3.3 Statistik
4.1.16 Stimulierung humaner Podozyten mit verschiedenen exogenen VEGF Isoformen nach Ablation
Die Stimulierung mit verschiedenen VEGF Isoformen nach Ablation einer weiteren VEGF Isoform wurde nach dem Schema in Tabelle 20 des Methodenteils dieser Arbeit durchgeführt.
Der Vesuch sollte untersuchen, ob die Effekte der Neutralisierung einer VEGF Isoform durch eine andere VEGF Isoform kompensiert werden kann.
Auf eine Ablation von VEGF B und Stimulierung mit einer anderen VEGF Isoform wurde aufgrund des mangelnden Effektes einer alleinigen VEGF B Neutralisierung in humanen Podozyten verzichtet. Die graphischen Darstellungen in Abb. 27 zeigen für jeden Versuch die pAKT/AKT Ratio als gestreifte Säulen und die pp38/GAPDH Ratio als gepunktete Säulen.
VEGF A Stimulierung nach 16 stündiger VEGF C Ablation
7 Tage differenzierte humane Podozyten wurden nach vorangegangener 16 stündiger VEGF C Ablation (10 g/ml) mit 20 ng/ml VEGF A stimuliert.
Anfangs lag AKT aufgrund der 16 stündigen Neutralisierung von podozytärem VEGF C vollständig dephosphoryliert vor und p38 war aktiviert. Durch die folgende Stimulierung mit exogenem VEGF A konnte AKT wieder phosphoryliert werden. Bezüglich der Aktivierung von AKT war bei einer VEGF A Stimulierung mit vorangegangener VEGF C Ablation eine deutlich schwächere und später einsetzende Phosphorylierung zu zeigen als mit einer alleinigen VEGF A Stimulierung. Auch die durch VEGF C Ablation bedingte Phosphorylierung von p38 ließ sich durch exogenes VEGF A wieder umkehren. 4 h nach der Stimulierung mit VEGF A lag p38 wieder unphosphoryliert vor.
Exogenes VEGF A konnte somit die Effekte der podozytären VEGF C Neutralisierung bezüglich der anti apoptotischen und pro apoptotischen Signalwege rückgängig machen.
VEGF B Stimulierung nach 16 stündiger VEGF A Ablation oder VEGF C Ablation Exogenes VEGF B konnte weder den Effekt einer 16 stündigen podozytären VEGF A Ablation noch den einer VEGF C Neutralisierung beeinflussen. AKT wurde durch die VEGF B
Stimulierung nicht wieder phosphoryliert und die Aktivierung von p38 konnte durch die VEGF B Stimulierung nicht gesenkt werden (Daten nicht gezeigt).
VEGF C Stimulierung nach 16 stündiger VEGF A Ablation oder Bevacizumab Behandlung
Abb. 27B und C zeigen die Effekte einer VEGF C Stimulierung nach 16 stündiger VEGF A Ablation oder Bevacizumab Behandlung.
Die 16 stündige Ablation von podozytärem VEGF A sowie die Bevacizumabbehandlung führten zu einer vollständigen Dephosphorylierung von AKT und zu einer starken Phophorylierung von p38. Eine Stimulierung mit 5 ng/ml VEGF C konnte im Anschluss an die Ablation jedoch in beiden Fällen wieder eine Aktivierung des anti apoptotischen AKT hervorrufen und das pro apoptotische p38 dephosphorylieren.
Eine mögliche Kreuzreaktivität der verschiedenen VEGF Isoform Antikörper wurde
ausgeschlossen, indem rekombinantes VEGF A, B und C im Western Blot aufgetragen wurde und sich entsprechende Banden jeweils nur nach Einsatz des jeweils Isoform spezifischen Primärantikörpers zeigten (Abb. 27D).
Zusammenfassend lässt sich somit der pro apototische Effekt einer VEGF A oder einer VEGF C Ablation durch die jeweils andere VEGF Isoform kompensieren.
Abb. 27: Legende siehe Seite 88.
