Die chemisch-physikalischen Untersuchungen wurden im Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit, Fachgebiet Milchhygiene, der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt.
3.2.4.1 Dichtebestimmung mittels Wägung
Ziel war es, die im Gestütslabor mittels Aräometer festgestellten Dichtewerte unter einheit-lichen Laborbedingungen mit Hilfe von Wägungen (d = Masse/Volumen) zu überprüfen.
Die Bestimmung der Masse erfolgte mit einem Flüssigkeitsvolumen von jeweils 1000 µl auf einer Analysewaage (Sartorius Analytic A200S, Fa. Sartorius AG, Göttingen) mit einer Wägegenauigkeit bis 0,1 mg.
Durchführung der Wägung des Kolostrums
Die bei –20° C gelagerten Proben wurden im Wasserbad bei 35° C aufgetaut und zur Temperaturadaption bei Raumtemperatur (ca. 20° C) 1 bis 2 Stunden stehen gelassen.
Nach vorsichtigem Schütteln wurden je 1000 µl Kolostrum der Entnahmezeitpunkte 0, 6 und 12 Stunden p.p. mittels einer Pipette (eppendorf Reference 1000 µl-Pipette®, Fa.
Eppendorf, Hamburg) in eine Kunststoffküvette mit einem Volumen von 3,5 ml überführt und die Nettomasse bestimmt. Dieser Vorgang erfolgte bei jeder Probe dreimal, der Mittelwert dieser drei Messergebnisse diente als Grundlage für die Dichteberechnungen.
Zur Überprüfung der Präzision des Verfahrens fand nach jeder zehnten Messung die Wägung einer Poolprobe statt.
Präzisionskontrolle
Zur Feststellung der Präzision der Dichtemessungen wurde eine Mischung aus der aufgetauten Milch dreier Stuten (Minimierung tierindividueller Einflüsse) vom jeweiligen Entnahmezeitpunkt gepoolt und jeweils 35 Messungen durchgeführt. Die Präzision wurde als Variationskoeffizient aus dem Mittelwert und der Standardabweichung berechnet (Tab.
12).
Tab. 12: Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten für die durch Wägung ermittelten Dichten von Stutenmischmilchen für drei Zeitpunkte p.p.
Mischmilch n Mittelwert [g/ml] SD [g/ml] VK [%]
1 (0 h p.p.) 35 1,081 0,00734 0,68
2 (6 h p.p.) 35 1,049 0,00382 0,36
3 (12 h p.p.) 35 1,033 0,00311 0,30
n = Anzahl der Messungen, SD = Standardabweichung, VK = Variationskoeffizient
3.2.4.2 Bestimmung der NAGase-Aktivität
Das zur Messung der NAGase-Aktivität angewendete Verfahren wurde von KITCHEN (1978) entwickelt und von verschiedenen Anwendern (Literaturübersicht: SCHÜTTEL 1999) auf Basis von Mikrotiterplatten mit einer fluoreszenzoptischen Detektion optimiert.
Das Enzym NAGase hydrolysiert das nicht fluoreszierende Substrat Methylumbelliferyl-N-acetyl-ß-D-glucosaminidin zu N-Acetylglucosamin und dem fluoreszierenden 4-Methylumbelliferon. Letzteres dient als Messgröße und wird fluoreszenzspektroskopisch als optische Dichte detektiert.
Reagenzien und Geräte
• Citratpuffer pH 4,6 (Rezept s. Anhang)
• Substratlösung (Rezept s. Anhang)
• Stopppuffer pH 10,8 (Rezept s. Anhang)
• Blindwert: Die zur Kalibrierung der Methode benötigte Stutenmilch (Poolprobe) wurde für 20 min bei 65° C erhitzt und als Blindwert eingesetzt.
• Standardreihe: sechs Mischungen von 4-Methylumbelliferon (Fa. Fluka, Buchs SG, Schweiz) in erhitzter Stutenmilch zur Erstellung einer Standardgeraden
• Vario- ,Fix- und Mehrkanal-Mikrotiterpipetten (Fa. Eppendorf, Hamburg)
• schwarze 96-Well-Rundbodenmikrotiterplatte (Fa. Merlin Diagnostika, Bornheim)
• Analysegerät Fluoroskan II (Fa. LABSYSTEMS, Helsinki, Finnland)
• Software SeroCalc Version 4 (Fa. DEMOS Computer GmbH, Köln)
Durchführung der Bestimmung der NAGase-Aktivität
Die bei –20° C gelagerten Blut- und Kolostrumproben wurden auf Raumtemperatur (ca.
20° C) erwärmt und umgehend analysiert.
Um im auswertbaren Messbereich des Analysegerätes zu bleiben, mussten die Kolostrumproben mit 0,9% Natrium-Chlorid-Lösung im Verhältnis 1:5 verdünnt werden, wohingegen die Blutserumproben unverdünnt eingesetzt werden konnten (HANS 2000).
Jeweils 10 µl von Blind-, Standardwerten und Kolostralmilchproben wurden in die Kavitäten schwarzer 96-Well-Rundbodenmikrotiterplatten überführt. Anschließend wurden mit Hilfe einer Mehrkanalpipette 50 µl Substratlösung hinzu gegeben, die Platte 10 Sekunden bei 500 RPM geschüttelt und für exakt 15 Minuten bei 37° C im Brutschrank inkubiert.
