitere Methoden, die zur Bestimmung von equinem IgG angewendet wurden, sind die Nephelometrie (EISENHAUER 1981), der Hämagglutinations-Hemmungs-Test (LEY et al.
1990), die Immunelektrophorese (ROUSE und INGRAM 1970), der Natriumsulfat- Fällungstest (RUMBAUGH et al. 1978), die Immunoturbidometrie (KENT und BLACKMORE 1985, STONEHAM et al. 1991), die Rheometrie (WAELCHLI et al. 1990) und der Kolostrumfarbvergleich (CHAVATTE et al.1998). Nach KÄHN (1991b) sind die meisten dieser Methoden für die Untersuchung von Kolostrumproben ungeeignet, weil zum Teil erhebliche Unterschiede hinsichtlich Nachweisgrenzen, Präzision, Durch- führungsdauer, Arbeitsaufwand und Kosten bestehen.
2.3 Hauptinhaltsstoffe des Stutenkolostrums
Neben seiner Bedeutung für die neonatale Immunabwehr erfüllt das Eutersekret der Stute wichtige nutritive Funktionen.
Mit seiner Geburt wechselt das Fohlen von einer thermoneutralen in eine hypothermale Umgebung und ist, da nur mit geringen eigenen Energiereserven ausgestattet, zur Aufrechterhaltung seines Metabolismus auf die rasche Aufnahme von Kolostrum angewiesen (MEYER und KAMPHUES 1990). Dieses setzt sich bei allen Säugetieren aus den gleichen Milchinhaltsstoffen zusammen. Das Mengenverhältnis der einzelnen Inhaltsstoffe variiert jedoch tierartspezifisch, da es auf die jeweiligen Ansprüche der Jungtiere abgestimmt sein muss (KIELWEIN 1994).
Die mittlere Zusammensetzung der Hauptinhaltsstoffe von Stutenkolostralmilch (Fett, Eiweiß und Laktose) im Vergleich zu anderen Tierarten wird in der Tab. 4 gegen- übergestellt (BOSTEDT u. WALSER, 1990). Die angegebenen Gehalte stimmen dabei mit den Ergebnissen anderer Untersuchungen überein (OFTEDAL et al. 1983, BÜHLBÄCKER 1996).
Tab. 4: Mittlere Zusammensetzung der Hauptinhaltsstoffe im Kolostrum verschiedener Tierarten
Tierart Fett [%] Eiweiß [%] Laktose [%]
Pferd 0,7 19,1 4,6
Rind 3,6 13,0 3,1
Schaf 12,4 13,0 3,4
Ziege 9,0 8,0 2,5
Schwein 7,2 18,0 2,4
Hund 7,8 13,8 2,7
Kaninchen 14,7 13,5 1,6
Die für die equine Kolostralmilch typische Zusammensetzung lässt sich im Gegensatz zu den Verhältnissen beim Rind nur während eines relativ kurzen Zeitraumes bis max. 48 Stunden p.p. nachweisen (BÜHLBÄCKER 1996).
In ihrer Struktur ähnelt die reife Milch der Stute am ehesten der Milch von Frauen und besitzt daher eine besondere Eignung für Frühgeborenen- und Säuglingsnahrung und wird auf dem Gebiet der Humanmedizin bei einer Reihe von Erkrankungen eingesetzt (BÜHLBÄCKER 1996).
In Tab. 5 wird die mittlere Zusammensetzung der Hauptinhaltsstoffe in der Milch verschie- dener Säugetiere angegeben. Die von KIELWEIN (1994) gemachten Angaben werden durch die Ergebnisse anderer Autoren bestätigt. (DOREAU et al. 1990, SONNTAG 1996).
