Innere Medizin der Medizinischen Hochschule Hannover
Angefertigt im Rahmen der strukturierten Doktorandenausbildung StrucMed
Die Rolle der autokrinen VEGF Signaltransduktion für Funktionen des Podozyten und
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Janina Müller Deile aus Celle
Hannover 2010
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 09.10.2012
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter Suermann Betreuer: Prof. Dr. med. Mario Schiffer
Referent: Prof. Dr. rer. nat. Rita Gerardy Schahn Korreferent: Prof. Dr. med. Jochen Ehrich
Tag der mündlichen Prüfung: 09.10.2012
Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. med. Tobias Welte
PD Dr. med Bernhard Schmidt
PD Dr. med. Frank Gossé
Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht in
Publikationen
• Müller Deile J, Worthmann K, Saleem M, Tossidou I, Haller H, Schiffer M: The balance of autocrine VEGF A and VEGF C determines podocyte survival.
297: F1656 1667, 2009.
• Müller Deile J, Bröcker V, Grünwald V, Hiss M, Bertram A, Kubicka S, Ganser A, Haller H, Schiffer M: Renal side effects of VEGF blocking therapy 3: 172 175, 2010.
Poster Präsentation
• Müller Deile J, Worthmann K, Saleem M, Tossidou I, Haller H, Schiffer M: The balance of autocrine VEGF A and VEGF C determines podocyte survival Kongress für Nephrologie 26. 29.
September 2009, Göttingen.
Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis I II Tabellenverzeichnis a Abkürzungsverzeichnis A B
1 Einleitung... 1
1.1 Die Niere ... 1
1.2 Podozyten ... 2
1.3 Vascular endothelial growth factor (VEGF) ... 4
1.4 VEGF Rezeptoren ... 8
1.5 Das VEGF System und der Podozyt ... 11
1.6 VEGF Ablationstherapie bei soliden Tumoren... 12
1.7 Zielsetzung... 14
2 Material... 15
3 Methoden ... 24
3.1 Experimenteller Teil ... 24
3.1.1 Zellkultur... 24
3.1.2 mRNA Isolierung aus Podotyten ... 26
3.1.3 Umschreibung von mRNA in cDNA und PCR... 26
3.1.4 Gelextraktion... 28
3.1.5 Zelllysierung für die SDS Elektrophorese ... 29
3.1.6 Proteinbestimmung für den Western Blot ... 29
3.1.7 SDS Elektrophorese... 30
3.1.8 Western Blot... 32
3.1.9 Nachweis der VEGF Isoformen und VEGF Rezeptoren auf Proteinebene ... 35
3.1.10Ausfällung von Proteinen aus Zellkulturüberstand... 35
3.1.11Immunfluoreszenzfärbung von Podozyten für VEGF Isoformen und VEGF Rezeptoren ... 36
3.1.12ELISA ... 37
3.1.13Stimulierung humaner Podozyten mit unterschiedlichen Konzentrationen von VEGF A, B und C... 40
3.1.14Time course mit VEGF Isoformen in humanen Podozyten ... 41
3.1.15VEGF Ablationsversuche im Western Blot... 42
3.1.16VEGF Ablation im zeitlichen Verlauf ... 43
3.1.17Stimulierung mit verschiedenen VEGF Isoformen nach Ablation einer anderen VEGF Isoform ... 43
3.1.18TUNEL Färbung nach VEGF Ablation und Rezeptor Tyrosinkinase Inhibierung... 44
3.2 Klinischer Aspekt der Doktorarbeit... 47
3.2.1 Gewinnung von Urin und Plasmaproben für die Messung am Olympus®... 48
3.2.2 Gewinnung von Podozyten aus Urin... 49
3.2.3 Polymorphprep für die Isolierung von Podozyten im Urin ... 50
3.2.4 Messung von VEGF A im Blut und Urin von Bevacizumab oder Sunitinib Patienten ... 50
3.3 Statistik ... 50
4 Ergebnisse... 52
4.1 Experimenteller Teil ... 52
4.1.1 Nachweis der mRNA Expression von VEGF Isoformen in differenzierten murinen und humanen Podozyten... 52
4.1.2Nachweis der mRNA Expression von VEGF Rezeptoren in differenzierten murinen und humanen Podozyten... 54
4.1.3 Nachweis der Expression podozytärer VEGF Isoformen auf Proteinebene... 56
4.1.4 Nachweis der podozytärer VEGF Isoformen durch Immunfluoreszenzfärbung... 59
4.1.5 Nachweis der Proteinexpression podozytärer VEGF Rezeptoren... 61
4.1.6 Nachweis von VEGF Rezeptoren in unterschiedlichen Differenzierungsstadien humaner Podozyten 63 4.1.7 Nachweis von sVEGFR 1 im Zelllysat und Medium humaner Podozyten ... 65
4.1.8 Nachweis von podozytären VEGF Rezeptoren durch Immunfluoreszenzfärbung... 66
4.1.9 Quantitative Sekretion von VEGF Isoformen... 67
4.1.10AKT Aktivierung humaner Podozyten nach Stimulierung mit VEGF Isoformen ... 69
4.1.11AKT und ERK Aktivierung im zeitlichen Verlauf in humanen Podozyten nach Stimulierung mit VEGF Isoformen ... 72
4.1.12Bedeutung des VEGFR 2 in der VEGF Signalkaskade in humanen Podozyten ... 74
4.1.13VEGF Ablationsversuche im Western Blot... 75
4.1.14 VEGF Ablation im zeitlichen Verlauf ... 81
4.1.15 Kombinierte Ablation ... 83
4.1.16 Stimulierung humaner Podozyten mit verschiedenen exogenen VEGF Isoformen nach Ablation einer anderen podozytären VEGF Isoform ... 85
4.1.17 TUNEL Färbung zum Apoptosenachweis humaner Podozyten nach VEGF Ablation und VEGFR 2/ 3 Tyrosin Kinase Inhibierung... 89
4.1.18TUNEL Färbung humaner Podozyten nach Ablation einer endogenen VEGF Isoform und Stimulierung mit einer anderen exogenen VEGF Isoform ... 93
4.2 Klinischer Aspekt der Arbeit... 96
4.2.1 Albuminausscheidung unter VEGF Ablationstherapie ... 96
4.2.2 VEGF A in Blut und im Urin unter VEGF Ablationstherapie... 97
4.2.3 Podozyturie bei VEGF Ablationstherapie... 101
5 Diskussion ... 110
5.1 Experimenteller Teil ... 110
5.1.1 VEGF Isoformen in humanen Podozyten ... 110
5.1.3 VEGF Stimulierungsversuche in humanen Podozyten ... 114
5.1.4 Ablation verschiedener VEGF Isoformen in differenzierten humanen Podozyten ... 116
5.1.5 Stimulierung mit verschiedenen exogenen VEGF Isoformen nach Ablation einer anderen endogenen Isoform... 118
5.2 Klinischer Teil... 120
6 Zusammenfassung... 127
7 Literaturverzeichnis... 128
8 Anhang ... 133
8.1 Aufklärungsbogen für Bevacizumab Patienten ... 133
8.2 Einverständnisgerklärung für Bevacizumab Patienten ... 135
8.3 Aufklärungsbogen für Sunitinib Patienten ... 136
8.4 Einverständniserklärung für Sunitinib Patienten ... 138
9 Danksagung ... 139 10 Lebenslauf...Fehler! Textmarke nicht definiert.
11 Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nrn. 5 und 6...Fehler! Textmarke nicht definiert.