Durch Zugabe von jeweils 100 µl Stopppuffer mittels Mehrkanalpipette wurde die enzymatische Reaktion beendet. Die Platte wurde erneut für 10 Sekunden bei 500 RPM geschüttelt und die optische Dichte nach Anregung bei λ = 355 nm (Excitation) und Messung bei λ = 460 nm (Emission) ermittelt. Diese Messergebnisse wurden mit der Computersoftware SeroCalc Version 4 unter Berücksichtigung der Standardreihe, der Blindwerte, der Inkubationszeit von 15 Minuten sowie dem Verdünnungsfaktor in das Aktivitätskonzentrationsmaß nmol min-1 ml-1 umgerechnet und so für die Auswertung verwendet (BERGMEYER 1977).
Präzisionskontrollen
Zur Prüfung der Präzision der Methode wurde für jeden der fünf Probenentnahmezeitpunkte eine Mischmilch (aufgetautes Material) von jeweils drei Stuten (Minimierung tierindividueller Einflüsse) hergestellt und diese dann 23mal (Messzeitpunkt 0 h p.p.) bzw. 24mal (Messzeitpunkte 1,5, 3, 6, 12 h p.p.) untersucht (Tab. 13).
Tab. 13: Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten für die NAGase-Aktivitäts-Bestimmung in Stutenmischmilchen für fünf Zeitpunkte p.p.
Mischmilch
n = Anzahl der Messungen, SD = Standardabweichung, VK = Variationskoeffizient
3.2.4.3 Chloridbestimmung
Für die coulometrische Bestimmung der Chloridkonzentration wurde der Chloride Analyser 925® (Fa. Chiron Diagnostics Corporation, Californien, USA) verwendet. Bei dieser Elektroanalyse bedient man sich des Faradayschen Gesetzes, nachdem gleiche Strommengen stets äquivalente Mengen von chemischen Substanzen an Elektroden abscheiden (GIESE 1997). Die in der Probe enthaltenen Chloridionen bilden mit den freigesetzten Silberionen einer geräteeigenen Silberelektrode unlösliches Silberchlorid.
Für die Freisetzung der Silberionen ist die Bereitstellung einer gewissen Elektrizitätsmenge erforderlich. Die Bildung der Silberionen wird gestoppt, sobald die Leitfähigkeit der Untersuchungslösung aufgrund freier Silberionen (keine Chloridionen in Lösung) verändert wird. Nach den Faradayschen Gesetzen besteht zwischen der jeweils verbrauchten Elektrizitätsmenge und dem stattgefundenen Stoffumsatz ein proportionales Verhältnis. Da der Stoffumsatz wiederum von der Konzentration an Chloridionen bestimmt wird, kann diese über die benötigte Strommenge berechnet werden (NOGAI et al. 1997).
Durchführung der Chloridbestimmung
Mit einer Fixpipette (Fa. Eppendorf, Hamburg) wurden 100 µl der jeweiligen Probe zügig in ein mit essigsaurer Pufferlösung (kombinierter Säurepuffer, Fa. Bayer, Leverkusen) gefülltes Becherglas pipettiert. In dieses Becherglas waren neben einem Rührer zwei Messelektrodenpaare zur Abscheidung von Silberionen (Opferanode) sowie zur Messung der Leitfähigkeit eingetaucht. Ca. eine Minute nach Starten des automatischen
Messvorganges wurde im Display des Gerätes das Ergebnis in mmol Cl-/l angezeigt. Um grobe Pipettierfehler auszuschließen, wurden Doppelbestimmungen durchgeführt. Der Mittelwert dieser Doppelbestimmung fand Eingang in die späteren Berechnungen. Nach jeder zehnten Milchprobe erfolgte eine Doppelmessung mit einer standardisierten Chloridlösung (Chloride Meter Standard 100 mmol/l Cl-, Fa. Bayer, Leverkusen) und mit einer gepoolten Milchprobe, um Richtigkeit und Präzision der Messergebnisse zu überprüfen.
Präzisionskontrolle
Zur Kontrolle der Präzision der Methode wurden für die drei Probenentnahmezeitpunkte null, sechs, und zwölf Stunden p.p. aus drei Milchproben (Minimierung tierindividueller Einflüsse) Mischungen hergestellt und diese jeweils 30mal auf ihren Chloridgehalt hin untersucht. Aus den errechneten Standardabweichungen und Mittelwerten ergab sich dann für die Kolostrumproben ein mittlerer Variationkoeffizient von 1,3% (Tab. 14).
Tab. 14: Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten für die Chloridbestimmung in Stutenmischmilchen für drei Zeitpunkte p.p.
Mischmilch n Mittelwert [mmol/l] SD [mmol/l] VK [%]
1 (0 h p.p.) 30 32,98 0,65 1,98
2 (6 h p.p.) 30 43,15 0,39 0,91
3 (12 h p.p.) 30 27,23 0,31 1,14
n = Anzahl der Messungen, SD = Standardabweichung, VK = Variationskoeffizient