3. Inkubation mit sekundären Antikörpern und deren anschließender Nachweis
3.2.2.2 Direkter Sandwich-ELISA zur Bestimmung von IgG in equinem Kolostrum und Serum
Zur Bestimmung des Gehalts an Immunglobulin G in den Serum- und Kolostrumproben mittels ELISA erfolgte in Anlehnung an die Methode von LUFT (2000) die Entwicklung eines eigenen Testsystems.
Reagenzien und Geräte für Test-Platten-Herstellung und ELISA-Durchführung
• Fänger-Antikörper: AffiniPure Goat Anti-Horse†† IgG, Fc Fragment Specific (Fc-Fragment-spezifisches Ziege-anti-Pferd-IgG)
(Nr. 108-005-008, Fa. Dianova, Hamburg)
• Verdünnungs- und Waschpuffer: TBST, Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit TWEEN 20® -Zusatz (Rezept s. Anhang 9.2)
• IgG-Standard: Chrome Pure horse IgG whole molecole
(Nr. 008-000-003, Fa. Dianova, Hamburg)
• Konjugat: Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Horse IgG [H+L] (Ziege-anti-Pferd-IgG-PO) (Nr. 108-035-003, Fa. Dianova, Hamburg)
• Substrat für die Peroxidasereaktion: Tetramethylbenzidin-Substratpuffer/TMB
(TMBlue, Nr. ESP 100, Fa. Viro-Immun Labor-Diagnostika GmbH, Oberursel)
• Stoppreagenz: 0,5 M Schwefelsäure (Fa. AppliChem, Darmstadt)
• Maxisorb®-Mikrotiterplatten (Fa. Nunc, Wiesbaden)
• Vario- und Mehrkanal-Mikrotiterpipetten (Fa. Eppendorf, Hamburg)
• Schüttelrotator IKA®-Schüttler MTS 4 (Fa. IKA-Labortechnik, Staufen)
• ELISA-Washer PW 96 (Fa. Tecan, Crailsheim)
• ELISA-Reader SLT-Spectra (Fa. SLT-Labinstruments GmbH, Crailsheim)
• Software Magellan®3.11 (Fa. Tecan, Crailsheim)
3.2.2.2.1 Vorversuche
Die Etablierung des IgG-ELISA machte Vorversuche zu den im Folgenden beschriebenen Punkten erforderlich:
a) Optimierung der Beschichtungskonzentration b) Optimierung der Konjugatkonzentration
c) Optimierung der IgG-Standardreihe
d) Bestimmung unspezifischer Hintergrundreaktionen
e) Überprüfung der Messbarkeit von Blutserum- bzw. Kolostrumproben
f) Untersuchung von Blutserum- bzw. Kolostrumproben auf der Basis von Ver-dünnungsreihen (Titration) im Vergleich zu Einpunktmessungen im Duplikat
Diese Vorversuche wurden wie auch die Hauptversuche gemäß den unter 3.2.2.2.2 und 3.2.2.2.3 angegebenen Arbeitsvorschriften durchgeführt.
Sämtliche ELISA-Untersuchungen dieser Arbeit erfolgten mit Mikrotiterplatten (MTP) derselben Charge. Die in die einzelnen Kavitäten der MTP pipettierten Volumina betrugen bei jedem Reaktionsschritt grundsätzlich 100 µl.
a) Optimierung der Beschichtungskonzentration
Zur Beschichtung („Coaten“) wurde der als Fänger-Antikörper eingesetzte Fc-Fragment-spezifische Ziege-anti-Pferd-IgG-Antikörper mit Beschichtungspuffer (Bicarbonatpuffer, 50 mmol/l) auf eine Konzentration von 10 µg/ml verdünnt. Von dieser Konzentration ausgehend wurde in den einzelnen Spalten der MTP eine geometrische 1:2 Verdünnungsreihe mit Bicarbonatpuffer (50 mmol/l) angelegt. Diese deckte einen Konzentrationsbereich von 10 µg/ml in Spalte eins bis 9,77ng/ml in Spalte elf ab. Spalte zwölf wurde zur Erkennung unspezifischer Hintergrundreaktionen (Leerwertbestimmung) nur mit Beschichtungspuffer ohne Fänger-Antikörper beschickt.
Bei der ELISA-Durchführung wurde der IgG-Standard von Reihe A bis Reihe G ab einer Konzentration von 1 µg/ml geometrisch 1:2 mit TBST verdünnt. Die Reihe H wurde zur Leerwertbestimmung nur mit TBST ohne IgG-Standard beschickt. Die Standardreihen umfassten einen Konzentrationsbereich von 1 µg/ml bis 15,6 ng/ml.