Bevacizumab + VEGF C
Abb. 27: Stimulierung mit verschiedenen VEGF Isoformen nach Ablation einer anderen VEGF Isoform.
Western Blot 7 Tage differenzierter humaner Podozyten. A) VEGF A Stimulierung (20 ng/ml) nach 16 stündiger VEGF C Ablation (10 g/ml), B) VEGF C Stimulierung (5 ng/ml) nach 16 stündiger VEGF A Ablation (5 g/ml), C) VEGF C Stimulierung (5 ng/ml) nach 16 stündiger Bevacizumab Behandlung (5 g/ml), D) Ausschluss einer Kreuzreaktivität zwischen den anti VEGF Antikörpern. Es wurden jeweils 10
g Protein aufgetragen. Rechts: Graphische Darstellung der Mittelwerte der pAKT/AKT Ratios und pp38/GAPDH Ratios ± SEM. Die pAKT/AKT Ratios der unbehandelten Zellen und die höchsten
pp38/GAPDH Ratios wurden auf 100 % gesetzt. Die Auswertung der Bandenintensitäten geschah mit dem Programm Quantity One. n = 3; * = p < 0,05 im Vergeleich zur alleinigen Ablation; ** = p < 0,001 im Vergeleich zur alleinigen Ablation; Student’s t Test; OD = optische Dichte.
ααααVEGFBααααVEGFAααααVEGFC
4.1.17 TUNEL Färbung zum Apoptosenachweis humaner Podozyten nach VEGF Ablation und VEGFR 2/ 3 Tyrosin Kinase Inhibierung
Nachdem VEGF abhängige Effekte in humanen Podozyten bislang nur bezüglich der aktivierten Signalkaskaden betrachtet wurden, sollte nun auch das Überleben der Zellen beziehungsweise ihr Bestreben, in Apoptose zu gehen, untersucht werden.
7 Tage differenzierte humane Podozyten, die auf Deckgläschen wuchsen, wurden mit VEGF Neutralisierungs Antikörpern, Bevacizumab und VEGFR 2/ 3 TKI behandelt und anschließend die TUNEL positiven Zellen im Vergleich zur Gesamtzellzahl bestimmt. Die Versuche wurden drei Mal unabhängig voneinander mit vergleichbaren Ergebnissen durchgeführt. TUNEL positive Zellen sind in den folgenden Abbildungen als grün fluoreszierende Zellkerne zu erkennen. Auf die Gesamtzellzahl ließ sich mittels blau fluoreszierender DAPI gefärbter Zellkerne schließen.
Für die TUNEL positiven Zellen und für die DAPI Färbung wurde jedes Mal ein repräsentativer Ausschnitt des Deckgläschens gezeigt.
VEGF A Neutralisierung:
Die humanen Podozyten wurden mit Konzentrationen von 0 10 g/ml des VEGF A Neutralisierungs Antikörpers für 16 h behandelt (Abb. 28A).
Während die Basisapoptoserate unbehandelter Zellen und die der rabbit IgG Kontrolle (Negativkontrolle) bei 1 5 % lag, gingen nach der Behandlung mit 1 g/ml VEGF A
Neutralisierungs Antikörper durchschnittlich 27 % der Zellen in Apoptose. 5 g/ml VEGF A Ablations Antikörper bewirkten, dass 31 % der Podozyten apoptotisch wurden und 10 g/ml steigerte die Apoptoserate auf nahezu 50 %. Die Ausgangszellzahl war vergleichbar, da überall die gleiche Menge an Zellen ausgesät worden war.
VEGF B Neutralisierung
Im Gegensatz zu dem zuvor betrachteten VEGF A Neutralisierungs Antikörper konnte durch die Ablation von podozytärem VEGF B in Konzentrationen von 0 bis 50 g/ml kein programmierter Zelltod nachgewiesen werden (Abb. 28B). Auch eine Konzentration von
100 g/ml hatte keine signifikanten Auswirkungen, da hier nur 2 % der Zellen apoptotisch wurden. Goat IgG, das als Negativkontrolle eingesetzt wurde, bewirkte ebenfalls keinen Zelltod.
