Endothel Podozyt
?
PI3K/ AKT p38 MAPK
Flt 1
GBM
Flk 1
Abb. 42: Schematische Darstellung der im Rahmen der vorliegenden Arbeit erlangten Ergebnisse zur parakinen und autokrinen Bedeutung von podozytären VEGF Isoformen.
5.2 Klinischer Teil
Anti Angiogenese Therapie gewinnt immer mehr an Bedeutung in der Behandlung
metastasierender Tumore. Viele neue Anti Angiogenese Medikamente inhibieren das VEGF System, da vom Tumor produziertes VEGF eine entscheidene Rolle im fortgeschrittenen Stadium der Tumorausbreitung spielt. Renale Nebenwirkungen der Anti VEGF Therapie sind zwar
beschrieben, ihr Einfluss auf Podozyten war bisher allerdings noch weitgehend unbekannt.
Durch die vorliegende Arbeit wurde auf verschiedene Weise erstmalig gezeigt, wie
unterschiedliche VEGF Isoformen für die physiologische Balance zwischen Apoptose und Zellüberleben von Podozyten bedeutsam sind.
Der Nachweis der Aktivierung pro apototischer Signalwege, die Reduktion von
Überlebenssignalen und schließlich die Induktion von Apoptose in kultivierten humanen Podozyten durch Bevacizumab werfen die Frage auf, inwieweit es unter einer systemischen VEGF A Ablationstherapie zu podozytärer Schädigung kommt.
Eine pathologische Situation, die der VEGF Ablationstherapie ähnelt, ist die Präeklampsie in der Schwangerschaft. Hier sind die Serum sVEGFR 1 Level der schwangeren Frauen erhöht. Wie bei einer VEGF Ablationstherapie neutralisiert sVEGFR 1 die Faktoren VEGF A und VEGF B und inhibiert somit die von diesen VEGF Isoformen ausgelösten Signalkaskaden. Ein Symptom der Präeklapsie ist die Entwicklung einer Proteinurie und die Ausscheidung von Podozyten (32).
Somit schien es interessant, die Nierenfunktion und eine mögliche Proteinurie und Podozyturie unter einer VEGF Ablationstherapie bei onkologischen Patienten zu untersuchen.
Renale Nebenwirkungen einer VEGF Ablationstherapie sind uneinheitlich beschrieben, da die Proteinurie in der Regel reversibel ist. In einigen Fällen wurde über die Entstehung eines
Nephrotischen Syndroms, eines aktuten Nierenversagens, einer interstitiellen Nephritis und einer thrombotischen Mikroangiopathie berichtet (47, 48).
In klinischen Studien wurde bei 0,7 38 % der mit Bevacizumab behandelten Patienten über eine Proteinurie berichtet, wobei es sich in der Mehrzahl um eine Proteinurie vom Grad I handelte.
1,4 % der Patienten entwickelten jedoch auch ein Nephrotisches Syndrom. Bei Patienten mit Hypertonie in der Anamnese liegt möglicherweise ein erhöhtes Risiko vor, unter Bevacizumab eine Proteinurie zu entwickeln.
Die meisten Fälle von Proteinurie, Bluthochdruck und Thrombotischer Mikroangiopathie in der Niere im Rahmen einer VEGF Ablationstherapie wurden nach der Behandlung mit Bevacizumab beschrieben. Ein Artikel des Nephrology Dialysis Transplantation berichtet hingegen von einem Fall, bei dem eine 44 jährige Frau nach der Behandlung mit Sunitinib diese Symptome
entwickelte (49).
Renale Nebenwirkungen einer VEGF Ablationstherapie sollten auch deshalb in dieser Arbeit näher betrachtet werden, da Sunitinib zu 16 % renal eliminiert wird und Studien zur
Gewebeverteilung von Bevacizumab ergaben, dass die Niere das Organ mit der höchsten Bevacizumab Konzentration pro Gramm Gewebe nach Gabe des Medikaments ist (Niere >
Hoden > Milz > Herz > Lunge > Thymus) (8).
Der Kreatininwert einer Urinprobe gilt als ein gängiges Maß für die Harnkonzentration und war daher als Korrekturfaktor für die Bestimmung von Parametern im Urin im Rahmen der
vorliegenden Arbeit geeignet.
Die Nierenwerte der Patienten unter Bevacizumab und Sunitinib Therapie wurden durch die Berechnung der Urin Albumin Kreatinin Ratios (UAC Ratio) beobachtet, um auf die Gewinnung von Sammelurin zu verzichten. Als Normalwert wurde eine Urin Albumin Kreatinin Ratio von unter 30 g/mg angesehen. Werte von 30 300 g/mg wurden in dieser Arbeit als mäßig
pathologisch gedeutet und eine Urin Albumin Kreatinin Ratio über 300 g/mg als hoch pathologisch.