Ergebnis:
Für den Fängerantikörper erwies sich eine Beschichtungskonzentration von 1 µg/ml als geeignet.
b) Optimierung der Konjugatkonzentration
Die MTP wurde mit einer Fängerantikörperkonzentration von 1 µg/ml beschichtet.
Der IgG-Standard wurde mit TBST auf 1 µg/ml eingestellt und von Reihe A bis G geometrisch 1:2 titriert (1 µg/ml bis 15,6 ng/ml). Die Reihe H wurde zur Erkennung unspezifischer Hintergrundreaktionen nur mit TBST ohne IgG-Standard beschickt.
Als Konjugat wurden peroxydasekonjugierte gegen Pferde-IgG gerichtete Antikörper aus der Ziege verwendet. Um einen möglichst weiten und gleichzeitig dichten Bereich von
ausgehend von einem 1:5000 (Spalte 1 bis 6) bzw. 1:4000 (Spalte 7 bis 11) verdünnten Konjugat nebeneinander angelegt. Auf diese Weise wurden Konjugatverdünnungen von 1:5.000 bis 1:160.000 bzw. von 1:4.000 bis 1:64.000 untersucht. Die Reihe H wurde zur Bestimmung des Leerwertes nur mit TBST ohne Konjugat beschickt.
Ergebnis:
Die optimale Verdünnung des Konjugates für den Einsatz im IgG-ELISA lag bei 1:15.000.
c) Optimierung der IgG-Standardreihe
Für die Optimierung von Beschichtungs- und Konjugatkonzentration wurden IgG-Standardreihen von 1 µg/ml bis 0,2 ng/ml angelegt.
Ergebnis:
Eine geometrische 1:2 Verdünnungsreihe mit IgG-Konzentrationen von 12,5 ng/ml bis 0,2 ng/ml wurde zur Kalibration des ELISA-Systems verwendet (gute Linearität der Regressionsgeraden).
d) Bestimmung unspezifischer Hintergrundreaktionen
Hierfür wurde eine MTP von Reihe A bis H abwechselnd mit Bicarbonatpuffer (50 mmol/l) ohne Fängerantikörper bzw. mit reinem TBST (jeweils 100 µl pro Kavität) beschickt und anschließend entsprechend dem unter 3.2.2.2.2 dargestellten Procedere zur Herstellung der Testplatten (Inkubation über Nacht u.s.w.) behandelt. Anschließend wurde diese MTP parallel zu einer „normal“ mit Fängerantikörpern beschichteten MTP für die Untersuchung von Probenmaterial herangezogen (s. 3.2.2.2.3).
Ergebnis:
Es zeigte sich, dass die in den einzelnen Kavitäten dieser MTP festgestellten optischen Dichten mit 0,07 ± 0,01 OD auf niedrigerem Niveau als die der Leerwertspalte 2 (s. Tab.
11) der „normalen“ MTP lagen.
e) Überprüfung der Messbarkeit von Blutserum bzw. Kolostrumproben
Inwieweit die Untersuchung des Probenmaterials mit dem hier beschriebenen Assay überhaupt zu auswertbaren Daten führt, wurde stellvertretend für das gesamte Probenmaterial der Einpunktmessung an den jeweiligen Blutserum- bzw. Kolostrumproben aller fünf Untersuchungszeitpunkte (Blutserumproben n=15, Kolostrumproben n=75) von sechs, fünf bzw. vier Stuten pro Untersuchungsgruppe (Gruppe I: 1. Abfohlung, Gruppe II: 3. Abfohlung, Gruppe III: 4. und > 4. Abfohlung) kontrolliert. Als Grundlage dieser Überprüfung wurden die Ergebnissen der Messung im Einpunkt- bzw. im Titrationsverfahren auf einer Mikrotiterplatte herangezogen (s. 3.2.2.2.1 f) u. Tab. 9).
Dabei wurden die um den Leerwert korrigierten und logarithmierten OD-Werte des IgG-Standards und der Proben der jeweiligen Verdünnungsstufen graphisch in Beziehung gesetzt (s. exemplarisch Abb. 6, LEIBOLD 2005).