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme der Podozyten……….13
Abb. 2: Schematischer molekularer Aufbau der Schlitzmembran……….14
Abb. 3: Schematische Zusammenstellung der Struktur der VEGF Familie……….19
Abb. 4: Schematische Darstellung der Bindung der VEGF Familie an ihre Rezeptoren………...21
Abb. 5: Undifferenzierte (A) und differenzierte (B) humane Podozyten in Kultur………..…36
Abb. 6: Schema der SDS Elektrophorese. ………43
Abb. 7: Schematische Darstellung des Western Blots………..44
Abb. 8: Schematische Darstellung der Methode des Western Blots mit der Chemielumineszenzreaktion……45
Abb. 9: Schematische Darstelllung des Prinzips des ELISAs………..49
Abb. 10: Schematische Darstellung des TUNEL Assays. ………57
Abb. 11: mRNA Expression von VEGF Isoformen in differenzierten murinen und humanen Podozyten……64
Abb. 12: mRNA Expression von VEGF Rezeptoren in differenzierten murinen und humanen Podozyten…..66
Abb. 13: Western Blot für VEGF A, B und C von Zelllysat differenzierter muriner und.humaner Podozyten………...68
Abb. 14: Immunfluoreszenzfärbung für VEGF A, B und C von undifferenzierten humanen Podozyten …..71
Abb. 15: Western Blot für VEGFR 1, sVEGFR 1, VEGFR 2 and VEGFR 3 im Zelllysat von …………differenzierten humanen Podozyten………...………..73
Abb. 16: Western Blot für VEGFR 1, sVEGFR 1, VEGFR 2 und VEGFR 3 im Zelllysat von …………unterschiedlich lang differenzierten humanen Podozyten………...75
Abb. 17: Graphische Darstellung sVEGFR 1 ELISA Messungen ………76
Abb. 18: Immunfluoreszenz Färbung für VEGFR 1, 2 und 3 von undifferenzierten und von 7 Tage differenzierten humanen Podzyten………..………..……….77
Abb. 19: Auswertung des ELISAs von sezerniertem VEGF A und VEGF C unterschiedlich lang differenzierter humaner Podozyten………...………...……….78
Abb. 20: Western Blot für VEGF A und VEGF C von ausgefälltem Zellkulturüberstand ………....…80
Abb. 21: Stimulierung humaner Podozyten mit unterschiedlichen Konzentrationen von VEGF A, VEGF B und VEGF C………82
Abb. 22: Western Blots der time course mit VEGF A, VEGF B und VEGF C in differenzierten humanen Podozyten für pAKT und pERK………...…84
Abb. 13: Western Blots zur Demonstration der Rolle von VEGFR 2 für die AKT Phosphorylierung nach Stimulation mit VEGF A und C………...……….85
Abb. 24: Western Blots unterschiedlicher VEGF Ablationsversuche zur Untersuchung der Auswirkungen ………….auf die AKT und die p38 Phosphorylierung………..…89 91 Abb. 25: Western Blots für den zeitlichen Verlauf derVEGF Ablation……..………...…93
Abb. 26: Western Blots unterschiedlicher kombinierter VEGF Ablationsversuche für pAKT pp38……...95
Abb. 27: Stimulierung differenzierter humaner Podozyten mit verschiedenen VEGF Isoformen nach
Ablation einer anderen VEGF Isoform...98+99 Abb. 28: TUNEL Färbung 7 Tage differenzierter humaner Podozyten nach verschiedenen VEGF
Ablationen ………...102 Abb. 29: Vergrößerungsaufnahme eines apoptotischen TUNEL positiven Zellkernes…...103 Abb. 30: TUNEL Färbung differenzierter humaner Podozyten nach Ablation einer endogenen
……… VEGF Isoform und Stimulierung mit einer anderen exogenen VEGF Isoform………..…...106 Abb. 31: Graphische Darstellung der jeweils höchsten UAC Ratios in der Studienzeit von Bevacizumab
…………und Sunitinib Patienten……….108 Abb. 32: A) VEGF A Konzentration im Blut von Patienten unter Bevacizumab und Sunitinib Therapie sowie einer gesunden Kontrollgruppe………..109 B) VEGF A Kreatinin Ratio im Urin von Patienten unter Bevacizumab und Sunitinib Therapie sowie einer gesunden Kontrollgruppe………..……110 Abb. 33: Verhältniss zwischen VEGF A Kreatinin Ratio im Urin und VEGF Konzentration im Blut bei
…………Bevacizumab oder Sunitinib Paienten………...………...………111 Abb. 34: Podocalyxin positive Zellen aus dem Urin von Bevacizumab Patienten...112 Abb. 35: Darstellung der jeweils höchsten UAC Ratios und der Podozyturie der Patienten unter
Bevacizumab und Sunitinib Therapie…...……….113 Abb. 36: Graphische Darstellung des Verhältnisses zwischen den Podozyten im Urin pro mg Kreatinin
…………und den UAC Ratios der Bevacizumab Patienten……….……….…114 Abb. 37: Immunfluoreszenzfärbung mit Podocalyxin und WT 1 einer Zellen aus dem Urin eines
…………Patienten unter Sunitinib Therapie zusammen mit der graphischen Darstellung………..…115 Abb. 38: Serum Kreatinin in mol/l und Serum Harnstoff in mmol/l des Fallbeispiel Patienten unter
…………Sunitinib Therapie...116 Abb. 39: FSGS des Patienten unter Sunitinib Therapie; HE Färbung, elekronenmikroskopisches Bild
und Silberfärbung der Nierenbiopsie………..…..………...118 Abb. 40: HE Färbung der Nierenbiopsie des Patienten unter Sunitinib Therapie, die die interstitielle
…………Nephritis zeigt…………..………...118 Abb. 41: Schematische Darstellung der im Rahmen dieser Arbeit erlangten Ergebnisse zur
……… podozytären Expression von VEGF Isoformen und VEGF Rezeptoren...125 Abb. 42: Schematische Darstellung der im Rahmen dieser Arbeit erlangten Ergebnisse zur
…………Bedeutung podozytärer VEGF Isoformen...131
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Funktionen von VEGF und Folgen einer VEGF Inhibierung: ... 5
Tabelle 2: Nomenklatur der VEGF Rezeptoren ... 9
Tabelle 3: Verbrauchsmaterialen mit Herstellungsfirma... 15
Tabelle 4: Reagenzien mit zugehöriger Herstellungsfirma ... 16
Tabelle 5: Rekombinate Proteine mit der Herstellungsfirma ... 19
Tabelle 6: Abations Antikörper und Rezeptorinhibitoren... 19
Tabelle 7: Primäre Antikörper mit Verdünnung, Herstellungsfirma und Molekulargewicht... 19
Tabelle 8: Sekundäre Antikörper mit eingesetzter Verdünnung und Herstellungsfirma. ... 21
Tabelle 9: Primer mit Primersequenz, Annealingtemperatur und Basenpaarlänge des Transkriptionsproduktes... 21
Tabelle 10: Mastermixansatz mit der Mengenangabe für eine Probe... 27
Tabelle 11: Ansatz für den 50x Tris Acetat EDTA (TAE) Puffer mit Mengenangabe der Chemikalien... 28
Tabelle 12: Substanzen für den Lysepufferansatz ... 29
Tabelle 13: Chemikalien mit Mengenangabe für den Ansatz für Trenngele für die SDS Elekrophorese ... 30
Tabelle 14: Chemikalien mit Mengenangabe für den Ansatz des Sammelgels für die SDS Elektrophorese... 30
Tabelle 15: Chemikalien mit Mengenangabe für den Ansatz des Elektrophoresepuffers... 31
Tabelle 16: Chemikalien mit Mengenangabe für den Ansatz des Auftragspuffers... 31
Tabelle 17: Chemikalien und Mengenangabe für den Ansatz des Blotpuffers... 32
Tabelle 18: Ansatz von Tween ... 33
Tabelle 19: Reagenzien für den VEGF B ELISA... 39
Tabelle 20: Versuchsaufbau zur Simulierung mit unterschiedlichen Konzentrationen von VEGF A/ B/ C .... 41
Tabelle 21: Versuchsaufbau für die VEGF Ablation im Western Blot... 42
Tabelle 22: Versuchsaufbau zur VEGF Stimulierung nach Ablation einer anderen VEGF Isoform... 43
Tabelle 23: VEGF Ablationskonzentrationen/Negativkontrollen für anschließende TUNEL Färbung ... 44
Tabelle 24: Übersicht über VEGF Ablations und Stimulierungs Konzentrationen... 45
Tabelle 25: Chemikalien mit Mengenangabe für den Ansatz der TdT Enzyme ... 46
Tabelle 26: Chemikalien mit Mengenangabe für den Stopp /Waschpuffer... 47
Tabelle 27: Chemikalien mit Mengenangabe für das Anti Digoxigenin Konjugat ... 47
Tabelle 28: Daten zu den Studienpatienten für den klinischen Teil der Arbeit. ... 108
Abkürzungsverzeichnis
Tabelle1: Abkürzungen in dieser Arbeit und ihre Bedeutung
Abkürzung Bedeutung
AK Antikörper
AKT Phosphokinase B
APS Ammoniumperoxosulfat
Bp Basenpaare
BSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumin)
DAPI 4 ,6 Diamidino 2 Phenylindol
DMEM “Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium”
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid)
dNTP Desoxynukleosidtriphosphat
DTT Dithiothreitol
ECL Elektrochemilumineszenz
EDTA Ethylendiamintetraacetat
ELISA enzyme linked immunoabsorbent assay
ERKs Extrazellulär regulierte Kinasen (extracellular signal regulated kinase)
FCS Kälberserum (fetal calf serum)
GAPDH Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase
GBM glomeruläre Basalmembran
HEPES Hydroxyethyl 1 piperazinethansulfonsäure
ITS Insulin–Transferrin–Selen
kDa Kilodalton
MAPK Mitogenaktivierte Proteinkinase
P/ S Penicillin/ Streptomycin
NAD Nicotinamid adenin dinukleotid
PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese
Abkürzung Bedeutung
PBS Phosphatgepufferte Salzlösung (Phosphate buffered saline)
PIGF placental growth factor
PVDF Polyvinalidendifluorid
RNA Ribunukleinsäure (ribonucleic acid)
rpm Umdrehungen pro Minute (revolutions per minute)
RPMI Roswell Park Memorial Institut
RT Reverse Transkriptase
SDS Sodiumdodecylsulfat
TBS Tris gepufferte Salzlösung (Tris buffered saline) TBST Tris gepufferte Salzlösung mit Tween
TCA Trichloressigsäure (trichloroacetic acid) TEMED N, N, N‘, N‘ Tetramethylethylendiamin
Tris Tris (hydroxymethyl) aminomethan
TUNEL TdT mediated dUTP biotin nick end labeling UAC Ratio Urin Albumin Kreatinin Ratio
VEGFR 2/ 3 TKI VEGFR 2/ 3 Tyrosin Kinase Inhibitor αVEGF A VEGF A Neutralisierungs Antikörper αVEGF B VEGF B Neutralisierungs Antikörper αVEGF C VEGF C Neutralisierungs Antikörper
1 Einleitung
1.1 Die Niere
Die Niere nimmt im Körper wichtige Aufgaben wahr. Sie dient der Kontrolle des Wasser , des Elektrolyt und des Säure Basenhaushaltes sowie der Ausscheidung von
Stoffwechselendprodukten. Weiterhin ist die Niere an der Bildung von Erythropoetin, Angiotensin II, Calcitriol und Prostaglandinen beteiligt und spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des Blutdruckes.