VEGF C Neutralisierung:
Im Vergleich zum VEGF A Neutralisierungs Antikörper waren bei dem VEGF C
Neutralisierungs Antikörper deutlich höhere Konzentrationen nötig, um Apoptose in humanen Podozyten auszulösen. Bis zu einer Konzentration von 50 g/ml VEGF C Neutralisierungs Antikörper trat praktisch kein programmierter Zelltod ein. Erst eine Dosis von 100 g/ml des Ablations Antikörpers ließ die Apoptoserate auf durchschnittlich 14 % ansteigen. 1/100 der Konzentration war beim VEGF A Neutralisierungs Antikörper ausreichend, um die doppelte Apoptoserate zu bewirken.
Wie auch schon bei den vorangegangenen Versuchen hatte ein IgG Antikörper alleine keine Auswirkungen auf die Apoptose. Abb. 28 C zeigt die beschriebenen Ergebnisse.
„Bevacizumab Behandlung“:
Nachdem durch podozytäre VEGF A und VEGF C Ablation Apoptose in humanen Podozyten nachgewiesen werden konnte, sollte Bevacizmab hinsichtlich seines Apoptose auslösenden Potentials untersucht werden.
Auch Bevacizumab konnte ab einer Konzentration von 5 g/ml zu Apoptose führen. Niedrigere Konzentrationen und das NaCl, das als Negativkontrolle diente, hatten keinen programmierten Zelltod der humanen Podozyten zur Folge. 50 g/ml Bevacizumab bewirkten eine Apoptoserate von 27 %. Somit erzielte Bevacizumab geringeren Zelltod in humanen Podozyten als der getestete VEGF A Neutralisierungs Antikörper (Abb. 28 D).
VEGFR 2/ 3 Tyrosin Kinase Inhibierung:
Die Apoptoseraten, die durch den VEGFR 2/ 3 TKI in humanen Podozyten ausgelöst werden konnten, wurden wieder in Bezug auf die Gesamtzellzahl angegeben. Ethanol alleine, das als Negativkontrolle eingesetzt wurde, bewirkte keinen programmierten Zelltod. Durch die
Behandlung mit 100 nM VEGFR 2/ 3 TKI traten durchschnittlich 21 % aller humaner Podozyten in Apoptose. 76 % der Zellen zeigten eine positive TUNEL Färbung durch Behandlung mit 500 nM VEGFR 2/ 3 TKI (Abb. 28 E).
Abb. 28: TUNEL Färbung 7 Tage differenzierter humaner Podozyten nach verschiedener VEGF Ablation.
A) VEGF A Neutralisierungs Antikörper (αVEGF A), B) VEGF B Neutralisierungs Antikörper (αVEGF B), C) VEGF C Neutralisierungs Antikörper (αVEGF C), D) Bevacizumab, E) VEGFR 2/ 3 Tyrosin Kinase Inhibitor (VEGFR 2/ 3 TKI). Aufnahme mit dem Fluoreszenzmikroskop. Rechts: graphische Darstellung der Durchschnittswerte TUNEL positiver Zellen (% positiver Zellen) ± SEM der Versuche; n = 3.
A
Abb. 29 zeigt eine Vergrößerungsaufnahme eines TUNEL positiven humanen
Podozytenzellkerns exemplarisch für alle Ablationsversuche, die zur Apoptose führten. Der komplette Zellkern ist marmoriert grün gefärbt und die Nucleoli fluoreszieren besonders stark.
Zusammenfassend ließ sich also durch eine Neutralisierung von podozytärem VEGF A und C, sowie durch die Inhibierung der VEGF Signaltransduktionswege auf Rezeptorebene
programmierter Zelltod auslösen, wohingegen eine VEGF B Ablation keine Auswirkungen auf das podotytäre Überleben hatte.