Ergebnis:
In Abb. 6 und Abb. 7a, b, c, d ist zu erkennen, dass sich die logarithmierten OD-Werte sowohl des Standards als auch der jeweiligen Probe nahezu linear verhalten. Weiterhin zeigt die Parallelität der beiden Geraden, dass im hier etablierten ELISA-System mit Hilfe des verwendeten Detektionsantikörpers Immunglobuline der Klasse G sowohl im Standard als auch in der Probe vergleichbar bestimmt werden können. Ein geringer IgG-Gehalt der Proben (z.B. Abnahme des Gehaltes im zeitlichen Verlauf p.p.) im Vergleich zum IgG-Standard zeigt sich in der graphischen Darstellung in Abb. 7a, b, c, d durch die parallele Verschiebung der Geraden nach links unten. Für niedrige IgG-Werte bzw. hohen Verdünnungsstufen können sich OD-Werte ergeben, die kleiner bzw. gleich dem Mittelwert des Leerwertes sind. Da sich rechnerisch aus Null oder negativen Zahlen kein Logarithmus bilden lässt, müssen OD-Werte von Proben über dem OD-Wert des Mittelwert des Leerwertes liegen. Allgemein bildet der dreifache Mittelwert des Leerwertes die Nachweisgrenze des Testsystems.
1,0 log Leerwert korrigierte OD-Werte
IgG-Standard Stutenserum von Stute aus Gruppe I
Abb. 6: Darstellung von Linearität und Parallelität der logarithmierten OD-Werte in den jeweiligen Verdünnungsstufen des IgG-Standards und eines Stutenblutserums (Stute der Gruppe I) log Leerwert koorigierte OD-Werte
IgG-Standard Kolostrum 0 h p.p.
1,0
IgG-Standard Kolostrum 3 h p.p.
Abb. 7a Abb. 7b
1,0 log Leerwert korrigierter OD-Wert
IgG-Standard Kolostrum 6 h p.p.
1,0 log Leerwert korrigierter OD-Wert
IgG-Standard Kolostrum 12 h p. p.
Abb. 7c Abb. 7d
Abb. 7a, b, c, d: Darstellung von Linearität und Parallelität der logarithmierten OD-Werte in den jeweiligen Verdünnungsstufen des IgG-Standards und der Kolostrumproben einer Stute (Stutengruppe II) für vier Melkzeiten (0 h, 3 h, 6 h, 12 h p.p.)
f) Untersuchung von Blutserum- bzw. Kolostrumproben auf der Basis von Ver- dünnungsreihen (Titration) im Vergleich zu Einpunktmessungen im Duplikat
Aufgrund des umfangreichen Probenmaterials dieser Arbeit sollten die IgG-Konzentrationsbestimmungen im ELISA-System aus ökonomischen Gründen als Einpunktmessungen durchgeführt werden. Zur Überprüfung der Zuverlässigkeit von Einpunktmessergebnissen war es daher erforderlich, einen Teil der Proben (Blutserumproben n=15, Kolostrumproben n=75) im Titrationsverfahren zu untersuchen.
Auf diese Art und Weise sollte ein Korrekturfaktor zwischen den beiden Methoden (Einpunktmessung u. Titrationsverfahren) ermittelt werden. Dieser Faktor dient dann dazu, die mit Hilfe der Einpunktmessung erhaltenen IgG-Konzentrationen zu korrigieren. Hierbei wurde entsprechend zur Durchführung des IgG-ELISA als Einpunktmessung im Duplikat (s. 3.2.2.2.3) in der Spalte eins einer mit Antikörpern beschichteten MTP eine geometrische 1:2 Verdünnungsreihe des IgG-Standards mit TBST angelegt (Anfangs-IgG-Konzentration 12,5 ng/ml). Diese diente bei der Auswertung der ELISA-Ergebnisse als Referenzstandard für die lineare Regressionsanalyse. In den übrigen elf Spalten wurden insgesamt elf Proben sowohl als Einpunktmessung im Duplikat (A 2 u. B 2, A 3 u. B 3, A 4
untersucht (s. Tab. 9). Dafür wurden je 100 µl der verdünnten Probe (Blutseren 1:1.000.000 u. Kolostrumproben 1:5.000.000) beispielsweise die Probe 1 in Kavität A 2 u.
B 2 überführt und von dieser Verdünnungsstufe ausgehend eine geometrische 1:2 Verdünnungsreihe mit TBST bis G 2 angelegt. Die Reihe H wurde zur Leerwertbestimmung nur mit TBST beschickt.