Die funktionelle Einheit der Niere ist das Nephron, das aus dem Nierenkörperchen (Glomerulum) und den unverzweigten Nierentubuli besteht. In einer Niere gibt es 1,2 Millionen Nephrone.
Das Glomerulum setzt sich aus dem inneren viszeralen und äußeren parietalen Blatt der Bowman Kapsel, dem Kapillarknäuel und dem Mesangium zusammen.
Die Außenseite der Kapillaren besteht aus viszeralen Epithelzellen (Podozyten). Die Basallamina der Podozyten verschmilzt mit der der Endothelzellen der Glomeruluskapillaren zu einer
gemeinsamen Basalmembran mit Lamina rara externa, Lamina densa und Lamina rara interna.
Zur Harnseite hin sind die Podozyten von einer negativ geladenen, hauptsächlich aus Podocalyxin bestehenden Glykokalyx überzogen.
Zwischen den Fußfortsätzen spannt sich eine hochkomplexe Struktur aus
Transmembranproteinen, die Schlitzmembran, auf. Endothelzellen, glomeruläre Basalmembran und podozytäre Schlitzmembran bilden die Filtrationsbarriere der Niere, die für die Größen und Ladungsselektivität der glomerulären Filtration verantwortlich ist.
Wasser und alle Stoffe bis zu einem Molekulargewicht von 65 kDa oder einem Radius von 1,6 1,8 nm werden frei filtriert. Anionen werden durch die negative Ladung der Proteoglykane der glomerulären Basalmembran und durch die Glykokalyx der Podozyten schlechter filtriert als gleich große Kationen oder ungeladene Teilchen. Der gefilterte Primärharn gelangt über den Harnpol in das Tubulussystem.
Ein Nierentubulus besteht aus proximalem, intermediärem und distalem Tubulus. Die Pars
recta des proximalen Tubulus, intermediärer Tubulus und die Pars recta des distalen Tubulus bilden zusammen die Henle Schleife. 99 % der täglich filtrierten Flüssigkeit (180 Liter
Primärharn) werden in den Tubuli rückresorbiert. Die anschließenden Sammelrohre dienen unter dem Einfluss des anti diuretischen Hormons (ADH) der Feinregulierung des Wasserhaushaltes.
Anschließend wird der konzentrierte Urin über das Nierenbeckenkelchsystem gesammelt und in der Harnblase gespeichert.
1.2 Podozyten
Podozyten umscheiden die Außenseite der Kapillaren vollständig (Abb.1). Sie differenzieren sich aus Epithelzellen des inneren Blattes der Bowmankapsel und bestehen aus einem großen
Zellkörper, Primärfortsätzen und von diesen abgehenden Fußfortsätzen (Sekundärfortsätze/
Pedicellen), mit denen sie über Integrine an die Basalmembran anhaften.
Abb. 1: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme der Podozyten.
Zu erkennen sind die Zellkörper der Podozyten (Sternchen) und die von diesem ausgehenden großen Primärfortsätze sowie die fein verzweigten, interdigitierenden Sekundärfortsätze (Uni Regensburg, Witzgall (1)).
Die Fußfortsätze der Podozyten haben ein durch α Actinin und Synaptopodin vernetztes Aktinskelett.
Die Fußfortsätze benachbarter Podozyten interagieren fingerförmig miteinander und bilden die äußere Schicht der glomerulären Filtrationsbarriere. Zwischen den Fußfortsätzen gibt es 30 40 nm breite Spalten, die von einer 4 nm breiten Schlitzmembran überbrückt werden.
Eine Übersicht über den schematischen Aufbau der Schlitzmembran gibt Abb. 2.
Abb. 2: Schematischer molekularer Aufbau der Schlitzmembran:Cas: p130Cas; Cat:Caterine; CD:CD2AP, EZ: Ezrin; FAK: focal adhesion kinase; IKL: integin linked kinase; M:Myosin; N:NHERF2; NSCC: non celectine cation channel; PC: Podocalyxin; S: Synaptopdin; TPV: Talin, Paxilin, Vinculin; U: Utropin; Z: ZO 1 (Endlich et al (2)).
Die Schlitzmembran entspricht der „junctionalen“ Zellmembrandomäne der Podozyten.
Sie besteht hauptsächlich aus den transmembranären Nephrin und Podocin. Auch Neph 1, 2 und 3, Nephrin, P Cadherin, Zonula occludens 1 und FAT sind an der Ausbildung der
Schlitzmembran beteiligt.
Nephrin ist über das CD2assoziierte Protein (CD2AP) mit dem Aktinzytoskelett verbunden.
Mutationen in dem Nephrin kodierenden Gen NPHS1 führen zum autosomal rezessiven
Nephrotischen Syndrom des finnischen Typs (3), dem Verlust der Schlitzmembran und einer großen Proteinurie
Podozyten sind terminal enddifferenzierte Zellen ohne Teilungspotential. Nur während der Entwicklung des Glomerulums proliferieren Podozyten stark (3). Im Verlauf der
Nierenentwicklung verlassen sie den Zellzyklus und nehmen ihre hoch differenzierte
Morphologie an. Das bedeutet, dass der Verlust der Zellen nicht durch regenerative Zellteilung ausgeglichen werden kann.
Die Ausscheidung von Podozyten im Urin wird als Podozyturie bezeichnet. , beschrieben, dass die daraus resultierende Podozytopenie zur Entstehung einer progressiven Glomerulosklerose beiträgt (4).
1.3 Vascular endothelial growth factor (VEGF)
Podozyten sind die bedeutsamsten Produzenten des Vascular Endothelial Growth Factors (VEGF) in der Niere. Zu der VEGF Familie zählen VEGF A, VEGF B, VEGF C, VEGF D, VEGF E, svVEGF (snake venom VEGF) und PIGF (placenta growth factor).
Wie . zeigen konnten, ist VEGF ein entscheidender Faktor in der Angiogenese und stimuliert die Proliferation, Migration und proteolytische Aktivität von Endothelzellen (5).
. beschrieben die Bedeutung von VEGF durch seine Fähigkeit, Apoptose zu verhindern und das Überleben von Endothelzellen zu fördern (6)
Da VEGF die Gefäßpermeabilität erhöhen kann, wurde er früher als Vascular Permeability Factor (VPF) oder Vasotropin bezeichnet (7). Immunmodulation, Hämatopoesesteigerung und
Beeinflussung der Koagulationskaskade sind weitere VEGF vermittelte Effekte.
Neben seiner Fähigkeit, die Produktion von NO zu induzieren, bewirkt VEGF eine Vasodilatation und verstärkt dadurch den Blutfluss (8).
Die Genexpression von VEGF wird durch Hypoxie, Wachstumsfaktoren, p53 Mutationen, Transformationen, Östrogen, TSH und NO stimuliert (9). Auch Tumorgewebe bildet ab einer gewissen Größe vermehrt VEGF.
zeigten, dass die hypoxische Regulation der VEGF Expression über die Transkription
Stabilisierung und auf Proteinebene durch proteolytische Freisetzung aus der extrazellulären Matrix geschieht (9).
In Tabelle 1 sind die wichtigsten Funktionen von VEGF sowie die Folgen einer VEGF Inhibierung zusammengestellt.
Tabelle 1: Funktionen von VEGF und Folgen einer VEGF Inhibierung:
Funktion von VEGF Folgen der VEGF Inhibierung
Angiogenese (in hohen Konzentrationen)
• Endothelzellproliferation ↑
• Migration ↑
• Hyperpermeabilität ↑
Angiogenese
• Bluthochdruck aufgrund gestörter Endothelzellfunktion
Gefäßhomöostase (in geringen Konzentrationen)
• Endothelzellüberleben ↑
• Gefäßintegrität ↑
• Thrombozyten Endothelzell Homöostase
Gefäßhomöostase
• Thrombosen aufgrund von Endothelzellapoptose + gestörter Thrombozyten Endothelzell Homöostase
Immunmodulation
• Inhibierung von Dendritischen Zellen
Immunmodulation
• unklar Knochenmark
• Hämatopoese/ Myelopoese ↑
Knochenmark
• Leukopenie und Lymphopenie Niere
• Podozytenüberleben
Niere
• Proteinurie und Ödeme Blutdruck
• NO und PGI2 Freisetzung ↑
Blutdruck
• Hypertonie Koagulationskaskade (in hohen Konzentrationen)
• Tissue faktor ↑
• von Willebrand Faktor ↑
Koagulationskaskade
• Wundheilungsstörungen/ Blutungen
Schilddrüse
• Stimulierung
Schilddrüse
• Hypothyreose
Im Folgenden soll ein kurzer Überblick über die Mitglieder der VEGF Familie gegeben werden:
VEGF A ist ein dimeres Glykoprotein, dessen Funktionen in der Stimulierung der Proliferation endothelialer Gefäßzellen, in der Vermittlung von Überlebens und Migrationssignalen an Endothelzellen und in der Steigerung der Gefäßpermeabilität liegen.
Das humane VEGF A besteht aus 8 Exons, die durch 7 Introns voneinander getrennt werden (7).