Der Durchschnitt der in der Studienzeit gemessenen jeweils höchsten UAC Ratios aller Studien Patienten lag mit 284 g/mg für die Bevacizumab Patienten und mit 410 g/mg für Sunitinib Patienten somit im hoch pathologischen Bereich. Die Durchschnittswerte aller im
Studienzeitraum erfaßten UAC Ratios lagen jedoch bei beiden Patientengruppen im mäßig pathologischen Bereich.
Dies zeigt, dass es unter den VEGF Ablationstherapien gemessen an den UAC Ratios zu einer glomerulären Proteinurie kam.
Eine mögliche Podozyturie unter Bevacizumab oder Sunitinib Therapie war bisher nicht untersucht worden. Zu der in der vorliegenden Arbeit gewählten Methode der Kultivierung humaner Podozyten aus dem Urin von Patienten ist zu bemerken, dass diese Methode nur Zellen detektiert, die lebensfähig und in der Lage sind, über Nacht auf den Deckgläschen anzuhaften.
Ein weiteres Problem des Nachweises von Podozyten im Urin ist die Tatsache, dass nur einige wenige podozytäre Marker konstant genug sind, um im Urin weiter auf den Zellen exprimiert zu werden.
Podocalyxin war oft ein gängiger Marker zur Identifizierung von Podozyten (50).
wiesen darauf hin, dass Podocalyxin allein zwar ein guter Marker sei, parietale Epithelzellen des Glomerulums (parientale Podozyten) zu detektieren, aber dass nur in der Kombination mit WT 1 eine größere Sicherheit besteht, dass die Zellen von der viszeralen Seite des Glomerulums kommen (viszerale Podozyten) (51).
In der vorliegenden Arbeit wurde deswegen dem Rat gefolgt, zur Detektion von Podozyten im Urin eine Doppelfärbung mit Antikörpern gegen Podocalyxin und WT 1 durchzuführen, da beide
zusammen nicht auf parietalen Epithelzellen vorkommen und sich diese Marker auch in pathologischen Verhältnissen als relativ stabil erwiesen haben (51).
Bei 42 % der Bevacizumab Patienten dieser Studie konnten Podozyten im Urin, die durch positive Doppelfärbung identifiziert wurden, kultiviert werden. Die Podozyten pro mg Urin Kreatinin der Patienten unter Bevacizumab lagen zwischen 0,12 und 10,56 mit einem Mittelwert von 3,4.
Die Podozytenzahl pro mg Urin Kreatinin des Patienten unter Sunitinib Therapie lag bei 5,6.
Gesunde Kontollpersonen haben eine durchschnittliche Podozytenausscheidung von 0,32 Zellen pro mg Urin Kreatinin mit einem Median von 0 (n = 40). ' kamen sogar auf einen Mittelwert von nur 0,03 Podocalyxin positiver Zellen pro mg Urin Kreatinin bei Gesunden (52).
Somit wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass die VEGF Ablationstherapie zu einer im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen gesteigerten Podozytenaussscheidung führt, und dass diese durch die Methode der Kultivierung detektiert werden konnten.
Da davon ausgegangen wird, dass Podozyten nicht in der Lage sind zu proliferieren und ihr Regenerationspotential begrenzt ist, könnte eine Podzytenausscheidung als nicht invasiver Marker einer glomerulären Schädigung auf Podozytenebene bei Patienten unter einer VEGF Ablations Therapie dienen. Schon konnten parietale Epithelzellen im Urin als Indikator für die Krankheitsaktivität bei FSGS nachweisen (53).
In der vorliegenden Studie bestand nur eine schwach positive Korrelation von Urinpodozyten pro mg Kreatinin und der UAC Ratio (r = 0,251).
Auch ' /die die Podozytenausscheidung bei verschiedenen glomerulären Erkrankungen untersuchten, konnten unter den Patienten mit aktiver Krankheit (definiert als Urin Albumin/ Kreatinin Ratio > 300 g/mg) keine positive Korrelation zwischen Podozyten pro mg Kreatinin und UAC Ratio zeigen (52)
Unter den Sunitinib Patienten befand sich nur einer mit kultivierbaren Podocalyxin und WT 1 positiven Zellen im Urin. Dieser Patient hatte gleichzeitig eine FSGS und eine interstitielle Nephritis.
In der Literatur sind vereinzelt Fälle von akuter interstitieller Nephritis in Kombination mit Tyrosin Kinase Inhibitoren beschrieben worden. In einem Fall entwickelte eine 69 jährige
Patientin mit metastasierendem Nierenkarzinom im ersten Zyklus mit Sunitinib ein
Nierenversagen mit Proteinurie, Eosinophilie und Eosinophilurie. Diese Symptome passten am ehesten zu einer allergischen interstitiellen Nephritis (54).