Abb. 29: Vergrößerungsaufnahme eines apoptotischen TUNEL positiven Zellkerns exemplarisch für alle vorangegangenen Apoptoseversuche. Aufnahme mit dem Fluoreszenzmikroskop. A: DAPI Färbung; B:
A
B
4.1.18 TUNEL Färbung humaner Podozyten nach Ablation einer endogenen VEGF Isoform und Stimulierung mit einer anderen exogenen VEGF Isoform
Wie im Methodenteil beschrieben wurden differenzierte humane Podozyten mit dem VEGF A Ablations Antikörper alleine, oder in Kombination mit exogenem VEGF B oder exogenem VEGF C behandelt.
Das Ergebnis der TUNEL Färbung ist durch einen repräsentativen Ausschnitt der Deckgläschen in Abb. 30a dargestellt. In der oberen Zeile sind jeweils die TUNEL positiven Zellen in grün, in der mittleren Zeile die blau gefärbten DAPI Zellkerne und in der dritten Zeile eine
Übereinanderlegung beider Färbungen zu sehen. Rechts sind die Ergebnisse graphisch zusammengefasst.
VEGF A Ablation und Stimulierung mit exogenem VEGF C oder B
Exogenes VEGF C konnte die Anzahl an Podozyten, die durch eine Ablation von endogenem VEGF A in Apoptose gingen, signifikant verringern (p < 0,001). Die Apoptoserate sank durch gleichzeitige Stimulation mit VEGF C (5ng/ml) auf 15 % im Vergleich zur alleinigen VEGF A Ablation. Stimulierung mit 20 ng/ml VEGF B bei gleichzeitiger Ablation von podozytärem VEGF A erbrachte mit der alleinigen VEGF A Ablation vergleichbare Apoptoseraten.
VEGF C Ablation und Stimulierung mit exogenem VEGF A oder B
Des Weiteren wurden humane Podozyten auch mit dem VEGF C Ablations Antikörper alleine oder in Kombination mit exogenem VEGF A oder exogenem VEGF B behandelt (Abb. 30b).
20 ng/ml VEGF A konnte im Gegensatz zu VEGF B die durch 50 g/ml VEGF C Neutralisierungs Antikörper ausgelöste Apoptose nicht verringern:
Die VEGF C Ablation alleine und zusammen mit der VEGF B Stimulierung erbrachten
Apoptoseraten um 12 %. VEGF A konnte diese auf 8 % senken. Dieses Ergebnis war mit p< 0,05 signifikant (Student’s t Test).
Bevacizumab Behandlung und Stimulierung mit exogenem VEGF C oder B
Als nächstes wurde die kombiniere Behandlung humaner Podozyten mit 20 g/ml Bevacizumab und exogenem VEGF B bzw. exogenem VEGF C mit der alleinigen Bevacizumab Behandlung verglichen.
5 ng/ml VEGF C konnte das apototische Potential von Bevacizmab verringern. 5 g/ml des Antikörpers bewirkten eine Apoptoserate von 20 %, die durch die gleichzeitige Stimulierung mit exogenem VEGF C auf 5% gesenkt wurde. Dieses Reduktion der Apoptoserate war mit p <
0,001 hoch signifikant im Vergleich zur alleinigen Bevacizumab Behandlung. Eine VEGF B Stimulierung hatte keinen protektiven Effekt. (Abb. 30c).
Die Basisapoptoserate ohne Manipulation oder nach Stimulierung mit VEGF A, VEGF B oder VEGF C alleine war vernachässigbar gering (Abb. 30d).
Zusammenfassend lässt sich passend zu den dokumentierten Signaltransduktionsprozessen belegen, dass exogenes VEGF A die Folgen der podozytären VEGF C Neutralisierung
kompensiert und exogenes VEGF C die Neutralisierung von podozytärem VEGF A ausgleicht.