Durch alternatives Splicen der mRNA (10) entstehen folgende humane Isoformen des VEGF A:
VEGF A121 (363bp), VEGF A145 (435bp), VEGF A148 (444bp), VEGF A162 (486bp), VEGF A165 (495bp), VEGF A183 (549bp), VEGF A189 (567bp) und VEGF A206 (613bp). Sie unterscheiden sich in der Anzahl der Exons, in ihrem Molekulargewicht und in ihren physikalischen
Eigenschaften.
Die murinen Isoformen von VEGF sind eine Aminosäure kürzer als die humanen.
VEGF A189 und VEGF A206 und werden im Gegensatz zu den anderen Isoformen kaum sezerniert, sondern sind hauptsächlich membranständig. Die Isoformen in der endothelialen Zellmembran stellen ein Reservoir dar, das langsam in Anwesenheit von Heparin, Heparansulfat und Heparinasen freigesetzt werden kann. Durch spezifische proteolytische Enzyme wie Plasmin oder Urokinase Plasminogen Aktivator (uPA) können sie schneller modifiziert werden.
Das bioaktive VEGF aus 110 NH2endigen Aminosäuren entsteht erst im extrazellulären
Kompartiment. Ob Podozyten zu ähnlicher Umverteilung der VEGFs in der Lage sind, ist bisher nicht beschrieben.
Neben den pro angiogenetischen VEGF A Isoformen gibt es noch anti angiogenetische, die mit VEGFxxxb bezeichnet werden. Sie werden nicht wie die pro angiogenetischen VEGF Isoformen proximal im Exon 8 gespliced, sondern distal. Die VEGFxxxb Isoformen inhibieren
Endothelzellproliferation und migration sowie Vasodilatation (11).
VEGF B wird vor allem im Muskel und Herzgewebe exprimiert und spielt eine wichtige Rolle in der Angiogenese, der Herzentwicklung, bei Arthritis (12) und beim Schutz des Gehirns vor Ischämieschaden. VEGF B kann mit VEGF A Heterodimere bilden und wird oft zusammen mit VEGF A exprimiert (13). In Podozyten wurde VEGF B bislang noch nicht untersucht.
VEGF C spielt eine wichtige Rolle in der Lymphangiogenese (14, 15). konnten
zeigen, dass VEGF C nicht die Permeabilität erhöht (16). Es ist wie VEGF A ein proliferations und migrationsfördernder Faktor für Endothelzellen, hat aber eine vierfach geringere Potenz als VEGF A (17).
VEGF C wird als Prä pro protein mit einem Molekulargewicht von 61 kDa gebildet und in ein 58 kDa Pro protein prozessiert. Noch intrazellulär kommt es zu Dimerisierung und anschließend zu einer Spaltung in eine 29 kDa schweres und ein 31 kDa schweres Protein, die beide schnell sezerniert werden. Die Sekretion geht mit einer weiteren proteolytischen Spaltung einher, sodass 15 kDa und 21 kDa schwere Produkte entstehen (17).
VEGF D wurde von . mit der Induktion von Lymphgefäßen in Tumorgeweben und der Förderung von Metastasierung in Verbindung gebracht (18)
VEGF C und D werden als Prä pro proteine mit langem N und C Terminus gebildet, die vor ihrer Bindung an VEGFR 2 oder VEGFR 3 zweimal proteolytisch gespalten werden müssen.
VEGF E ist ein virales Homolog von VEGF A. Es wurde im Genom des Parapox Virus Orf entdeckt (19). scVEGF ist eine Form, die in Schlangengiften vorkommt. Es bewirkt eine starke Erhöhung der Gefäßpermeabilität aber nur eine schwache Stimulierung der endothelialen Zellproliferation (20). snVEGF, das spezifisch an den VEGFR 2 bindet, ist ebenfalls ein Bestandteil von Schlangengiften. Die C terminale Heparin bindende Region von snVEGF blockiert die biologische Aktivität von VEGF A165 und
Der placenta growth factor (PIGF) wird besonders in der Plazenta exprimiert, bildet
Heterodimere mit VEGF und bewirkt eine Feinabstimmung der Angiogenese. Durch alternatives Splicen von PIGF entstehen PIGF131, PIGF152, PIGF203 und PIGF224 (21). Trotz Bindung an die gleichen Rezeptoren führen PIGF und VEGF zu unterschiedlichen Signaltransduktionswegen (22).
In Abb. 3 sind die VEGF Familienmitglieder schematisch mit ihren Exons dargestellt. Die Zahlen rechts geben die Übereinstimmung zu VEGF A in Prozent an.
Abb. 3: Schematische Zusammenstellung der Struktur der VEGF Familie mit Angaben zu den Exons und zu der Übereinstimmung mit VEGF A (Takahashi et al (21)).
1.4 VEGF Rezeptoren
Bis jetzt sind drei VEGF Hauptrezeptoren VEGFR 1, VEGFR 2, VEGFR 3 und zwei Korezeptoren NP 1 und NP 2 beschrieben worden. Die VEGF Isoformen besitzen zu den verschiedenen VEGF Rezeptoren jeweils unterschiedliche Affinität.
VEGF Rezeptoren wurden auf Endothelzellen, Trophoblasten, Monozyten, hämatopoetischen
Stammzellen, Megakaryozyten, Pankreasgangzellen, nichtkleinzelligen Lungenkarzinomzellen, Lungenfibroblasten, Muskelzellen, auf Tubuluszellen sowie im Mesangium der Niere gefunden.
VEGFR 1 wird synonym auch als flt 1 bezeichnet. Diese Abkürzung steht für fms like tyrosine kinase (fms = Makrophagen Kolonie stimulierenden Faktor). Synonyme für VEGFR 2 sind flk 1 (fetal liver kinase) oder KDR (kinase insert domain containing receptor). Der VEGFR 3 wird auch flt 4 genannt.
Tabelle 2 fasst die Nomenklatur noch einmal zusammen.
Tabelle 2: Nomenklatur der VEGF Rezeptoren
VEGF Rezeptor VEGFR 1 VEGFR 2 VEGFR 3
Synonym Flt 1 Flk 1/ KDR Flt 4
Die VEGF Rezeptor Tyrosin Kinasen besitzen alle eine extrazelluläre Immunglobulin Domäne, eine Transmembran Domäne und eine intrazelluläre Tyrosinkinasen Domäne.
Trotz großer Homologie zwischen den Rezeptoren sind ihre biochemischen Eigenschaften sehr unterschiedlich. VEGFR 1 hat im Vergleich zu VEGFR 2 eine zehnfach höhere Affinität gegenüber VEGF A, besitzt aber eine zehnmal geringere Kinase Aktivität.
Der VEGFR 1 ist mehr mit Zelldifferenzierung, der Regulierung der Angiogense in der Entwicklung und Angiogenese unter pathologischen Bedingungen assoziiert (21). An den VEGFR 1 und NP 1 binden VEGF A, VEGF B und PIGF. Der Knockout von VEGFR 1 bei Mäusen bewirkt eine ungeordnete Ausbildung von Blutgefäßstrukturen (23).Wie zeigen konnten, hat der Verlust der Tyrosinkinase Domäne in VEGFR 1 Knockout Mäusen eine reduzierte Migrationsfähigkeit der Makrophagen zur Folge (24).
Alternatives Splicing der VEGFR 1 prä m RNA führt entweder zur Bildung der membran durchspannenden Variante oder der löslichen Form, die als sVEGFR 1 oder sflt 1 bezeichnet wird. Erhöhte sVEGFR 1 Konzentrationen im Blut finden sich unter anderem bei Präeklampsie.
Dem sVEGFR 1 fehlt die Transmembran und die intrazelluläre Tyrosinkinase Domäne. Somit löst er keine Signaltransduktionskaskade aus und fungiert als „Neutralisator“ von zirkulierendem VEGF.
Der VEGFR 2 spielt hingegen eine wichtige Rolle in der VEGF vermittelten Endothelzell
proliferation. Außerdem vermittelt er die angiogenetischen und permeabilitätssteigernden Effekte von VEGF. VEGF A, VEGF C, VEGF D, VEGF E und svVEGF sind Liganden des VEGFR 2.
VEGF A
VEGF B VEGF C/ D
VEGFR 1 VEGFR 2 VEGFR 3
sVEGFR 1
NP 1 NP 2
VEGF E PIGF sv VEGF
VEGFR 2 defiziente Mäuseembryos entwickeln keine Angioblasten, keine hämatopoetischen Zellen und keine differenzierten Endothelzellen (25).
VEGFR 3 (flt 4) kommt vor allem auf lymphatischen Endothelzellen vor. Er ist für die embryonale kardiovaskuläre Entwicklung sowie das Wachstum von Lymphgefäßen im adulten Gewebe zuständig. Außerdem spielt VEGFR 3 laut eine Rolle bei der
Wundheilung, bei der der Rezeptor auch in Blutgefäßen des Endothels verstärkt exprimiert wird (26). VEGFR 3 dient VEGF C und VEGF D als Rezeptor.
