Spezifische IgG-Bestimmungsmethoden

Diese Methoden basieren auf einer Antigen-Antikörperreaktion, bei der gegen IgG gerichtete Antikörper eine Bindung mit dem als Antigen fungierenden IgG eingehen. Die Intensität dieser spezifischen Antigen-Antikörperreaktion kann durch labortechnische Hilfsmittel detektiert werden.

Für die Analyse von IgG in Blutserum und Kolostrum von Pferden wurden der Radiale Immuno-Diffusions-Test (ROUSE und INGRAM 1970), der Latexagglutinationstest

(COWLES et al. 1983) und der Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (LUFT 2000) angewendet.

Radialer Immuno-Diffusions-Test (RIDT)

Der von ROUSE und INGRAM (1970) zur Bestimmung von IgG in equinen Serum- und Kolostrumproben entwickelte Test wurde aufgrund seiner großen Genauigkeit in zahlreichen Studien als Referenzmethode eingesetzt (EISENHAUER 1981, LEBLANC et al. 1986 u. 1992, KOHN et al. 1989, LAVOIE et al. 1989, WAELCHLI et al. 1990, MASSEY et al. 1991, WARKO und BOSTEDT 1993, DASCANIO et al. 1995, CHAVATTE et al.

1998). Von WILKINS und DEWAN-MIX (1993) wurde der RIDT als „gold standard“ zur Bestimmung von equinem IgG bezeichnet. Bei diesem Verfahren wird nach MANCINI et al. (1965) zunächst eine Agarplatte mit einer definierten Menge gegen equines IgG gerichteter Antikörper präpariert. In diesen Agar werden Löcher gestanzt, in die die zu untersuchenden Serumproben überführt werden. Binnen 18 bis 24 Stunden (KÄHN 1991b) bilden sich radial der Stanzlöcher aus Antigen-Antikörper-Komplexen bestehende erkennbare Präzipitathöfe. Über den Vergleich der Präzipitatdurchmesser mit denen einer mitgeführten Standardreihe kann eine Quantifizierung des IgG-Gehaltes der Probe erfolgen. Nachteile dieser Labormethode sind die sehr langen Reaktionszeiten, die Empfindlichkeit gegenüber Temperaturschwankungen und der relativ geringe Probendurchsatz. Nach KÄHN (1991b) erlaubt das Funktionsprinzip des RIDT die Durchführung sehr genauer Messungen. Allerdings können die festgestellten Werte insbesondere bei der Verwendung verschiedener kommerzieller Testkits zum Teil erheblich variieren. Hieraus resultieren Schwierigkeiten beim quantitativen Vergleich von Ergebnissen verschiedener Publikationen.

Latexagglutinationstest (LAT)

Beim LAT-Verfahren bilden gegen equines IgG gerichtete und an Polystyrene (Latex)-Partikel gebundene Antikörper Komplexe mit dem in der Probe enthaltenen IgG. Die Zeit bis zum Ausfällen dieser Komplexe dient als Größe zur Beurteilung des IgG-Gehaltes in der Probe. Es handelt sich um einen Feldtest für die „Stallgasse“, dessen Ergebnis bereits

Zuverlässigkeit dieser Methode zur Bestimmung von equinem IgG wurde erstmals von COWLES et al. (1983) untersucht und nachgewiesen. Nach GERHARDS (1986) soll durch die Mituntersuchung von Standardseren auch ein quantitatives Ergebnis möglich sein.

Prinzipiell ist der LAT jedoch als semiquantitativer Schnelltest konzipiert, dessen Ergebnis lediglich eine grobe Einschätzung der vorliegenden IgG-Verhältnisse gestattet. Neben der Untersuchung von Blut und Serum ist nach einigen Modifikationen auch die Bestimmung von IgG im Kolostrum möglich (THEIN 1989).

WAELCHLI et al. (1990) nennt als Hauptkritikpunkte des LAT die relativ hohen Kosten bei der Untersuchung größerer Probenumfänge, sowie die subjektive Einschätzung des jeweiligen Untersuchers beim Ablesen der Ergebnisse.

Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)

Erst in den letzten Jahren wurde mit der Entwicklung von ELISA-Systemen moderne Diagnostika zur Evaluierung von IgG-Konzentrationen in Blutserum- und Kolostrumproben von Tieren entwickelt. So etablierten STENGEL (1998) und AMON (1999) entsprechende ELISA-Systeme für die Untersuchung des IgG-Gehaltes in Proben boviner Herkunft. Für eine quantitative Analyse von IgG im Blutserum und im Kolostrum von Pferden wurde wenig später ein Verfahren von LUFT (2000) vorgestellt. Hingegen kann ein semiquantitativer IgG-Schnelltest auf ELISA-Basis (SNAP^® Foal IgG Test, Fa. Idexx GmbH,Wörrstadt), der für die Anwendung in Serum-, Plasma- oder Vollblut konzipiert ist, bereits seit einigen Jahren kommerziell erworben werden.

Mittlerweile wird die exakte quantitative Bestimmung von equinem IgG in Blutserum- und Kolostrumproben mittels ELISA-Technologie auch als labordiagnostische Dienstleistung angeboten (Fa. Biocheck Labor für Veterinärdiagnostik u. Umwelthygiene GmbH, Leipzig).

Bei der ELISA-Labormethode zur Bestimmung von equinem IgG findet das folgende Funktionsprinzip Anwendung. Zunächst wird die Oberfläche einer Mikrotiterplatte (MTP) mit gegen equines IgG gerichteten Antikörpern in einer bestimmten Konzentration als Fänger-Antikörper beschichtet. Das Probenmaterial wird dann zu den immobilisierten Fänger-Antikörpern in die MTP gegeben, so dass es zur Bildung von Antigen-Antikörper-Komplexen kommt. Anschließend werden enzymmarkierte Sekundärantikörper, die ebenfalls gegen equines IgG gerichtet sind, aufgetragen. Nach dem Abwaschen nicht

gebundener Sekundärantikörper wird ein zunächst farbloses spezifisches Substrat dazugegeben, das durch eine enzymatische Reaktion in ein farbiges Produkt umgesetzt wird. Die entstandene Färbung kann daraufhin photometrisch als Extinktion gemessen werden. Durch den Vergleich der Ergebnisse mit denen einer mitgeführten Standardreihe erfolgt die Berechnung der IgG-Konzentration von Kolostrum- bzw. Blutserumprobe.

Die im Folgenden dargestellten Vorteile des ELISA-Testsystems sollen dessen Eignung für den Einsatz als Standardmethode aufzeigen.

Nach CROWTHER (1995) wird das im Labor durchzuführende ELISA-Verfahren als eine relativ schnelle und effiziente Methode beurteilt, die bereits nach ca. vier Stunden zu genauen Ergebnissen führt, welches beim RIDT erst nach 18 bis 24 Stunden möglich ist (KÄHN 1991b). Auf einer Mikrotiterplatte kann im Vergleich zu einer durchschnittlichen Agarplatte ein deutlich größerer Probenumfang bei zugleich reduziertem Reagenzienverbrauch bearbeitet und die Personalkosten durch Automatisierungsprozesse verringert werden. Die Verwendung von Photometern zur Messung der Extinktion (Messung der optischen Dichte) garantiert eine hohe Objektivität, die zusätzlich durch eine PC-gestützte Datenauswertung mit vorgegebenen Validierungskriterien eine gute Reproduzierbarkeit der Methode ergibt. Weiterhin überzeugt der ELISA mit seiner im Vergleich zum RIDT extrem hohen Sensitivität, so dass selbst die Bestimmung von sehr niedrigen Konzentrationen möglich wird.