Gehalt somatischer Zellen, NAGase-Aktivität und Chloridgehalt Gehalt somatischer Zellen

Die Zahl somatischer Zellen in Milch wird zum einen durch den Funktions- und zum anderen durch den Gesundheitszustand des Euters bestimmt und lässt somit Rückschlüsse auf physiologische Permeabilitätsveränderungen und/oder entzündliche Erkrankungen dieses Organes zu.

Die Mittelwerte der in dieser Arbeit festgestellten Gehalte im Stutenkolostrum liegen in vergleichbaren Größenordnungen zu den Angaben der aufgeführten Autoren (Tab. 35) und weit über dem Normalniveau von reifer Stutenmilch (RIELAND 1997, HANS 2000). Da nur eutergesunde Stuten untersucht wurden, sind die festgestellten Gehalte als physiologisch einzuschätzen und werden wahrscheinlich, wie bei anderen Säugetieren auch, durch das peripartale Euterödem verursacht.

Tab. 35: Mittelwerte somatischer Zellen [SCC/ml] im Kolostrum von Stuten

AUTOR ZELLEN / ml

BLÖMER (1990) 468.000 RIELAND(1997) 378.000 HANS (2000) 77.000

MARKUS (2005) 676.000 (0 h p.p.), 402.000 (6 h p.p.), 150.000 (12 h p.p.)

BLÖMER (1990), RIELAND (1997) und Hans (2000) weisen auf eine kontinuierliche Abnahme der somatischen Zellen im equinen Eutersekret über einen Zeitraum von mehreren Tagen hin. In der vorliegenden Arbeit kann jedoch gezeigt werden, dass der mittlere Gehalt somatischer Zellen im Stutenkolostrum von 676.000 Zellen unmittelbar p.p.

bereits in den ersten zwölf Laktationsstunden um ca. 70% bis 80% abfällt. Dies dokumentiert, dass analog den Verhältnissen beim Rind (GRABOWSKI 2002) auch in der Kolostralmilch des Pferdes physiologisch erhöhte Gehalte an zellulären Elementen vorkommen. Primipare Stuten weisen dabei einen geringeren mittleren Gehalt an somatischen Zellen als multipare Tiere auf.

Da sich diese Untersuchungen auf eine klinisch eutergesunde Stutenpopulation erstreckten, könnten die Daten auch für die Aufstellung eines Kategorisierungsschlüssels zur Beurteilung der frühpostpartalen Eutergesundheit, wie dieser für das Rind bereits besteht (DVG 2002), von Interesse sein. Voraussetzung hierfür ist eine Differenzierung der im Kolostrum enthaltenen somatischen Zellen in Makrophagen, Lymphozyten, polymorphkernige Leukozyten und Epithelzellen (GRABOWSKI 2002).

Die Grenzwerte für Stutenmilch als Konsummilch werden durch die §§ 7 und 8 der Milchverordnung geregelt (Verordnung über Hygiene- und Qualitätsanforderungen an Milch und Erzeugnisse auf Milchbasis, Neufassung vom 20.07.2000). Entsprechend der Milch von Kühen darf Stutenmilch ebenfalls erst nach einer Frist von fünf Tagen p.p. in den Verkehr gebracht werden (§ 18 Milchverordnung). Die vorliegenden Ergebnisse bestätigen prinzipiell die Angaben von DOREAU und BOULOT (1989) sowie BÜHLBÄCKER (1996), nach der die Kolostralperiode der Stute deutlich kürzer als die der Kuh ist. Deshalb sollte aus ökonomischen Aspekten darüber nachgedacht werden, ob die Milch der Stute nach einem kürzeren Zeitraum p.p. in Verkehr gebracht werden könnte.

Hierbei stellt sich natürlich die Frage, welche zyto-bakteriologische Beschaffenheit in der Anlieferungsmilch von Stuten akzeptiert werden kann, um deren gesundheitliche Unbedenklichkeit für den Verbraucher zu gewährleisten.