VEGFs bindet weiterhin an Rezeptoren der Neuropilin Rezeptor Familie. Hierbei handelt es sich um Glykoproteine der Zelloberfläche ohne intrazelluläre Enzymaktivität. Bei der VEGF
Signaltransduktion dienen die Neuropilin Rezeptoren NP 1 und NP 2 hauptächlich als Korezeptoren für VEGFR 2 (27) NP 1 wurde erstmalig 1995 beschrieben und wird in
Endothelzellen, Tumoren, Plazenta, Herz, Lunge, Leber, Muskel, Pankreas, Knochenmark und der Niere exprimiert (28) NP 1 spielt eine Rolle bei der embryonalen Entwicklung und der Axonbahnung. Neben VEGF A165 und VEGF E binden auch Klasse 3 Semaphorine an NP 1 (auch NRP 1) und NP 2 (auch NRP 2).
In Abb. 4 ist die Affinität der VEGF Isoformen an die unterscheidlichen VEGF Rezeptoren schematisch dargestellt.
Abb. 4: Schematische Darstellung der Bindung der VEGF Familie an ihre Rezeptoren
1.5 Das VEGF System und der Podozyt
Die vielfältige Rolle von VEGF im Blutgefäßsystem und seine anti apoptotische Fähigkeit lassen diverse Aufgaben dieses Wachstumsfaktorfamilie in der Niere vermuten.
hypothetisierten, dass das von den Podozyten gebildete VEGF durch Diffusion entlang eines Konzentrationsgradienten von der podozytären Seite zur endothelialen Seite diffundiert, wo sich die Rezeptoren befinden (29).
Direkte Effekte am Podozyten sind bislang nur wenig beschrieben worden.
Bei der bekannten Vielfalt von VEGF Isoformen scheint es besonders interessant, welche Isoformen von Podozyten exprimiert werden und welche Rolle ihnen zukommt.
In der Literatur finden sich hierzu bisher recht widersprüchliche und zum Teil kontroverse Erkenntnisse.
Welche VEGF Formen in der Niere speziell von Podozyten gebildet werden und welche Rezeptoren auf Podozyten zu finden sind, ist bislang erst lückenhaft von verschiedenen Forschungsgruppen erfasst worden.
Außerdem wurde diesbezüglich in der Vergangenheit in unterschiedlichen Spezies, in verschiedenen Zellreihen und nicht einheitlich hinsichtlich der Versuchsdurchführungen
geforscht. So wurde VEGF und seine Signaltransduktionskaskade zwar bereits zu verschiedenen Fragestellungen untersucht, doch die Zusammenstellung der Teilergebnisse bringt mehr
Verunsicherung als Klarheit über die Funktion des Wachstumsfaktors in Podozyten.
Auch zu den Rezeptoren von VEGF auf Podozyten gibt es in der Literatur unterschiedliche Erkenntnisse: Die Arbeitsgruppe von konnte in Mäusepodozyten die Expression aller VEGF Rezeptoren (außer VEGF Rezeptor 3, der nicht untersucht wurde) auf mRNA Level nachweisen (30).
gehen jedoch davon aus, dass der VEGF Rezeptor 2 in humanen Podozyten nicht exprimiert wird (16). In immortalisierten humanen Podozyten wurde von dieser Arbeitsgruppe nur VEGFR 1, VEGFR 3, NP 1 und NP 2 nachgewiesen.
Die Erkenntnisse über die Bedeutung von VEGF in pathologischen Verhältnissen der Niere sind ebenfalls sehr unterschiedlich: Die Inhibierung von VEGF hat einen positiven Effekt auf die Niere bei Diabetes. Der Verlust von VEGF ist aber mit der Entwicklung von Glomerulosklerose
und tubulointerstitieller Fibrose assoziiert. Eine eher positive Rolle nimmt VEGF hingegen bei glomerulären Reparaturmechanismen, einer thrombotischen Mikroangiopathie und einer Cyclosporin Nephrotoxizität ein (31)
Erniedrigte VEGF A Level durch erhöhte sVEGFR 1 Konzentrationen im Blut bei Präeklampsie korrelieren wiederum direkt mit der Proteinurie, dem Bluthochdruck und der Endothelläsion bei dieser Krankheit (32).
1.6 VEGF Ablationstherapie bei soliden Tumoren
Neben den Podozyten produzieren auch Tumore ab einer gewissen Größe VEGF, um Neoangiogenese zu induzieren. Überschreiten bösartige Tumoren eine Größe von wenigen
Millimetern, können die Tumorzellen aus dem umliegenden Gewebe nicht mehr genug Sauerstoff und Nährstoffe aufnehmen. Neben verschiedenen Mechanismen zum Unterlaufen einer
Immunantwort muss der Primärtumor als Voraussetzung für weiteres Wachstum vor allem die Fähigkeit besitzen, sich durch neu aussprossende Blutgefäße selber zu versorgen.
Dieser Vorgang wird als Angiogenese bezeichnet. Es handelt sich um einen sehr komplexen Prozess, bei dem die zur Bildung der Gefäßwände notwendigen Endothelzellen, Perizyten und glatten Muskelzellen durch den Wachstumsfaktor VEGF aktiviert werden. Dieser Faktor wird unter anderem vom Tumorgewebe selber gebildet. Das Expressionsmuster der verschiedenen Splice Varianten von VEGF kann sich bei der tumorösen Entartung von Zellen verändern (33).
Die Angiogenese Aktivität und somit die Tumorwachstumsgeschwindigkeit wird wiederum vom Expressionsmuster der VEGF Isoformen beeinflusst.
In gesundem erwachsenen Gewebe findet normalerweise außer bei Wundheilung nach Verletzungen keine Angiogenese statt. Damit stellt die Hemmung der durch Tumorzellen induzierten Neoangiogenese theoretisch einen gut geeigneten Angriffspunkt für eine Tumortherapie dar.
Bevacizumab (Handelsname Avastin®) ist ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch gegen VEGF A gerichtet ist. Durch Bindung an VEGF A wird das Gefäßwachstum innerhalb solider Tumoren gehemmt. Zur Angiogenesehemmung ist Bevacizumab als First Line Therapie bei metastasierenden kolorektalen Karzinomen zugelassen. Die Zulassung erfolgte für die
Kombination mit 5 Fluorouracil/Folinsäure oder mit 5 Fluorouracil/Folinsäure plus Irinotecan.
Zusammen mit platinhaltigen Chemotherapeutika ist Bevacuzimab zur First Line Behandlung bei inoperablem, fortgeschrittenem nicht kleinzelligen Bronchialkarzinom sowie in Kombination mit Paclitaxel zur First Line Behandlung von Mammakarzinomen zugelassen. Beim
fortgeschrittenen oder metastasierten Nierenzellkarzinom wird Bevacizumab in Kombination mit Interferon alpha eingesetzt. Es laufen derzeit zahlreiche Studien, die die Wirksamkeit bei anderen Tumorarten untersuchen.
Sunitinib (Handelsname Sutent®) ist ein Multikinaseinhibitor, der zur Behandlung nicht resektabler und/ oder metastasierender bösartiger gastrointestinaler Stromatumoren eingesetzt wird, wenn eine Behandlung mit Imatinib (Glivec®) wegen Resistenz oder Unverträglichkeit fehlgeschlagen ist. Eine weitere Indikation für Sunitinib ist das metastasierende
Nierenzellkarzinom.
Sunitinib hemmt die VEGF Signalkaskade auf Rezeptorebene.
Folgende Tyrosinkinasen werden durch Sunitinib gehemmt: PDGF Rezeptor α und β, VEGF Rezeptor 1 3, KIT (Stammzellfaktor) Rezeptor, FLT (Fms like tyrosine kinase)3 Rezeptor, CSF (koloniestimulierender Faktor)1 Rezeptor und RET (rearranged during transfection)
Rezeptor.
Eine Nebenwirkung der VEGF Ablationstherapie ist die Ausbildung einer Proteinurie durch die Hemmung VEGF bedingter Effekte an den glomerulären Kapillaren.
Viele Studien bestätigen die Rolle von VEGF in der Instandhaltung der glomerulären Filtrationsbarriere. Bei den meisten glomerulären Erkrankungen ist die VEGF Expression anfangs erhöht und im Spätstadium zum Zeitpunkt der Glomerulosklerose und des
Podozytenverlustes erniedrigt. In Mäusen mit Glomerulonephritis konnte durch Anti VEGF Gabe die Krankheit beschleunigt werden (29).
beschrieben pathologische Veränderungen der Niere wie ein aktiviertes Mesangium, geschädigtes Endothel, geschädigte Podozyten und Glomerulosklerose bei Mäusen, die mit Anti VEGF behandelt wurden (6). Gleichzeitig konnte auch gezeigt werden, dass VEGF Antikörper mit geringer Affinität zu VEGF Tumorwachstum reduzierten, aber die Niere weniger schädigten.
konnten in einer Studie nachweisen, dass sechs Patienten unter einer Therapie mit Bevacizumab eine thrombotische Mikroangiopathie in den Nierenglomerulie entwickelten (29).
1.7 Zielsetzung
Die vorliegende Arbeit soll einen Beitrag zum Verständnis des VEGF Systems in Podozyten leisten und die Bedeutung von VEGF abhängigen autokrinen und parakrinen Signalwirkungen für Podozyten sowohl als auch untersuchen.
A. Experimenteller Teil
Bisher gibt es keine Arbeit, in der alle bekannten VEGF Isoformen und Rezeptoren in humanen Podozyten systematisch untersucht wurden und in der Literatur bestehen scheinbare
Widersprüche bezüglich des VEGF. Daher steht am Anfang der vorliegenden Arbeit eine umfassende Charakterisierung des podozytären VEGF Systems auf mRNA und Proteinebene.