Tab. 5: Mittlere Zusammensetzung der Hauptinhaltsstoffe in reifer Milch verschiedener Tierarten
Tierart Fett [%] Eiweiß [%] Laktose [%]
Pferd 1,9 2,5 6,2
Rind 3,9 3,4 4,7
Schaf 7,2 5,5 4,8
Ziege 3,5 3,2 4,3
Schwein 6,8 4,8 5,5
Hund 12,9 7,9 3,1
Kaninchen 18,3 13,9 2,1
Mensch 4,0 0,9 7,1
2.3.1 Eiweiß
Die Eiweißfraktion der reifen Stutenmilch setzt sich aus den Kaseinen (1,3%) und den Molkeneiweißen (1,2%), auch Milchserumproteinen genannt, zusammen (KIELWEIN 1994). Aufgrund des hohen Immunglobulingehaltes dominiert im Kolostrum eindeutig die Molkeneiweißfraktion. Der Gesamtproteingehalt im Kolostrum ist mit durchschnittlich 19,1% (ULLREY et al. 1966) bzw. 15,1% (EISENHAUER 1981) sehr hoch, erreicht jedoch am zweiten Tag p.p. nur noch ein Viertel seines Ausgangswertes (SMOCZYNSKI und TOMCSYNSKI 1983).
Schwankungen im Gehalt der Eiweiße sowie der weiteren Inhaltsstoffe können neben der individuellen Veranlagung auch in der unterschiedlichen Fütterung, Haltung, Gesund- heitsstatus und in der Zwischenmelkzeit begründet sein.
Biosynthese der Milcheiweiße
Die milchspezifischen Eiweiße stammen entweder direkt aus dem Blutplasma (Albumin, IgG, IgM) oder werden durch im Euter befindliche Plasmazellen bereitgestellt (IgA) (SMITH et al. 1971, BACHMANN et al. 1982, TIZARD 2004). Kaseine, α-Lactalbumine und β-Lactoglobuline werden in den Alveolarzellen des Euters synthetisiert (GÜRTLER und SCHWEIGERT 1999). Der komplexe Vorgang der Polykondensation der aufgenommenen Aminosäuren findet im rauen endoplasmatischen Retikulum (RER) statt.
Die gebildeten Polypeptide gelangen anschließend durch das Zytoplasma in den Golgi- Apparat, um von dort nach biochemischer Umwandlung (Phosphorylierung und Glycosylierung) in Transportvesikel verpackt zur apikalen Zellmembran zu wandern. Die Vesikel verschmelzen mit der Plasmamembran und ihr Inhalt wird in Form einer ekkrinen Sekretion in das Alveolarlumen abgegeben (KIELWEIN 1994).
2.3.2 Laktose
Laktose (4-ß-Galaktosyl-1-Glukose) ist ein aus α- oder ß-Glukose und ß-Galaktose zusammengesetztes Disaccharid und kommt außer in den Früchten einiger tropischer Milchsaftgewächse nur in der Milch von Säugetieren vor (KIELWEIN 1994). Sie erfüllt eine
wichtige Funktion als Energielieferant. Ungefähr 45% der in Stutenmilch enthaltenen Energie entstammen der Laktose (WALSER und BOSTEDT 1990).
Stutenkolostrum enthält durchschnittlich 4,6% Laktose (ULLREY et al. 1966). Im Laktationsverlauf kommt es jedoch in den ersten drei Wochen p.p. zu einem Anstieg des Milchzuckergehaltes auf 6,1% mit einem mittleren Endgehalt von 6,6% in reifer Milch (ULLREY et al. 1966, SMOCZYNSKI und TOMCSYNSKI 1983). Stutenmilch stellt somit im Vergleich zu anderen Haustieren eine ausgesprochen laktosereiche Milch dar.
Biosynthese der Laktose
Die Laktose wird aus der Blutglukose und der im Euter aus Glukose gebildeten Galaktose synthetisiert. Dieses geschieht in den Hohlräumen des Golgiapparates der Alveolarzelle.
Die Laktose gelangt in Vesikeln zur Lumenseite der Epithelzellen. Diese verschmelzen dort mit der apikalen Membran. Da die Vesikelmembran für die Laktose nicht permeabel ist, gelangt Wasser durch Osmose in die Vesikel und wird gemeinsam mit dem übrigen Vesikelinhalt in das Alveolarlumen abgegeben (GÜRTLER und SCHWEIGERT 1999).