Diese Ergebnisse wurden im American Journal of Physiology publiziert (Müller Deile J,
Worthmann K, Saleem M, Tossidou I, Haller H, Schiffer M: The balance of autocrine VEGF A and VEGF C determines podocyte survival. 297: F1656 1667, 2009).
Abb. 30: TUNEL Färbung humaner Podozyten nach Ablation einer endogenen VEGF Isoform und Stimulierung mit einer anderen exogenen VEGF Isoform (a c). Grün: TUNEL positive Zellen, blau: DAPI Zellkerne. In der dritten Zeile wurden beide Färbungen je übereinander gelegt (rosa Zellkerne bei doppelter Positivität). Graphische Darstellung:
% an + Zellen ± SEM. n = 3; * = p < 0,05; ** = p < 0,001 im Vergleich zur alleinigen Ablation; n = nicht signifikant im Vergleich zur alleinigen Ablation; Student’s t Test. d) Graphische Darstellung der Basisapoptoserate ohne
Manipulation oder nach Stimulierung mit VEGF A,VEGF B oder VEGF C alleine.
VEGF C Ablation (50 g/ml) + VEGF B (20ng/ml) VEGF C Ablation (50 g/ml) + VEGF A (20ng/ml)
Bevacizumab (5 g/ml)
Bevacizumab (5 g/ml) + VEGF B (20ng/ml) Bevacizumab (5 g/ml) + VEGF C (5ng/ml)
B
Bevacizumab (20 g/ml) + VEGF B (20ng/ml) Bevacizumab (20 g/ml) + VEGF C (5ng/ml)
0
4.2 Klinischer Aspekt der Arbeit
Im klinischen Teil der Arbeit sollten die Effekte einer VEGF Ablation an Patienten unter Bevacizumab und Sunitinib Therapie bezüglich einer möglichen glomeruären Schädigung untersucht werden.
Die Tabelle 27 gibt eine Übersicht über die Daten der Studienteilnehmer, ihre Nierenfunktion und ihre Ausscheidung von Podozyten. Insgesamt nahmen 19 Bevacizumab Patienten, 8
Sunitinib Patienten und drei gesunde Kontrollpersonen an der Studie teil. Der Männeranteil war mit 53 % bei den Bevacizumab Patienten und 75 % bei den Sunitinib Patienten für beide Medikamente höher als der Frauenanteil. Bevacizumab Patienten litten unter verschiedenen intestinalen Tumoren und alle Sunitinib Patienten unter Nierenzellkarzinom.
Ein Bevacizumab Patient und drei Sunitinib Patienten waren einnierig. Die Bevacizumab Dosis der Patienten betrug 5 7,5 mg/kg und die Sunitinib Dosis war einheitlich 80 mg in einem 4 2 Regime (vier Wochen Therapie gefolgt von zweiwöchiger Therapiepause).
Insgesamt wurden 116 Blut und Urinproben von Patienten und 9 Proben von gesunden Kontrollpersonen untersucht.
4.2.1 Albuminausscheidung unter VEGF Ablationstherapie
Eine mögliche glomeruläre Schädigung unter VEGF Ablationstherapie sollte durch die Bestimmung der Albuminausscheidung untersucht werden. Um die Messwerte unter den
Patienten vergleichen zu können, wurde jeweils der Urin Albumin Kreatinin Ratio (UAC Ratio) berechnet.
In Abb. 31 sind die jeweils höchsten UAC Ratios der in der Studienzeit gemessenen Werte jedes Patienten dargestellt. Die waagerechten Linien geben die Mittelwerte der höchsten UAC Ratios der Patienten an. Die Grenzen für eine Mikrobuminurie (UAC Ratio 30 300 g/mg) und eine Makroalbuminurie (UAC Ratio >300 g/mg) sind durch Parallelen zur X Achse eingezeichnet.
Alle Studienteilnehmer hatten in der Beobachtungszeit von 8 Wochen pathologische UAC Ratios. 47 % der Bevacizumab Patienten und 63,5 % der Sunitinib Patienten hatten mindestens
Der Durchschnitt der in der Studienzeit gemessenen jeweils höchsten UAC Ratios aller
Bevacizumab und Sunitinib Patienten lag mit 284 g/mg für die Bevacizumab Patienten und mit 410 g/mg für Sunitinib Patienten ebenfalls im Bereich der Makroalbuminurie.