Über einen Fall einer biopsiegesicherten akuten interstitiellen Nephritis wurde des Weiteren bei einem 54 jährigen Patienten am 21.Tag des ersten Sunitinib Therapiezyklus berichtet. Ein dritter Fall von interstitieller Nephritis in Kombination mit einer Therapie mit einem Tyrosin Kinase Inhibitor betrifft einen Patienten unter Sorafinib Therapie nach vorangegangener Therapie mit Sunitinib (55). Sorafenib ist ebenfalls ein Multi Kinaseinhibitor. Er hemmt sowohl die Raf Signalkaskade, wodurch es zu einer verminderten Zellteilung und Proliferation kommt, als auch den VEGF Signalweg, was zu in einer reduzierten Tumorangiogenese führt. Die genannten Fälle von interstitieller Nephritis traten alle innerhalb des 1. bis 2. Zyklus unter Sunitinib Therapie im
„4 weeks on 2 weeks off Schema“ auf. Dies entspricht einem Zeitraum von etwa 2 3 Monaten nach Therapiebeginn. Der in dieser Arbeit berichtete Fall einer interstitiellen Nephritis unter Sunitinib wurde erst 9 Monate nach Therapiebeginn durch eine Nierenbiopsie gesichert.
Auch die in der Literatur bekannten Fälle von thrombotischen Mikroangiopathien der Niere unter Sunitinib traten nicht sofort, sondern im Durchschnitt 6 Monate nach Therapiebeginn auf.
Neben der interstitiellen Nephritis und der Podozyturie bestand bei dem Patienten des
Fallberichtes der vorliegenden Arbeit eine FSGS. Eine niedrige renale VEGF Expression und erhöhte VEGF Ausscheidung bei FSGS wurde von . beschrieben (56). Die Autoren vermuteten, dass dies die Folge von Podozytenschädigung und Verlust von VEGF mit dem Urin sein könnte. Die VEGF Rezeptorinhibierung und eine erniedrigte VEGF Expression sind insofern vergleichbar, dass in beiden Fällen der VEGF Signalweg vermindert wird. Auch in der vorliegenden Arbeit konnte eine erhöhte VEGF A Ausscheidung bei dem Patienten mit FSGS unter Sunitinib gezeigt werden. Ob diese erhöhte VEGF A Exkretion direkt mit der FSGS zusammenhing oder die renale Elimination der aufgrund der Tumorproduktion generell
systemisch erhöhten VEGF A Menge widerspiegelte, bleibt offen.
Die systemische VEGF A Konzentrationen im Blut und der VEGF A Kreatinin Ratio im Urin von Bevacizumab Patienten, Sunitinib Patienten und gesunden Kontrollpersonen wurden in der vorliegenden Arbeit miteinander verglichen. Die Messung geschah zu einem Zeitpunkt, zu dem
Die tumorbedigte erhöhte systemische VEGF A Konzentration wurde durch Bevacizumab auf die Werte von gesunden Kontrollpersonen gesenkt. Die Werte der Patienten unter Sunitinib Therapie waren höher, da dieses Medikament erst auf Rezeptorebene wirkt.
Die gemessenen VEGF A Konzentrationen im Blut spiegelten jedoch nur die systemische Situation und nicht die des podozytären Milieus wieder.
Der VEGF A Kreatinin Ratio korrelierte unter VEGF Ablationstherapie weder mit der VEGF A Konzentration im Blut noch mit dem UAC Ratio in bedeutender Weise.
Die fehlende Korrelation lässt vermuten, dass sich mehr als nur eine einfache Filtration von systemischem VEGF in den VEGF Messungen des Urins widerspiegelt.
Von Podozyten sezerniertes VEGF A könnte in einer gewissen unbekannten Menge mit dem Urinfluss „weggewaschen“, nicht aber von dem Antikörper Bevacizumab neutralisiert werden, da dieser auf der endothelialen Seite wirkt. Bei der Messung der VEGF A Konzentration im Urin könnte somit auch von Podozyten produziertes VEGF A eine Rolle spielen.
In der vorleigenden Arbeit konnte nicht nur gezeigt werden, dass Bevacizumab in humanen Podozyten Apoptose auslöst, sondern auch, dass die gleichzeitige Gabe von exogenem VEGF C den durch Bevacizumab ausgelösten Zelltod signifikant reduzieren kann. Ebenso konnte die durch Bevacizumab in humanen Podozyten ausgelöste Dephosphorylierung des anti
apoptotischen AKT und die starke Aktivierung von p38 durch nachträgliche Stimulierung mit VEGF C rückgängig gemacht werden. Da nur einige Patienten unter Bevacizumab Therapie eine Podozyturie entwickelten, kann die Hypothese aufgestellt werden, dass Patienten, bei denen es nicht zur podozytären Schädigung als Nebenwirkung der Bevacizumab Therapie kam, eventuell mehr VEGF C im podozytären Milieu besaßen. Das VEGF C könnte bei diesen Patienten die Podozyten vor dem Zelltod durch Bevacizumab bewahrt haben. Dieser Hypothese könnte durch VEGF C ELISA Messungen im Blut und im Urin von Patienten unter VEGF Ablationstherapie in kommenden Studien nachgegangen werden.