2.3.3 Fett
Das Milchfett der Stute als Triglyceridester weist im Vergleich zu dem anderer Tierarten einen hohen Gehalt mehrfach ungesättigter, langkettiger Fettsäuren auf (FAHR u. VON LENGERKEN 2003). Es besitzt nicht nur Bedeutung als Energieträger, sondern ist auch gleichzeitig das Lösungsmittel für die fettlöslichen Vitamine A, D, E und K sowie Carotinoide (GÜRTLER und SCHWEIGERT 1999).
Im Kolostrum soll der Fettgehalt etwa 24 Stunden p.p. sein Maximum erreicht haben, um im weiteren Verlauf der Laktation kontinuierlich abzufallen (ASHCRAFT und TYZNIK 1976, BÜHLBÄCKER 1996). Der mittlere Fettgehalt in der Stutenmilch beträgt gegen Mitte der Laktation 1,29% ± 0,07% (OFTEDAL et al. 1983).
Biosynthese der Milchfette
Die Biosynthese der Milchfette verläuft in der Milchdrüse in zwei Schritten. Zunächst kommt es zur Bereitstellung der Fettsäuren durch Synthese und Diffusion, anschließend werden diese mit dem aus der Glukose gebildeten Glycerin verknüpft. Für die Biosynthese
von Milchfett werden überwiegend Fettsäuren aus den Lipoproteinen des Blutes verwendet, die zuvor durch Lipoproteinasen abgespalten und in dieser Form aktiv in die Alveolarzellen eingeschleust werden.
Die im rauen endoplasmatischen Retikulum (RER) der Alveolarzelle synthetisierten Fette bilden kleinste Fetttröpfchen, die zu größeren Fettkügelchen aggregieren und im Golgi- Apparat von einer Membran umhüllt werden. Sie gelangen durch das Zytoplasma zur apikalen Membran der Alveolarzelle und durchdringen diese. Der innere Teil der Zellmembran legt sich dabei um das in den Alveolarraum übertretende Fettkügelchen und wird zur äußeren Schicht der Fettkügelchenhülle in der Milch. Diese apokrine Fettsekretion ist abhängig vom Innendruck des Alveolarraumes. Mit steigendem Alveolardruck gelangen immer weniger Fette, aber dafür mehr wasserlösliche Bestandteile durch die Zellmembran in den Alveolarraum. Bei Erkrankungen der Milchdrüse kann es aufgrund einer verringerten Milchleistung zu einem niedrigeren Alveolardruck und somit erhöhten Fettgehalt in der Milch kommen (KIELWEIN 1994).
Die Verhältnisse zwischen den oben genannten kolostralen Inhaltsstoffen und dem IgG- Gehalt wurde von DASCANIO et al. (1995) untersucht. Negative Korrelationen existierten zwischen IgG- und Fett-Gehalt (r=-0,45) und zwischen IgG- und Laktose-Gehalt (r=-0,8), eine positive Korrelation hingegen bestand zwischen IgG- und Gesamtprotein-Gehalt (r=+0,76).
2.3.4 Harnstoff
Harnstoff ist Hauptbestandteil der Non-Protein-Nitrogen-Fraktion (NPN-Fraktion: in 12%
Trichloressigsäure lösliche stickstoffhaltige Substanzen der Milch) des Eutersekretes und stellt ein leicht membrangängiges Stickstoffwechselendprodukt dar, das teilweise über die Milch ausgeschieden wird (KIELWEIN 1994).
Bei Kühen besteht eine deutliche Korrelation zwischen dem Harnstoffgehalt in Milch und Blut (SONNTAG 1996). Im Bereich der Milcherzeugung wird er als Parameter zur Überprüfung einer leistungs- und wiederkäuergerechten Fütterung regelmäßig in der Anlieferungsmilch bzw. in Einzelgemelkproben kontrolliert.
Exemplarische Untersuchungen über den Harnstoffgehalt im Stutenkolostrum wurden