Der Unterschied zwischen den UAC Ratios der beiden Patientengruppen war signifikant (p <
0,001; Student’s t Test).
Abb. 31: Graphische Darstellung der jeweils höchsten UAC Ratios in der Studienzeit von Bevacizumab und Sunitinib Patienten. ** = p < 0,001; Student’s t Test.
Somit ist die UAC Ratio ein guter nicht invasiver Verlaufsparameter, der eine Beeinträchtigung der glomerulären Funktion der Patienten unter VEGF Ablationstherapie dokumentiert.
4.2.2 VEGF A in Blut und im Urin unter VEGF Ablationstherapie
Die VEGF Konzentration in der podozytären Umgebung ist nicht messbar. Deswegen wurde die VEGF A Konzentration in mehreren Blut und Urinproben repräsentativ für die jeweilige Patientengruppe von zwei Bevacizumab Patienten und drei Sunitinib Patienten
untersucht. Die VEGF A Konzentration im Blut von Patienten unter Bevacizumab Therapie war mit einem Durchschnittswert von 88 pg/ml deutlich niedriger als die VEGF A Konzentration im
U A C R a ti o i n g /m g
Blut von Sunitinib Patienten, die einen Mittelwert von 664 pg/ml erreichte.
Gesunde Kontrollpersonen hatten eine mittlere VEGF A Konzentration von 40 pg/ml im Blut.
Abb. 32A stellt die Verhältnisse graphisch dar.
Die VEGF A Konzentration im Urin wurde als VEGF A Kreatinin Ratio angegeben.
Bevacizumab Patienten hatten eine durchschnittliche VEGF A Kreatinin Ratio von 1.268 g/mg und lagen damit nahe dem, der bei der gesunden Kontrollgruppe ermittelt wurde (934 g/mg).
Bei den Patienten unter Sunitinib Therapie lag der Mittelwert der VEGF A Kreatinin Ratios im Urin bei 2.649 g/mg und war somit 1,5 Mal höher als der der Bevacizumab Patienten und der Kontrollgruppe. Abb. 32B stellt die VEGF A Kreatinin Ratios im Urin graphisch dar.
Abb. 32A: VEGF A Konzentration im Blut von Patienten unter Bevacizumab und Sunitinib Therapie sowie einer gesunden Kontrollgruppe.
A 1.000
800 600 400 200 0
V E G F A i n p g /m l
1.000 800 600 400 200 0
V E G F A i n p g /m l
Bevacizumab Sunitinib Kontrolle
Abb. 32B: VEGF A Kreatinin Ratio im Urin von Patienten unter Bevacizumab und Sunitinib Therapie sowie einer gesunden Kontrollgruppe.
Dieses Ergebnis verdeutlicht den unterschiedlichen Wirkungsort der beiden VEGF
Ablationstherapien: Bei beiden Patientengruppen ist aufgrund des Tumorleidens von einer erhöhten VEGF Produktion auszugehen. Bevacizumab ist ein Antikörper gegen VEGF A und reduziert somit die nachweisbare VEGF Konzentration im Blut. Sunitinib als
Thyrosinkinaseinhibitor wirkt hingegen erst auf Membranebene und beeinflusst somit die zirkulierende VEGF Konzentration nicht.
Zwischen dem VEGF A Kreatinin Ratio im Urin und der VEGF A Konzentration im Blut bestand sowohl bei den Bevacizumab Patienten als auch bei den Sunitinib Patienten nur eine schwache positive Korrelation. Der Korrelationsquotient r dieser beiden Parameter war bei den Bevacizumab Patienten 0,196 (mit einem Bestimmtheitsmaß von r² = 0,039) und bei den Sunitinib Patienten 0,111 (mit einem Bestimmtheitsmaß von r² = 0,012). Abb. 33A und B stellt diese Verhältnissse graphisch dar.