NAGase-Aktivität

Das lysosomale Enzym N-Acetyl-β-D-glucosaminidase (NAGase) zählt zu den humoralen Faktoren des unspezifischen Abwehrsystems und wird labordiagnostisch als Entzündungsindikator ausgewertet, wobei ein Anstieg sowohl aus Sekretionszellen als auch aus Abwehrzellen erfolgen kann (KITCHEN et al., 1980). In dieser Arbeit weist der Parameter NAGase-Aktivitäten eine extrem hohe Laktationsabhängigkeit auf und es werden im Kolostrum der ersten zwölf Stunden p.p. mittlere Werte von 164 bis 24 nmol min^-1 ml^-1 nachgewiesen (Tab. 31). Die entsprechenden Blutserumwerte betragen für den Zeitpunkt unmittelbar p.p. im Mittel lediglich ca. 2,6 nmol min^-1 ml^-1. Für NAGase-Aktivitäten im Stutenkolostrum werden vergleichbare Werte (49,5 nmol min^-1 ml^-1) von HANS (2000) angegeben. Da bei dieser Autorin jedoch die Probengewinnung nicht

unmittelbar p.p. erfolgte, wurden Extremwerte, wie sie in dieser Arbeit gefunden wurden (>

300 nmol min^-1 ml^-1), nicht gemessen. Allerdings werden dafür Werte bis zum 56. Tag p.p.

angegeben.

Die Enzym-Aktivitäten sind im Kolostrum primiparer Stuten grundsätzlich höher als in dem der multiparen. Inwieweit diese Unterschiede auf Erstmanipulationen am Euter und damit einhergehende Zerstörungen von Geweben und Abwehrzellen zurückzuführen sind (KITCHEN et al. 1980, BERNING et al. 1987), bleibt offen.

Die im Blutserum festgestellten mittleren NAGase-Aktivitäten von ca. 2,6 nmol min^-1 ml^-1 liegen höher als die von ABDALLA et al. (1993) und HANS (2000) angegebenen mittleren Aktivitäten von 1,0 bzw. 0,9 nmol min^-1 ml^-1. Letztere untersuchte allerdings ein größeres Zeitfenster von Tag eins bis Tag zehn p.p.. MELLORS (1968) und NAGAHATA et al.

(1987) geben als einen Herkunftsort der NAGase die polymorphkernigen Granulozyten des Blutes an, weshalb die hier festgestellten hohen Enzym-Aktivitäten möglicherweise einen Hinweis auf einen durch den Geburtsvorgang erhöhten Stoffwechsel der polymorphkernigen Granulozyten darstellen.

Die hohen NAGase-Aktivitäten im Stutenkolostrum lassen sich im Vergleich zu denen im Kolostrum von Kühen (ca. 6 nmol min^-1 ml^-1, GRABOWSKI 2000) nur dahingehend interpretieren, dass die NAGase-Freisetzung im Kolostrum des Pferdes generell auf höherem Niveau als bei Kühen abläuft. Ein vergleichbares Phänomen zeigt sich auch beim Parameter Lysozym, der bei Stuten um mehr als Faktor 100 höher liegt als bei Kühen (HANS 2000). Ebenso schwierig zu bewerten ist die deutlich geringere Aktivität von NAGase im equinen Blutserum in Relation zu Kühen (ca. 10,9 nmol min^-1 ml^-1, SCHÜTTEL 1999). Eine weitere Differenzierung der NAGase-Befunde hinsichtlich ihrer Funktion als Entzündungsindikator beim Pferd ist hier nicht möglich, da die Untersuchungen ausschließlich an klinisch eutergesunden Stuten erfolgte und in der angegebenen Literatur keine Vergleichsdaten zur Verfügung stehen. Die erhobenen Daten sollten daher zunächst zur Erstellung physiologischer Referenzwerte für kommende Arbeiten genutzt werden.