Tab. 9: Mikrotiterplattenbelegung des IgG-ELISA bei gleichzeitiger Einpunktmessung im Duplikat und Titration der Probe
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
St. = IgG-Standard, I-VII = geometrische 1:2 Verdünnungsstufe I-VII (IgG ab12,5 ng/ml, Blutserum ab 1:106, Kolostrum ab 1:5x106)
Ergebnis:
Zur Korrektur der mittels Einpunktmessung festgestellten IgG-Konzentrationen wird ein binomisches Gleichungssystem verwendet, um damit sowohl die größeren Unterschiede in hohen IgG-Konzentrationsbereichen als auch die kleineren Unterschiede bei niedrigen IgG-Konzentrationen angemessener zu berücksichtigen.
In der folgenden Tab. 10 werden die Ergebnisse beider IgG-Bestimmungsmethoden in Form der Mittelwerte und der Standardabweichungen sowie die binomische Gleichung zur Umrechnung der Einpunktmessergebnisse vergleichend dargestellt.
Tab. 10: Arithmetische Mittelwerte ([a), Standardabweichungen (SD), binomische Gleichungen und Korrelationskoeffizienten (r) zwischen Ergebnissen der
Einpunktmessung und dem Titrationsverfahren für Blutserum- und Kolostrumproben
Proben-material
Einpunktmessung [mg/ml]
Titrationsverfahren
[mg/ml] Binomische Gleichung [a = 15,18 [a =23,33 y=0,0198 x2 + 1,352 x – 2,7154
Aufgrund dieser Vorversuche sind für das Blutserum bzw. das Kolostrum mittlere
prozentuale Abweichungen (Einpunktmessung/Titration) von 23,3% bzw. 8,31% errechnet worden. Für die Korrektur der Einpunktmessergebnisse sind die in der Tab. 10
aufgeführten Gleichungssysteme verwendet worden, wobei für x-Variablen die Ergebnisse der Einpunktmessung eingesetzt wurden.
3.2.2.2.2 Herstellung der IgG-ELISA-Testplatten
Die zur Beschichtung der Testplatten erforderlichen Fängerantikörper wurden mit Bicarbonatpuffer (50 mmol/l) auf eine Endkonzentration von 1 µg/ml eingestellt. 100 µl dieser Lösung wurden in die einzelnen Kavitäten der zu beschichtenden MTP gegeben und die gesamte Plattencharge bei 4° C über Nacht inkubiert. Anschließend wurden die Testplatten mittels ELISA-Washer dreimal mit je 200 µl TBST gewaschen. Nach Ausklopfen der Restfeuchtigkeit aus den Platten wurden diese mit der Öffnung nach unten zeigend eine Stunde bei Raumtemperatur (ca. 20° C) getrocknet. Danach erfolgte die Lagerung der gesamten Charge bei -20° C.
3.2.2.2.3 Durchführung des IgG-ELISA bei Einpunktmessung im Duplikat
In Spalte eins einer mit Antikörpern beschichteten MTP wurde vom verwendeten IgG-Standard (Anfangs-IgG-Konzentration 12,5 ng/ml) eine geometrische 1:2
Regressionsanalyse darstellte. In die Kavitäten der Spalte zwei wurden Leerwerte in Form von TBST gegeben. In die verbleibenden Kavitäten der MTP wurden die mit TBST verdünnten Proben (Blutseren 1:1.000.000 u. Kolostrumproben 1:5.000.000) jeweils im Duplikat überführt (A 3 u. A 4, B 3 u. B 4, C 3 u. C 4 u.s.w., s. Tab. 11).
Diese so präparierte MTP wurde 60 Minuten bei Raumtemperatur (ca. 20° C) auf einem Schüttelrotator inkubiert und einem dreimaligen Waschvorgang mit je 200 µl TBST mittels ELISA-Washer unterzogen. Nach dem Ausklopfen der Restfeuchtigkeit wurde jede Kavität mit 1:15.000 TBST verdünntem Konjugat versetzt und für weitere 60 Minuten bei gleicher Temperatur auf dem Schüttelrotator aufbewahrt. Hierauf folgten erneut ein dreimaliger Waschvorgang mit dem ELISA-Washer und das Ausklopfen der Restfeuchtigkeit.
Ebenfalls bei Raumtemperatur (ca. 20° C) wurde anschließend allen Kavitäten je 100 µl des für die Peroxidasereaktion erforderlichen Substrates TMB zugesetzt. Nach 10 Minuten wurde diese Nachweisreaktion mit 0,5 M- Schwefelsäure gestoppt. Die Messung der optischen Dichte (Extinktionswerte) erfolgte mit einem ELISA-Reader bei einer Wellenlänge von 450 nm.
Tab. 11: Mikrotiterplattenbelegung des IgG-ELISA bei Einpunktmessung im Duplikat