In bisherigen Untersuchungen wurde der Hauptfokus bezüglich podozytärer VEGF
Signaltransduktionswege auf die parakrine Wirkung an glomerulären Endothelzellen gelegt.
Die vorliegende Arbeit soll sich insbesondere auch mit den autokrinen Funktionen von podozytärem VEGF durch die Betrachtung von pro survival und pro apoptotischen
Signaltransduktionswegen befassen. Durch Stimulierung mit exogenen VEGFs und zeitgleicher Neutralisierung anderer podozytärer VEGF Isoformen soll nachgewiesen werden, wie sich die Isoformen gegenseitig beeinflussen. Außerdem soll überprüft werden, ob durch unterschiedliche VEGF Ablation in humanen Podozyten Apoptose ausgelöst wird.
B. Klinischer Teil
Unter der Hypothese, dass Podozyten auf autokrines VEGF für die Ausübung ihrer Funktionen im Glomerulum angewiesen sind, wird in der vorliegenden Arbeit versucht, einen möglichen podozytären Schaden einer VEGF Ablation auch nachzuweisen.
Hierzu soll der Urin von Patienten unter Anti Angiogenese Therapie bezüglich der glomerulären Proteinurie und der Ausscheidung von Podozyten im Urin (Podozyturie) untersucht werden.
Erkenntnisse aus dieser Arbeit könnten auch für weitere glomeruläre Erkrankungen von Bedeutung sein, wenn mehr über die VEGF abhängige Balance podozytärer
Signaltransduktionskaskaden, Podozytenschädigung und exogene Faktoren der Podozyturie herausgefunden wird.
2 Material
Tabelle 3: Verbrauchsmaterialen mit Herstellungsfirma
Material Herstellungsfirma
Zellkulturplatte (∅ 10 cm) Nunc
15 ml Polystyrene Conical Tube BD Falcon
50 ml Polystyrene Conical Tube SARSTEDT
Zellkulturflasche (75 cm2) CORNING Flask
Amersham Hyperfilm TM ECL GE
Analysewaage Sartorius
Bio Photometer Eppendorf
Brutschrank FUNKTION line Heraeus
Centrifuge 5415 C Eppendorf
Elektrophoresekammer MINI SUB CELL GT Herolab
Immobilon Transfer Membranes Millipore
Kamera/ UV für Agarosegel E.A.S.Y.RH3 Heraeus
MULTIFUGE 3S R Heraeus
Pipetten Research Eppendorf
Pipettenspitzen SARSTEDT
POWER Basic Bio Rad
POWER PAC 200 Bio Rad
Reader SUNRISE TECAN
Rolator SB3 Stuart
Schüttler RO 20 Gerhardt
Schüttler 3033 GFL
SDS Elektrophoresekammer Bio Rad
Spannungsgenerator für Elektrophorese Bio Rad
Thermomixer compact Eppendorf
UV Küvetten Eppendorf
Tabelle 4: Reagenzien mit zugehöriger Herstellungsfirma
Reagenzien Herstellungsfirma
Agarose Santa Cruz Biotechnology
Albumin bovine Fraction V, pH 7 BSA Serva
Ammoniumpersulfat (APS) Sigma
Apop Tag Red in Situ Apoptosis Detection Kit
(Equilibrationbuffer, Working Strength TdT Enzymen, Working Strength Stop/ Washbuffer, Anti Digoxigenin Conjugate, Reactionbuffer, Blockingsolution)
Calbiochem
BAC Protein Assay Kit Pierce
Biotaq DNA Poymerase Bioline
Bromphenolblau 0,175 mM Sigma
Collagen Type 1 BD Biosciences
Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche
Coral Loal PCR Buffer (10X) Promega
DEPC Wasser Ambion
Dimethylsulfoxid DMSO Sigma
DL Dithiothreitol (DTT) Sigma
D MEMF12 (Dubecco’s modified eagle medium) Invitogen
DNA Ladder 50 bp Bio Labs
DNA Ladder 100 bp Bio Labs
DNAse QIAGEN
dNTPs Promega
D PBS 10X 14200 Invitogen
D PBS ohne CaCl2 und MgCl2 Gibo
EDTA 0,1 M Merk
Essigsäure 1 M J.T. Baker
Ethanol Sigma
Ethidiumbromid J.T. Baker
Fetal Calf Serum (FCS) PAA Laboratories
Gibo MCDB 131 Medium Invitogen
Reagenzien Herstellungsfirma
Glucose Roth
Glutamine Roth
Glycerin 30 % Merck
Glycin 1,92 M Merck
Golgi Stop BD
High Performance Chemieelumineszenz Film Health Care
Human VEGF C ELISA BMS 297 Bender MedSystems
Hydroxyethyl 1 piperazinethansulfonsäure (HEPES) Sigma
Interferonγ Cell Sciences
ITS (Insulin Transferrin Selen) Sigma
Loading dye blue 6X Bio Labs
M DTT 0,6 (1,4 Dithiotheritol) Merck
Mercapto ethanol Roth
Methanol Roth
MgCl2 Promega
MMLV Reverse Transkriptase Promega
MMLV Puffer Promega
Na Desoxylcholate J.T. Baker
NaCl J.T.Baker
NaF 1 M Sigma
NaOH Sigma
Na3VO4 Sigma
n Dodecylsulfat Natriumsalz (SDS) Merck
Nonidet P 40/Tergitol Fluka
Normal donkey serum Jackson Immuno Research
Okadeinsäure Sigma
Oligos Promega
Page Ruler Protein Ladders (10 250 kDa) Fermentas
Penicillin/ Streptomycin Gibco
PFA Sigma
Reagenzien Herstellungsfirma
Polylysin Sigma
Polymorphprep AXIS SHIED
Precision Plus Protein Standard Roche
Proteasehemmer Roche
Protein agarose Santa Cruz
PVDF Membran Millipore Corporation
QIA quick Gel Extraction Kit Qiagen
QIA shredder 250 Kit QIAGEN
Quantikine human VEGF Immunoassay; DVE00 R&D Systems Quantikine human VEGFR 1 Immunoassay; DVR100B R&D Systems
Random primer Promega
RNase Away Molecular Bio Products
RNase Free DNase Set QIAGEN DNA Ladder
RNeasy Mini Kit 250 QIAGEN
RPMI 1640 Medium Roth
Saponin 2 % Roth
Super Signal West Pico Chemilumineszenz Pierce Super Signal West Pico Luminol/Enhancer Solution Pierce Super Signal West Pico Stable Peroxide Solution Pierce
TEMED Roth
Tetenal Roentgen Liquid Tetenal AG& Co KG
Tetenal Roentgen Superfix Tetenal AG& Co KG
Trichloressigsäure Bio Rad
Tris Base 2M Calbiochem
Tris HCL Puffer 0,5 M, pH 6,8 Bio Rad
Tris HCL Puffer 1,5 M, pH 8,8 Bio Rad
Triton X 100 Riedel de Haën
Trypsin /EDTA Solution Biochrom AG
Tween 20 Merck
Vectashied/DAPI Linaris Biogische Produkte
Tabelle 5: Rekombinate Proteine mit der Herstellerfirma
Protein Firma
Recombinant human VEGF B 167; 751 VE R&D Systems Recombinant human VEGF C Wild Typ; 2179 VC R&D Systems Recombinant human VEGF 165; CRV00B Cell Sciences
Tabelle 6: Abations Antikörper und Rezeptorinhibitoren
Ablations Antikörper + Rezeptor Inhibitoren Firma Anti human VEGF Antibody monoclonal mouse IgG;
MAB293
R&D Systems
VEGFR 2/ 3 Tyrosin Kinase Inhibitor; 676499 Calbiochem
SU 1498 Calbiochem
Bevacizumab Roche
VEGF C (C 20) goat polyclonal; sc 1881 Santa Cruz Biotechnology VEGF B (C 19) goat polyclonal # D1505 Santa Cruz Biotechnology
Tabelle 7: Primäre Antikörper mit Verdünnung, Herstellungsfirma und Molekulargewicht
Primärantikörper Verdünnung Firma Molekulargewicht
AKT1 (2H10) mouse monoclonal IgG1; #2967
1:1000 Cell Signaling 60 kDa
βTubulin (H 235) rabbit polyclonal; sc 9194
1:1000 Santa Cruz
Biotechnology
55 kDa
Flk 1(A 3): mouse polyclonal IgG; sc 6251
1:1000 Santa Cruz
Biotechnology
150/ 200 kDa
Flt 1 (C 17) rabbit polyclonal IgG; sc 316
1:1000 Santa Cruz
Biotechnology
180 kDa
Flt 4 (C 20) rabbit polyclobal; sc 321
1:1000 Santa Cruz
Biotechnology
150 kDa
GAPDH (FL 335): rabbit polyclonal IgG; sc 25778
1:1000 Santa Cruz
Biotechnology
37 kDa
Goat anti human podocalyxin IgG
1:40 Alpha Diagnostic Immunfluoreszenz
färbung
Primärantikörper Verdünnung Firma Molekulargewicht WT 1 (C 19) rabbit
polyclonal sc 192
1:40 Santa Cruz
Biotechnology
Immunfluoreszenz färbung