Chloridgehalt

Die beim Pferd erstmals durchgeführte Bestimmung des zeitlichen Verlaufs kolostraler Chloridgehalte lässt nach einem anfänglichen Anstieg zum Zeitpunkt drei Stunden p.p.

einen Abfall des mittleren Chloridgehaltes während der ersten zwölf Stunden p.p.

erkennen. Diese Ergebnisse decken sich mit denen von HANS (2000), die einen Abfall des Chloridgehaltes im Kolostrum (Tag der Geburt) mit 25,0 mmol Cl^-/l über die Übergangsmilch (2.-4. Tag p.p.) mit 10,7 mmol Cl^-/l hin zur reifen Stutenmilch (6.-56. Tag p.p.) mit 9,2 mmol Cl^-/l feststellte. Für die Kolostralphase der Stute gibt die Autorin einen mittleren Gehalt von 25,0 mmol Cl^-/l an. Dieser Wert wird in der vorliegenden Arbeit zwischen den Zeitpunkten sechs und zwölf Stunden p.p. festgestellt. Auch SONNTAG (1996) verzeichnete einen Rückgang des Chloridgehaltes im Laktationsverlauf. Weitere Angaben zum Chloridgehalt im Kolostrum von Stuten liegen in der angegebenen Literatur nicht vor.

Im Blutserum variieren die Chloridgehalte der Stuten nur geringfügig (VK=3,02%). Sie liegen mit im Mittel 106,75 mmol Cl^-/l auf dem Niveau der aus der Literatur bekannten Referenzwerte (SCHÄFER 1999).

5.5 Schlussfolgerungen

Bei eutergesunden Stuten darf hinsichtlich der Produktionskapazität und des spezifischen Sekretionsvermögens der Parameter Kolostrumvolumen, IgG-Konzentration, Eiweiß-, Laktose-, Fett- und Harnstoffgehalt, Gehalt somatischer Zellen, NAGase-Aktivität und Chloridgehalt von einer Äquivalenz beider Euterhälften ausgegangen werden.

Ein signifikanter Rückgang der kolostralen IgG-Konzentration kann bereits während der ersten eineinhalb (Gruppe III: 4. oder > 4. Abfohlung) bzw. drei Stunden p.p. (Gruppe I: 1.

Abfohlung, Gruppe II: 3. Abfohlung) verzeichnet werden. Deshalb sollte die Beurteilung der Kolostrumqualität anhand der kolostralen IgG-Konzentration innerhalb dieser ersten Stunden p.p. vorgenommen werden.

In der vorliegenden Studie zeigten die Stuten der Gruppe II die größte Eignung als Kolostrumspenderstuten, da sie neben einem großen Kolostrumvolumen auch die größte IgG-Menge innerhalb der drei ersten Stunden p.p. sezernierten.

Zur Abschätzung der kolostralen IgG-Konzentration sind sowohl die Methode der Refraktometrie als auch die der Kolostrometrie prinzipiell geeignet. Sofern finanziell möglich, empfiehlt sich aufgrund der höheren Zuverlässigkeit und der besseren Praktikabilität der Einsatz eines Refraktometers.

Die signifikante Korrelation zwischen IgG-Konzentration und Eiweißgehalt bzw. zwischen IgG-Konzentration und Laktosegehalt könnte bei der Entwicklung neuer Methoden zur Abschätzung kolostraler IgG-Konzentrationen berücksichtigt werden.

Die Milchinhaltsstoffe Eiweiß-, Laktose-, Fett- und Harnstoffgehalt haben ebenso wie die Entzündungsparameter Chlorid, somatische Zellen und NAGase-Aktivität bereits in der frühpostpartalen Phase einen ausgeprägt laktationsabhängigen Verlauf.

Für die Beurteilung der effektiven Leistung einer Stute sollten aus dem Milchvolumen und den jeweiligen Konzentrationsangaben der Inhaltsstoffe die Gesamtmengen errechnet werden.

6. Zusammenfassung

Markus, Ralf Georg:

Bestimmung der Immunglobulin G-Konzentration mittels Refraktometrie, Kolostrometrie und ELISA-Technik sowie Untersuchung weiterer Inhaltsstoffe im Stutenkolostrum

In den ersten 12 Stunden post partum (p.p.) wurden von 36 Stuten eines Gestütes an fünf Zeitpunkten Hälftengemelkproben (n=360) sowie eine Blutserumprobe (n=36) gewonnen.

Für die Auswertung wurden die Pferde in drei Gruppen eingeteilt (Gruppe I: 1. Abfohlung, drei- und vierjährig; Gruppe II: 3. Abfohlung, fünf- bis siebenjährig; Gruppe III: 4. und > 4.