Bevacizumab Sunitinib Kontrolle V E G F A K re a ti n in R a ti o i n g /m g 1.000
4.000 3.000 2.000 1.000
0
urine
Abb. 33: Verhältniss zwischen VEGF A Kreatinin Ratio im Urin und VEGF Konzentration im Blut bei Bevacizumab Patienten (A) und Sunitinib Patienten (B).
Aufgrund der mangelnden Korrelation zwischen VEGF A Kreatinin Ratio im Urin und der VEGF A Konzentration im Blut ist neben der freien Filtration von VEGF im Glomerulum von weiteren beeinflussenden Faktoren wie der podozytäre VEGF Sekretion oder tubuläre
Sekretions und Rückresorptionsprozesse auszugehen.
VEGFAKreatininRatio ing/mg
VEGF A im Blut in pg/ml
A
B
r = 0,196
( r² = 0,039)
VEGFAKreatininRatio ing/mg
VEGF A im Blut in pg/ml Bevacizumab Patienten
Sunitinib Patienten
r = 0,111
(r² = 0,012)
4.2.3 Podozyturie bei VEGF Ablationstherapie
In dieser Arbeit konnten bei 8 von 19 Patienten unter Bevacizumab Therapie eine Ausscheidung von Podozyten mit dem Urin festgestellt werden. Insgesamt gab es bei 13 Urinproben dieser Patienten Podocalyxin und WT 1 doppeltpositive Zellen im Urin. Die Zellen konnten zum Teil in unterschiedlichen Urinproben des gleichen Patientens wiederholt kultiviert werden. Die Podozyten pro mg Urin Kreatinin der Patienten unter Bevacizumab Therapie lagen zwischen 0,12 und 10,56 Zellen/ mg Urin Kreatinin mit einem Mittelwert von 3,4 Zellen/ mg Urin
Kreatinin. Die Podozytenzahl des Patienten unter Sunitinib Therapie lag bei 5,6 Zellen/ mg Urin Kreatinin.
Abb. 34 zeigt beispielhaft eine Podocalyxin Färbung der Zellen, die im Urin der Patienten gefunden werden konnten, um die Vielfalt der Morphologie der Zellen darzustellen. Besonders im mittleren Bild sind die Fußfortsätze der Podozyten (Pfeile) zu erkennen. Im linken Bild haben sich einige Zellen abgekugelt.
Abb. 34: Podocalyxin positive Zellen aus dem Urin von Bevacizumab Patienten. Immunfluoreszenzfärbung.
Der Sekundärantikörper war Cy3 gekoppelt (rote Fluoreszenz). Aufnahme mit dem Fluoreszenzmikroskop.
Abb. 35 fasst die jeweils höchsten UAC Ratios und die Podozyturie jedes Patienten innerhalb der Studiendauer zusammen. Bei den umkreisten Punkten handelt es sich um Patienten, bei denen mindestens einmal im Laufe der Studiendauer eine Podozyturie festgestellt werden konnte. Die Zahlen neben den Kreisen geben die Podozyten pro mg Urin Kreatinin an.
Abb. 35: Darstellung der jeweils höchsten UAC Ratios und der Podozyturie der Patienten unter
Bevacizumab und Sunitinib Therapie. Umkreist sind diejenigen Patienten, die mindestens einmal während der Studiendauer eine Podozyturie hatten. Die Zahlenwerte geben die Podozyten pro mg Urin Kreatinin an.
In Abb. 36 ist das Verhältnis zwischen Podozyten im Urin pro mg Urin Kreatinin und den UAC Ratios der gleichen Urinproben der Bevacizumab Patienten dargestellt. Als Podozyten wurden Podocalyxin und WT 1 doppeltpositive Zellen definiert.
Die Korrelation zwischen den Podozyten im Urin pro mg Kreatinin und dem UAC Ratio war mit r = 0,25 sehr gering. Das Bestimmtheitsmaß r² diesen beiden Parametern betrug 0,063.