Vielleicht kam es bei den Patienten, bei denen keine Podozyten im Urin gefunden wurden, aber ebenfalls zu einer Podozyturie, die allerdings aufgrund von Apoptose der Zellen mit Hilfe der Kultivierungsmethode nicht nachweisbar war.
So konnten bei vereinzelt durchgeführten Aufbereitungen von Urinen von Bevacizumab
Patienten mit der Dichtegradientenzentrifugierung und anschließender Färbung der Zellen ohne
vorangehende Kultivierung signifikant mehr Podocalyxin und WT 1 positive Zellen gefunden werden als mit der Kultivierungsmethode.
Ein Nachteil der Aufarbeitung des Urins mit der Dichtezentrifugierung war allerdings die Unspezifität der aufgereinigten Zellen. Neben den Podocalyxin und WT 1 positiven Zellen, die als viszerale Podozyten gedeutet wurden, gab es auch viele Zellen, die für beide
Podozytenmarker negativ und somit höchstwahrscheinlich keine Podozyten waren.
Albuminurie und Podozyturie bei einigen Patienten unter VEGF Ablationstherapie geben einen weiteren Anhalt dafür, dass die VEGF Signalkaskade für die Funktion der glomerulären
Filtrationsbarriere eine wichtige Rolle spielt. Die behandelnden Ärzte sollten sich der möglichen Nierenschädigung der Anti VEGF Therapie bewusst sein und die Nierenwerte der Patienten regelmäßig überprüfen.
Die Messung der Podozyturie und der UAC Ratios hat sich in dieser Arbeit als eine nützliche nicht invasive Methode erwiesen, mögliche glomeruläre Schädigung unter einer VEGF Ablationstherapie zu beobachten.
6 Zusammenfassung
Podozyten sind ein wichtiger Bestandteil der glomerulären Filtrationsbarriere und bedeutende Produzenten des Vascular Endothelial Growth Factors (VEGF) im Glomerulum. Die Rolle von VEGF für den Phänotyp des glomerulären Endothels und die parakrine Funktion von
podozytärem VEGF wurde bereits erforscht, wohingegen eine mögliche autokrine Bedeutung bisher noch nicht betrachtet wurde.
In dieser Arbeit wurde das VEGF System mit seinen zahlreichen Isoformen und Rezeptoren systematisch auf RNA und auf Proteinebene durch PCR, Western Blot, ELISA und
Immunfluoreszenzfärbung in kultivierten humanen Podozyten charakterisiert.
VEGF A und VEGF C konnten als die für den Podozyten bedeutsamsten VEGF Isoformen identifiziert werden, da die autokrinen Level beider Isoformen wichtig für die intrazelluläre Aktivierung von anti apoptotischem PI3K/AKT und Inhibierung der pro apoptotischen p38MAPK waren.
Die Stimulierung humaner Podozyten mit exogenem VEGF A und VEGF C führten zu einer zeitabhängigen Aktivierung der PI3K/AKT Signalkaskade, die VEGFR 2 vermittelt zu sein scheint. Eine Neutralisierung von endogenem VEGF A oder VEGF C sowie eine Behandlung mit Bevacizumab oder einem VEGFR 2/ 3 Tyrosin Kinase Inhibitor führte zu reduziertem Zellüberleben humaner Podozyten in Kultur. Im Gegensatz dazu hatte weder eine Stimulierung mit exogenem VEGF B noch eine Neutralisierung von podozytärem VEGF B Einfluss auf die anti oder pro apoptotischen Signalwege. Interessanterweise konnte exogenes VEGF A die Effekte einer podozytären VEGF C Ablation abmildern und exogenes VEGF C den Folgen einer podozytären VEGF A Ablation und einer Bevacizumab Behandlung entgegenwirken.
Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass es neben der bekannten parakrinen Wirkung von VEGF auf das Endothel eine autokrine Wirkung des Cytokins auf die Podozyten selbst gibt.
kam es bei Patienten unter einer VEGF Ablationstherapie mit Bevacizumab (Avastin) oder Sumatinib (Sutent) zu pathologischen UAC Ratios und teilweise zu einer Podozyten ausscheidung im Urin.
Die Messung der Podozyturie und der UAC Ratios hat sich als eine geeignete nicht invasive Methode erwiesen, glomeruläre Schädigung unter einer VEGF Ablationstherapie zu beobachten.
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