Abfohlung, mindestens achtjährig). Im nativen Kolostrum wurden der Brechungsindex (Refraktometrie) und die Dichte (Kolostrometrie = Aräometrie) gemessen. Die Konzentration von Immunglobulin G (IgG), die NAGase-Aktivität (N-Acetyl-β-D-glucosaminidase) und der Chloridionengehalt wurden hingegen aus tief gefrorenen Proben und die Hauptinhaltsstoffe Eiweiß, Laktose, Fett, Harnstoff und die somatischen Zellen aus mit Bronopol (2-Bromo-2-nitro-1,3-propandiol) konserviertem und gekühltem Material bestimmt.

• Im Gesamtmaterial wurden zwischen den Werten der Refraktometrie, bzw. denen der Kolostrometrie und den kolostralen IgG-Konzentrationen (ELISA) signifikante Beziehungen berechnet (r=+0,93 bzw. r=+0,88).

Beide Feldmethoden sind prinzipiell zur Abschätzung (Screening) der kolostralen IgG-Konzentration geeignet, wobei gewisse Schwankungsbreiten für die praktische Anwendung und Entscheidung kalkuliert werden sollten. Die Refraktometrie stellt dabei sowohl die zuverlässigere als auch die praktikablere Methode dar, erfordert jedoch im Vergleich zur Kolostrometrie eine deutlich größere finanzielle Investition.

• Primipare Stuten besitzen unmittelbar p.p. im Mittel höhere kolostrale IgG-Konzentrationen als multipare (68 mg/ml bzw. 51 mg/ml), stellen jedoch innerhalb der

drei ersten Stunden p.p. eine geringere Gesamt-IgG-Menge (31,51 g bzw. 48,56 g) bereit.

• Multipare Stuten geben innerhalb der drei ersten Stunden p.p. ein mittleres Kolostrumvolumen von 1020 ml, primipare Stuten hingegen von nur 527 ml.

Für die Beurteilung eines Kolostrums ist nicht allein die IgG-Konzentration, sondern vielmehr die insgesamt verfügbare Antikörpermenge ausschlaggebend. Zum Aufbau einer Kolostrumbank sollten daher möglichst Kolostren von Stuten in der dritten Laktation verwendet werden, da diese die größten Gesamt-IgG-Mengen bereitstellen. Die Berechnung der durch das Fohlen aufgenommenen IgG-Menge ist im Stall aufgrund des nicht bekannten Kolostralvolumens i.d.R. nicht möglich, weshalb zur Erfolgskontrolle des passiven Immunitätstransfers der IgG-Gehalt im Fohlenblut bestimmt werden sollte.

Weiterhin sollten nur solche Stuten als Kolostrumspenderinnen genutzt werden, die ausreichend lange Zeit zur Auseinandersetzung mit stallspezifischen Pathogenen hatten und somit Antikörper geeigneter Spezifitäten bereitstellen können.

• Die Euterhälften gesunder Stuten liefern gleichviel Kolostrumvolumen und gleiche Mengen an Inhaltsstoffen.

• Die kolostralen Inhaltsstoffe weisen einen laktationsabhängigen Verlauf auf (Tab. 36).

Zwischen den drei Paritätsgruppen bestehen für die jeweiligen Inhaltsstoffe zum Teil signifikante Unterschiede.

Tab. 36: Inhaltsstoffe (arithmetische bzw. geometrische¹⁾Mittelwerte) im Kolostrum eutergesunder Stuten differenziert nach Melkzeiten (²⁾ n=35 Stuten ³⁾ n=36 Stuten)

Parameter 0 h p.p. 6 h p.p. 12 h p.p.

Eiweiß [%]²⁾ 14,85 7,47 3,54

Fett [%]²⁾ 1,38 1,38 1,80

Laktose [%]²⁾ 2,86 4,6 5,59

Harnstoff [mg/l]²⁾ 246 330 353

Zellen x 10³ [SCC/ml]^{1, 2)} 565 374 182

NAGase-Aktivität [nmol min^-1 ml^-1]³⁾ 164 72 24

• Zwischen Gesamteiweiß- bzw. Laktosegehalt und IgG-Konzentration bestehen signifikante Korrelationen (r=+0,95 bzw. r=-0,91).

• Der Gehalt an somatischen Zellen und an Chloridionen im Kolostrum ist im Vergleich zur Milch in den nachfolgenden Laktationsabschnitten stark erhöht.