U A C R a ti o i n g /m g
Bevacizumab Sunitinib
0.12 0.27
10.56
4.5
1.92
4.1 4.2
2.26 6.3
5,6
0.27 2.44 3.77 3.77
Abb. 36: Graphische Darstellung des Verhältnisses zwischen den Podozyten im Urin pro mg Kreatinin (Y Achse) und den UAC Ratios (X Achse) der Bevacizumab Patienten.
Zusammenfassend wurde bei 42% der Patienten unter einer Bevacizumab Therapie eine Podozyturie nachgewiesen und bei allen Patienten erhöhte UAC Ratios gemessen.
Unter den Sunitinib Patienten befand sich nur einer mit Zellen im Urin, die sich durch podozytäre Marker anfärben ließen. Dieser Fall soll hier näher betrachtet werden:
Es handelte sich um einen 61 jährigen Patienten 9 Monate nach Therapiebeginn mit Sunitinib aufgrund eines metastasierenden Nierenzellkarzinoms.
Insgesamt waren im Urin des Patienten 13,8 Zellen pro mg Urin Kreatinin durch DAPI Zellkernfärbung zu finden. Von diesen waren 6,9 Zellen pro mg Urin Kreatinin Podocalyxin positiv. 5,6 Zellen pro mg Urin Kreatinin waren WT 1 positiv. Alle WT 1 positiven Zellen im Urin des Patienten waren auch Podocalyxin positiv (Abb. 37).
ll h m g c re a ti n in e
UAC Ratio in mg/mg 0
2 4 6 8 10 12
0 100 200 300
P o d o z y te n i m U ri n / m g K re a ti n in
UAC Ratio in g/mg
13.8
Abb. 37: Oben: Immunfluoreszenzfärbung mit Podocalyxin und WT 1 einer repräsentativen Zelle aus dem Urin eines Patienten unter Sunitinib Therapie. Der Sekundärantikörper von Podocalyxin war Cy3 gekoppelt (rote Fluoreszenz) und der Sekundärantikörper von WT 1 war FITC gekoppelt (grüne Fluoreszenz).
Aufnahme mit dem Fluoreszenzmikroskop. Unten: graphische Darstellung der unterschiedlichen Zellen im Urin des Patienten.
Das Nierenzellkarzinom befand sich bei Diagnosestellung im Stadium pT3a, pN2, L1, V1, G2 und war histologisch als gemischtzellig eingestuft worden. Trotz einer radikalen
Tumornephrektomie bestanden bereits Nebennierenmetastasen, V.a. pulmonale Filae und Kleinhirnmetastasen. Die Sunitinib Therapie wurde mit 50 mg im 4 2 Regime (4 Wochen Therapie gefolgt von 2 wöchiger Therapiepause) in Kombination mit IL 21 durchgeführt.
Nach 2 ½ Wochen wurde die IL 21 Therapie wegen Neutropenie abgebrochen und nur die Podocalyxin WT 1 übereinandergelegt
Die Therapie mit Sunitinib wurde in den ersten 9 Monaten von dem Patienten gut vertragen.
Abb. 38: Oben: Serum Kreatinin in mol/l (rosa) und Serum Harnstoff in mmol/l (blau) des Fallbeispiel Patienten unter Sunitinib Therapie. Unten: vergrößerter Ausschnitt aus der Abb. A mit Einzeichnung des Zeitpunktes der Podozyturie.
Die ersten 290 Tage nach Therapiebeginn mit Sunitinib lagen sowohl der Serum Harnstoff als auch das Serum Kreatinin im Normalbereich mit Werten um 70 80 mol/l Serum Kreatinin und
Die ersten 290 Tage nach Therapiebeginn mit Sunitinib lagen sowohl der Serum Harnstoff als auch das Serum Kreatinin im Normalbereich mit Werten um 70 80 mol/l Serum Kreatinin und