Die Studie zur Nierenfunktion und Ausscheidung von Podozyten bei Patienten unter VEGF Ablationstherapie mit Bevacizumab (Avastin®) oder Sunitinib (Sutent®) wurde mit 27 Patienten durchgeführt. Das Einverständnis, in die Studie aufgenommen zu werden, wurde zu Beginn schriftlich eingeholt. Urin und Plasmaproben für die Bestimmung von Serum Kreatinin, Serum Harnstoff, Urin Harnstoff, Urin Mikroalbumin und Urin Gesamtprotein wurden im zeitlichen Verlauf gesammelt.
Außerdem wurde versucht, aus den Urinproben der Patienten mögliche ausgeschiedene Podozyten zu kultivieren und später mit der Immunfluoreszenzmethode zu färben (siehe
„Gewinnung von Podozyten aus Urin“).
Als klinische und anamnestische Daten wurden folgende Parameter, soweit sie den
Patientenakten entnommen werden konnten, dokumentiert: Geschlecht, Alter, Größe, Gewicht,
Tumorart, Blutdruck, Einnierigkeit und Medikation.
Das Einschlusskriterium für die Patienten war die Indikationsstellung zur stationären oder ambulanten Bevacizumab oder Sunitinib Therapie in der onkologischen oder
gastroenterologischen Ambulanz der Medizinischen Hochschule Hannover.
Ein entsprechender Ethikantrag !" !" #
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*" (* $*&*+,+liegt der Ethikkommission der Medizinischen Hochschule Hannover unter der Nr. 243 vor und wurde am 29.01.2008 bewilligt.
3.2.1
Gewinnung von Urin und Plasmaproben für die Messung amOlympus
®3 ml Urin/Plasma wurden für 15 min bei 15.000 rpm bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde jeweils abgenommen, gevortext und in 500 l Alliquots bei 80 °C bis zur Messung am Olympus® Gerät eingefroren.
Die Bestimmung der Kreatininkonzentration in Plasma und Urin erfolgte nach der Jaffé Methode (kinetischer Farbtest). Hierbei bildet Kreatinin eine gelb orange Verbindung mit Pikrinsäure. Die Absorptionsabweichungsrate bei 520/800 nm ist proportional zur Kreatininkonzentration der Probe. Serum Harnstoff wurde durch einen kinetischen UV Test ermittelt. Harnstoff wird hierbei mit Wasser durch die Aktivität einer Urease zu Ammoniak und Kohlendioxid hydrolysiert.
Anschießend katalysiert die Glutamatdehydrogenase folgende Reaktion:
2 Oxoglutarat + 2 NADH + 2 NH4 → 2 L Glutamat + NAD+ + 2 H2O
Der Abfall der NADH Absorption pro Zeiteinheit ist zur Harnstoffkonzentration proportional.
Das Mikroalbumin in den Urinproben wurde mit einem immunturbidimetrischem Test gemessen, bei dem Albumin mit Antihuman Albumin Antikörpern reagiert und unlösliche Aggregate bildet, deren Absorption zur Albuminkonzentration proportional ist.
Ein photometrischer Farbtest, bei dem ein Pyrogallolrot Molybat Komplex alkalische
Aminogruppen von Proteinmolekülen bindet, diente der Bestimmung des Gesamtproteingehaltes
in den Urinproben. Da kein 24 h Urin von den Patienten gesammelt wurde, diente die Urin Albumin Kreatinin Ratio der Abschätzung der Proteinurie. Alle Urin und Plasmaproben wurden zwei Mal an unterschiedlichen Tagen gemessen, um Fehlmessungen zu minimieren.
3.2.2
Gewinnung von Podozyten aus UrinDer Urin wurde bei 1.200 rpm für 8 min zentrifugiert, der Überstand abgenommen und das Sediment in 10 ml HDF Lösung resuspendiert. HDF Lösung ist die Abkürzung für hochdichte Faserplattenlösung, die aus 37 mM NaCl, 5 mM K6, 5,5 mM Glucose, 4 mM NaHCO3 und 0,2 % EDTA besteht.
Das aufgenommene Sediment wurde wieder bei 1.200 rpm 8 min zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Das Sediment wurde anschließend in 10 ml Medium HEPES Gemisch
aufgenommen (HEPES = 4 (2 Hydroxylethyl) 1 piperazinethansulfonsäure).
Bei dem Medium handelte es sich um D MEMF 12 Medium, das 10 % FCS und 1 % Penicillin Streptomycin enthielt. Das Verhältnis von Medium zu HEPES betrug 1:4. Das resuspendierte Zellsediment wurde nun in gleichem Verhältnis auf 8 mit Kollagen beschichtete Deckgläschen in 32 Wellplatten verteilt. Es folgte eine Inkubation über Nacht bei +37 °C in einem CO2freien Brutschrank, damit mögliche Podozyten im Urin an die Deckgläschen anwuchsen. Am nächsten Tag wurden die Deckgläschen dreimal mit PBS gewaschen und anschließend für 10 min mit je 1 ml eiskaltem Methanol bei 20 °C fixiert. Bis zur folgenden Färbung wurden die Deckgläschen bei +4 °C in PBS gelagert. Die Färbung wurde analog zu der oben beschriebenen Technik zum VEGF System auf humanen Podozyten durchgeführt.
Als primäre Antikörper wurden die Podozytenmarker Goat anti Podocalyxin in PBS und WT 1 in PBS je mit einer Konzentration von 1:40 eingesetzt. Als sekundärer Antikörper dienten der rot fluoreszierende Antikörper anti goat Cy3 (für Podocalyxin) und der grün fluoreszierende anti rabbit FITC (für WT 1), die in einem Verhältnis von 1:500 in PBS verdünnt wurden. Von jeder Urinprobe wurden je zwei Deckgläschen unabhängig zu unterschiedlichen Zeitpunkten gefärbt.
Alle Objektträger wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet und die fluoreszierenden Zellen gezählt.
3.2.3
Polymorphprep für die Isolierung von Podozyten im Urin3 ml Polymorphprep wurden in ein 15 ml Falcon pipettiert und 3 ml Urin vorsichtig auf das Polymorph gegeben, sodass sich die beiden Phasen nicht vermischten. Das Falcon wurde 30 min bei 1.500 rpm ohne Bremse und ohne Anlauf bei Raumtemperatur zentrifugiert. Es entstand ein weißer Ring, der vorsichtig abpipettiert wurde und mit 3 ml PBS bei 2.000 g 8 min zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde abgesaugt und der Zellüberstand in 300 l PBS resuspendiert.
Als Objektträger dienten Menzel Gläser Diagnostika von Thermoscientific.
Diese wurden mit Ethanol geputzt und anschließend mit Polylysin 15 min beschichtet. Je 100 l des resuspendierten Zellüberstandes wurden auf eine runde Vertiefung des Objektträgers gegeben und 20 min stehen gelassen. Die Objektträger wurden 20 min mit eiskaltem Methanol fixiert und anschließend bis zur Färbung in PBS stehen gelassen.
3.2.4
Messung von VEGF A im Blut und Urin von Bevacizumab oder Sunitinib PatientenDie VEGF A Konzentration im Blut und im Urin von Patienten unter Sunitinib oder
Bevacizumab Therapie mit dem oben beschrieben VEGF A ELISA diente dazu, die Ergebnisse der Nierenwerte und der Podozytendetektion unter Berücksichtigung des Wachstumsfaktors vergleichen zu können.