• Im Kolostrum liegt die NAGase-Aktivität ca. 80fach höher als im Blutserum.

Dies lässt den Schluss zu, dass bei Pferden im Vergleich zu Rindern die NAGase überwiegend im Euter gebildet oder hier artspezifisch besonders stark akkumuliert wird.

7. Summary

Markus, Ralf Georg:

Investigation of immunoglobulin G concentration by refractometry, colostrometry and an ELISA-technique and examination of other components in colostrum of mares

Colostrum samples were collected five times within the first 12 h post partum (p.p.) (n=360) of each half of the udder from 36 mares of one stud farm. Additionally blood sample were taken from each mare. The mares were divided into three groups (group I: 1.

parturition, three and four year-old mares; group II: 3. parturition, five to seven year-old mares; group III: 4. and > 4. parturition, older than seven year-old mares). The density (Colostrometry) and the refraction index were measured in the native colostrum immediately after sample collection. The concentration of immunoglobulin G (IgG), the NAGase-activity (N-acetyle-β-D-glucosaminidase) and the concentration of chloride were determined from deep frozen samples. The main colostrum components protein, lactose, fat, urea as well as the somatic cells were measured from refrigerated bronopol (2-Bromo-2-nitro-1,3-propandiol) -preserved material.

• A significant correlation was determined between the refraction index and the colostral concentration (r=+0,93), and between the density and the colostral IgG-concentration (r=+0,88).

Both field-methods were considered suitable for determining the colostral IgG-concentration. The refractometry is the more reliable and practicable technique. However it is also more expensive one.

• Primiparous mares have a greater mean concentration of IgG than multiparous mares do (68 mg/ml and 51 mg/ml, respectively). Within the first three hours however, primiparous mares have a significantly lower concentration of IgG (31,51 g and 48,56

• Multiparous mares have a mean colostral volume of 1020 ml and, in primiparous mares, a mean volume of 527 ml was determined within the first three hours p.p..

The IgG-concentration is not the only parameter to assess the quality of the colostrum.

The total amount of IgG is the more specific value to assess the colostrum quality. The greatest concentration of IgG was found in mares of the third parturition. These mares also produce great volumes of colostrum. Consequently colostrum banking should be performed with horses of this group. The appropriate antibodies will only be produced by the mare and available to the foal if she is kept on the place of birth of the foal in the weeks before parturition.

• There was no difference in the colostral volume and in the ingredients between the two halves of the udder in healthy mares.

• The main colostral components depend on the stage of lactation (Tab. 37). There are significant differences between the different groups of mares regarding these components.

Tab. 37: Components (arithmetic and geometric¹⁾means) in the total colostrum of the healthy mares collected at different times p.p. (²⁾ n=35 mares ³⁾ n=36 mares)

Parameter 0 h p.p. 6 h p.p. 12 h p.p.

Protein [%]²⁾ 14,85 7,47 3,54

Fat [%]²⁾ 1,38 1,38 1,8

Lactose [%]²⁾ 2,86 4,6 5,59

Urea [mg/l]²⁾ 246 330 353

Cells x 10³ [SCC/ml]^{1, 2)} 565 374 182

NAGase-activity [nmol min^-1 ml^-1]³⁾ 164 72 24

Chloride [mmol/l]³⁾ 33,5 30,7 22,0

• There is a significant correlation between the concentration of total protein and IgG (r=+0,95), and between the concentration of lactose and IgG (r=-0,91).

• The somatic cell count and the concentration of chloride are remarkably increased in colostrums compared to milk.

• NAGase-activity in colostrum is 80 times higher than it is in serum.

This might be due to the fact that in horses, in comparison to cattles, the production of NAGase takes place mainly in the udder or species specifically accumulates in this organ.

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Pareys Studientexte 11, Blackwell Wissenschafts-Verlag Berlin, 18-49, 63

Pareys Studientexte 11, Blackwell Wissenschafts-Verlag Berlin, 18-49, 63

Im Dokument Bestimmung der Immunglobulin G-Konzentration mittels Refraktometrie, Kolostrometrie und ELISA-Technik sowie Untersuchung weiterer Inhaltsstoffe im Stutenkolostrum (Seite 121-152)