Phospho Akt (Ser 473) rabbit polyclonal IgG
1:1000 Cell Signaling 60 kDa
Phospho p44/42 MAPK (Thr202/ Tyr204) mouse monoclonal; 9106
1:1000 Cell Signaling 42/44 kDa
Podocalyxin rabbit polyclonal ; POdX11 A
1:40 Alpha Diagnostic Immunfluoreszenz färbung
Phosph p38MAP Kinase (Thr180/ Thy182)
1:1000 Cell Signaling 38 kDa
Rabbit Ig G Isotope Control; 0111 01
1:1000 Southern Biotech Immunfluoreszenz färbung
VEGF (147): rabbit polyclonal IgG; sc 507
1:1000 in 2 % BSA/TBST
Santa Cruz Biotechnology
15 kDa
VEGF B (H 70) rabbit polyclonal; sc 13083
1:1000 Santa Cruz
Biotechnology
Immunfluoreszenz färbung
VEGF C (C20) goat polyclonal; sc 1881
1:1000 Santa Cruz
Biotechnology
80 kDa
VEGF C (H190) rabbit polyclonal; sc 9047
1:1000 Santa Cruz
Biotechnology
80 kDa
VEGF B (C 19) goat polyclonal; sc 1876
1:1000 Santa Cruz
Biotechnology
Immunfluoreszenz färbung
VEGF B (C 19) goat polyclonal # D1505
1:1000 Santa Cruz
Biotechnology
Immunfluoreszenz färbung
P44/42 MAP Kinase rabbit polyclonal; 9102
1:1000 Cell Signaling 44/42 kDa
Tabelle 8: Sekundäre Antikörper mit eingesetzter Verdünnung und Herstellungsfirma
Sekundärantikörper Verdünnung Firma
Donkey anti goat IgG HRP 1:10000 Santa Cruz Biotechnology Donkey anti goat IgG Cy3 1:500 Jackson Immuno Research Donkey anti rabbit IgG Cy 3 1:500 Jackson Immuno Research Goat anti mouse IgG HRP 1:10000 Santa Cruz Biotechnology Goat anti rabbit IgG HRP 1:10000 Santa Cruz Biotechnology Donkey serum anti mouse cy3 1:500 Santa Cruz Biotechnology Biotin SP conjugated Affini Pure F (ab’)2
Fragment Donkey Anti Rabbit IgG; 711 066 152
1:200000 Jackson Immuno Research
Streptavidin Peroxidase, S 5512 1:500 Sigma
Tabelle 9: Primer mit Primersequenz, Annealingtemperatur und Basenpaarlänge des Transkriptionsproduktes
Primer Sequenz Annealing
Temperatur
Transkriptions produkt human NP 1 hin AAAAGCCCACGGTCATAG 55 °C
human NP 1 rück GGATTGCTGTGGATGACA 55 °C
503 bp
human NP 2 hin GTTCGAAGGGAACATGCACT 60,4 °C human NP 2 rück CCCTATCACTCCCTCGAACA 62,45 °C
688 bp
human VEGFR 3 hin
CATCATGCTGAACTGCTGGT 60,4 °C
human VEGFR 3 rück
TTGTAGGTCGTTGGGGTCAT 60,4 °C
360 bp
mouse NP 1 hin GAAGGCAACAACAACTATGA 56,3 °C mouse NP 1 rück ATGCTCCCAGTGGCAGAATG 62,45 °C
374 bp
mouse NP 2 hin AAGTGGGGGAAGGAGACTGT 62,45 °C 310 bp mouse NP 2 rück GTCCACCTCCCATCAGAGAA 64,5 °C
Primer Sequenz Annealing Temperatur
Transkriptions produkt mouse sFlt 1 hin ACACCGCGGTCTTGCCTTAC 64,5 °C
mouse sFlt 1 rück CAGCCTTTTGTCCTCCTGGC 64,5 °C
622 bp
mouse VEGFR 3 hin
CCACATCATGCAGAGTTGCT 60,4 °C
mouse VEGFR 3 rück
CAGGGTGTCCTCTGGGAATA 62,45 °C
506 bp
human sFLt 1 hin AACAGCAGGTGCTTGAAACC 60,4 °C human sFLt 1 rück TTTCTTCCCACAGTCCCAAC 60,4 °C
206 bp
human/ mouse VEGF A hin
CTACCTCCACCATGCCAAGT 62,45 °C
human/ mouse VEGF A rück
CGCCTCGGCTTGTCTCACAT 62,18 °C
597 bp
human/ mouse VEGFR 1 hin
CCCAATCAATGCCATACTGA 58,35 °C
human/ mouse VEGFR 1 rück
TAGATGGGTGGGGTGGAGTA 62,45 °C
507 bp
human/ mouse VEGFR 2 hin
GCATGGAAGAGGATTCTGGA 60,4 °C
human/ mouse VGFR 2 rück
AGGAGGAGAGCTCACTGTGG 64,5 °C
512 bp
human VEGF C hin
CTACAGATGTGGGGGTTGCT 62,45 °C
human VEGF C rück
TGGTGGTGGAACTTCTTTCC 60,4 °C
660 bp
mouse VEGF C hin
CTACAGATGTGGGGGTTGCT 62,45 °C
mouse VEGF C rück
CACAGCGGCATACTTCTTCA 60,4 °C
749 bp
Primer Sequenz Annealing Temperatur
Transkriptions produkt human VEGF B
hin
CCACCAGAGGAAAGTGGTGT 62,45 °C
human VEGF B rück
CCTTGGCAACGGAGGAAG 62,18 °C
524 bp
mouse VEGF B hin
AAGAAAGTGGTGCCATGGAT 58,35 °C
mouse VEGF B rück
CTTGGCAATGGAGGAAGC 59,9 °C
516 bp
human VEGF D hin
TGTAAGTGCTTGCCAACAGC 60,4 °C
human VEGF D rück
GTGGATTTTCCTCCTGCAAA 58,35 °C
163 bp
human VEGF E hin
TCTTGGCAAGGCTTTTGTTT 56,3 °C
human VEGF E rück
TGCTTGGGACACATTGACAT 58,35 °C
233 bp
mouse VEGF D hin
CCATTCAGACCCCAGAAGAA 60,4 °C
mouse VEGF D rück
GCAGCAGCTCTCCAGACTTT 62,45 °C
286 bp
mouse VEGF E hin
CGGTACCTAGAGCCAGATCG 64,5 °C
mouse VEGF E rück
CGTGGGACACACTGACATTC 62,45 °C
426 bp
3 Methoden
3.1 Experimenteller Teil
3.1.1 Zellkultur
Unter normalen Kulturbedingungen haben Podozyten nur ein beschränktes
Proliferationspotential. Die Experimente der vorliegenden Arbeit wurden daher mit konditionierten immortalisierten humanen und murinen Podozyten durchgeführt.
Die humanen Podozyten wurden freundlicherweise von der Children’s Renal Unit and Academic Renal Unit der University of Bristol/ Southmead Hospital Bristol (GB) zur Verfügung gestellt. Zur Methode der Gewinnung der humanen Podozyten sei auf die
Veröffentlichung “A conditionally immortalized human podocyte cell line demonstrating Nephrin and Podocin expression“ verwiesen (34). Mauspodozyten wurden in unserem Labor analog zu der Methode von isoliert (4).
Das Prinzip der Immortalisierung der humanen Podozyten beruht auf der Insertion einer
thermosensiblen Variante des SV 40 large T Antigens, das durch Temperatur gesteuert werden kann, in das Genom. Das Gen ist bei 33 °C aktiviert und bei 37 °C inaktiviert.
Primäre humane Podozyten in Kultur wurden retroviral mit dem SV 40 T Antigen transfiziert.
Die Selektion und die weitere Kultur wurden bei 33 °C durchgeführt. Aus den Zellen wurden dann mittels fraktionierter Verdünnung Subklone gewonnen, indem Zellen mit Plastikklonringen entnommen und in 24 Well Platten übertragen wurden. Anschließend folgte die Überführung in eine 75 cm² Zellkulturflasche.
Murine Podozyten wurden aus Immortotransgenen Mäusen gewonnen und in 75 cm² Zellkulturflasche mit Natriumacetat Kollagen Beschichtung kultiviert.
Beide Podozytentypen proliferierten bei 33 °C, 5 % CO2 und aktiviertem SV 40 T large Antigen in 12,5 ml RPMI 1640 Medium, das 10 % FCS und 1 % Penicillin/ Streptomycin enthielt.
Zusätzlich wurde dem Maus Podozyten Medium 0,1 % γ Interferon (10 Units/ml) und dem Medium der humanen Podozyten 1 % ITS (Insulin Transferrin Selen) hinzugefügt.
wurde das Medium abgesaugt, die Flasche mit 10 ml PBS gewaschen und durch die Zugabe von 5 ml Trypsin für 3 5 min wurden die Zellen von dem Flaschengrund gelöst. Die
Trypsinierungsreaktion wurde durch Zugabe von 5 ml 10 % FCS Medium gestoppt. Die Zellsuspension wurde in einen 15 ml Falkon überführt und 8 min bei 1.200 rpm zentrifugiert.
Die Zellen wurden anschließend in 5 7 ml Medium resuspendiert und 1 ml der Zellsuspension auf eine neue Flasche gegeben.
Durch Aussaat auf Zellkulturplatten und Kultivierung bei 37 °C und 5 % CO2 wurden die Podozyten in die Differenzierungsphase gebracht.
Bei dieser Temperatur exprimierten die Zellen podozytäre Proteine wie Synaptopodin, Nephrin und Podocin. Für weitere Versuche wurden die Podozyten in der Regel für 7 10 Tage bei 37 °C belassen. Jeden zweiten Tag wurde das Medium gewechselt.
Die Abb. 5A zeigt die Morphologie undifferenzierter humaner Podozyten in Kultur, die bei 33 °C wuchsen. Die Zellen waren klein und rundlich. Sie proliferierten und wuchsen in
pflastersteinartiger Weise. In der Abb. 5B sind 7 Tage differenzierte humane Podozyten gezeigt, die bei 37 °C wuchsen. Unter diesen Kulturbedingungen waren die Zellen sehr viel größer und breiteten sich nach allen Seiten aus.
Abb. 5: Undifferenzierte (A) und differenzierte (B) humane Podozyten in Kultur.
Aufnahme mit dem Durchlichtmikroskop. Zu sehen sind die Unterschiede in der Morphologie der undifferenzierten und differenzierten humanen Podozyten.
3.1.2
mRNA Isolierung aus PodotytenDie mRNA Isolierung wurde mit Hilfe des RNeasy Mini Kit 250 und des QIA shredder 250 Kit der Firma QIAGEN durchgeführt.
Der Arbeitsplatz wurde vor der mRNA Isolierung mit RNAse Away gereinigt. Die Zellen
wurden mit 700 l RLT Mercapto Gemisch lysiert und auf eine QIA Shredder Säule gegeben. Es folgte eine Zentrifugierung bei 11.000 rpm für 2 min. Die Säule, in der sich nun der „Zellschrott“
befand, wurde verworfen und der Auswurf mit 700 l eiskaltem 70 % igem Ethanol, das die mRNA ausfällte, versetzt. Die Probe wurde auf eine Mini Säule gegeben und diese 1 min zentrifugiert. In der Mini Säule sammelte sich nun die mRNA. Anschließend wurden 700 l RWI Puffer auf die Säule gegeben, 1 min zentrifugiert und der Auslauf verworfen.
Für den DNA Abbau wurden 80 l DNAse RDD Gemisch (1:8) auf die Säule gegeben und 15 min inkubiert, 1 min zentrifugiert und der Auslauf wieder verworfen. Dann wurden 500 l RW1 und zweimal RPE nacheinander mit zwischengeschalteter 1 minütiger Zentrifugierung bei 11.000 rpm auf die Säule gegeben und der Auslauf jeweils verworfen. Nach 2 minütiger
Trockenzentrifugierung wurde die RNA mit 30 l RNAse freiem Wasser in einem neuem Eppi aufgefangen.
Die mRNA Konzentration wurde photometrisch bestimmt. Die Messung der optischen Dichte erfolgte bei 260 nm und 280 nm. Unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors der mRNA und unter der Annahme, dass eine bei 260 nm gemessene optische Dichte von 1,0 einem mRNA Gehalt von 40 g entspricht, wurde die Konzentration der mRNA in g/ l berechnetet.
3.1.3
Umschreibung von mRNA in cDNA und PCRFür die folgende Umschreibung wurde 1 g mRNA eingesetzt und das Volumen mit RNAse freiem Wasser auf 28 l aufgefüllt. 2,3 l Oligos und 2,3 l Random Primer wurden jeder Probe zugefügt und 10 min bei 70 °C geschüttelt. Es folgte die Zugabe von 9,3 l M MLV Puffer, 2,3
l dNTPs und 9,3 l M MLV Reverse Transkriptase und eine Inkubation bei 42 °C für 90 min und 10 min bei 70 °C auf dem Heizschüttler. Ein Ansatz ohne Reverse Transkriptase diente zur Kontrolle auf genomische DNA Kontamination.
Nach den verschiedenen Temperaturschritten war aus der mRNA cDNA entstanden, die in der Polymerasekettenreaktion (PCR) vervielfältigt wurde. Die PCR wurde in einem Thermocycler mit einem vorher zusammengestellten Programm durchgeführt.
Jede PCR Probe bestand aus 1 l Probe bzw. Wasser als Negativkontrolle und 9,5 l Mastermix.
Tabelle 10: Mastermixansatz mit der Mengenangabe für eine Probe
Primer wurden mithilfe des Programms Primer 3 (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Massachusetts, USA) im Internet konzipiert, nachdem die DNA Sequenz der gesuchten Proteine identifiziert wurde (http://www.ensembl.org/index.html). Durch den Primer Blast auf der Internetseite des National Center for Biotechnology Information (NCBI) wurde ausgeschlossen, dass der Primer außer der gewünschten cDNA noch DNA Sequenzen anderer Proteine erkennt. Die Primer sind in Tabelle 8 zusammengestellt. Die PCR wurde nach
folgendem Schema durchgeführt:
2 min 95 °C 1 mal 15 sec 95 °C
30 sec 57 °C /54 °C 35 mal 45 sec 72 °C
5 min 72 °C 1 mal Gehaltene Temperatur am Ende: 8 °C
Substanz Menge
Coral Loal PCR Buffer (10x) 1,0 l
DEPC Wasser 5,8 l
dNTPs 0,5 l
MgCl2 1,0 l
Primer hin 0,5 l
Primer rück 0,5 l
Taq Polymerase 0,2 l
Für den Gelansatz wurden 1 g, 2 g oder 3 g Agarose in 100 ml 1x TAE Puffer gelöst, aufgekocht und mit Ethidiumbromid versehen. Die PCR Proben wurden zusammen mit dem Quick load 100 pb DNA ladder, der die Höhe von Molekulargewichten zwischen 15 kDa und 259 kDa anzeigte, auf den Agarosegelen aufgetragen. Das Gel wurde etwa 40 min bei 90 V laufen gelassen und dann unter der UV Lampe betrachtet.
Tabelle 11: Ansatz für den 50x Tris Acetat EDTA (TAE) Puffer mit Mengenangabe der Chemikalien
Chemikalie Menge
0,1 M EDTA 18,61 Na2 EDTA x 2H2O 1 M Eisessigsäure 57,1 ml
2 M Tris Base 242,2 g in 1 l dH2O
3.1.4
GelextraktionDie Herauslösung der Banden aus dem Agarosegel geschah für eine spätere Sequenzanalyse der DNA durch „seq lab“. Die im UV Licht leuchtenden Banden wurden mit Hilfe eines kleinen Skalpells aus dem Agarosegel herausgeschnitten. Die Extraktion der Banden geschah mit Hilfe des QIA quick Gel Extraction Kit der Firma Qiagen.
Zu jedem Eppi wurden 300 l QG Puffer gegeben und die Gelstücke bei 50 °C ca. 10 min gelöst.
Dann wurden die flüssigen Gelstücke jeweils mit 100 l Isopropanol auf die QIA quick Säule gegeben und 1 min bei 13.000 rpm zentrifugiert. Der Auslauf wurde verworfen und zu jeder Säule 500 l QG Puffer gegeben, wieder 1 min bei 13.000 rpm zentrifugiert und der Auslauf verworfen. Es folgte die Zugabe von 750 l mit Ethanol versetztem PE Puffer auf die Säulen und zwei Zentrifugierungsschritte bei 13.000 rpm für je 1 min.
Der Auslauf wurde wieder verworfen und cDNA durch 30 l EB Puffer, der für 5 min auf die in je einem neuen Eppi stehenden Säulen gegeben wurde, gewonnen.
3.1.5
Zelllysierung für die SDS ElektrophoreseDie Lysierung der Podozyten geschah mit RIPA Puffer, der zur Verhinderung der Abspaltung von Phosphatresten 1:100 mit Okadeinsäure versetzt war.
Tabelle 12: Substanzen für den Lysepufferansatz
Substanz Menge
1 M NaF 500 l
1x RIPA (0,6 g Tris in 100 ml bidest H2O (pH 7,5), 0,88 g NaCl, 0,1 g SDS, 0,5 g Na Desoxylcholate, 1 g Nonidet P 40/Tergitol)
10 ml
Na3VO4 100 l
Okadeinsäure 10 l auf 1 ml Puffer
Proteasehemmer (Roche) 1 Tablette
Die Zellen wurden mit diesem Puffer auf Eis mit Zellschabern abgekratzt und anschließend die Zellsuspension in einem Eppi für mindestens 1h bei 80°C gelagert.
3.1.6
Proteinbestimmung für den Western BlotEine Proteinbestimmung des Zelllysates war notwendig, damit später in jeder Tasche bei der Elektrophorese die gleiche Proteinmenge aufgetragen werden konnte.
Die in Lysepuffer aufgenommenen Zellen wurden langsam aufgetaut und 15 min bei 11.000 rpm bei 4 °C zentrifugiert. Die Überstände wurden abgenommen und die Proteinkonzentration im Zelllysat mit dem BSA Protein Assay Kit in einer 96 Well Platte bestimmt. Als Standard wurden jeweils 5 l der verschiedenen BSA Konzentrationen (5 mg/ml, 2 mg/ml, 1mg/ml, 0,5mg/ml 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml und 0 mg/ml) verwendet. Zu den Standards und zu den Proben wurden 200 l Working Reagenz (50A:1B) gegeben und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Photometrisch wurde die Extinktion der Proben und des Standards bei einer Wellenlänge von 540 nm im Tecan Sun Rise Gerät und dem Programm Tecan X Red plus bestimmt. Aus den Extinktionen der Standards wurde mit dem Programm Excel eine Eichgerade bestimmt und mit dieser die Konzentration der Proben berechnet.
