VEGF Isoformen in humanen Podozyten

In der Literatur gibt es recht widersprüchliche Angaben über das Vorkommen und die Bedeutung von VEGF und seiner Rezeptoren für Podozyten. Daher sollten in der vorliegenden Arbeit die Expression der VEGF Familienmitglieder in humanen und murinen Podozyten systematisch untersucht werden.

Auf mRNA Ebene wurden bei murinen und humanen Podozyten die VEGF A Splicevarianten

121, 145, 165 und 189 nachgewiesen. Die Expression dieser VEGF A Splicevarianten konnte auch auf Proteinebene (mit Ausnahme von VEGF A₁₄₅) nachgewiesen werden, was ein weiterer Hinweis dafür ist, dass Podozyten diese VEGF A Splicevarianten besitzen. Der im Western Blot zum Nachweis von VEGF A eingestzte Antikörper war zwar spezifisch, erkannte allerdings nur die VEGF A Splicevarianten 121, 165 und 189. Eine Aussage darüber, ob Podozyten VEGF A145 nicht nur als mRNA, sondern auch als Protein exprimieren, ist somit aufgrund der mangelnden Detektionsfähigkeit des eingesetzten Antikörpers nicht möglich.

Durch die Behandlung humaner Podozyten mit einem Proteintransportinhibitor konnte die VEGF A Konzentration in Zellen zumindest für die Splicevarianten 189 und 121 erhöht werden,

da entsprechende Western Blot Banden nach der Behandlung stärker nachweisbar waren.

Dieses Ergebnis ist ein erster Hinweis darauf, dass diese VEGF A189 und VEGF A121 von Podozyten sezerniert werden, was durch den Einsatz eines Golgi Inhibitors verhindert wurde.

Neben der PCR und dem Western Blot war die positive Immunfluoreszenzfärbung für VEGF A in undifferenzierten und in differenzierten humanen Podozyten ein weiterer Hinweis dafür, dass Podozyten VEGF A bilden. Der vierte Nachweis von podozytärem VEGF A gelang mittels eines spezifischen ELISAs. Mit diesem waren auch quantitative Aussagen über die Sekretion von VEGF A in Zellkulturüberstand möglich. Es konnte gezeigt werden, dass humane Podozyten dreimal mehr VEGF C als VEGF A sezernieren.

Auch andere Forschergruppen konnten die Expression von VEGF A sowohl auf mRNA als auch auf Proteinebene in Podozyten nachweisen (30). Dort wurden allerdings nur murine Podozyten betrachtet. In der vorliegenden Arbeit gelang der Nachweis von VEGF A nicht nur in murinen, sondern auch in humanen Podozyten.

Erstmalig konnten in dieser Arbeit zwei VEGF B Splicevarianten auf mRNA und auf Proteinebene in Podozyten nachgewiesen werden. Bei diesen handelte es sich um VEGF B₁₈₆ und VEGF B167, die sowohl bei differenzierten murinen Podozyten als auch bei differenzierten humanen Podozyten im Zelllysat gefunden wurden. Auf Proteinebene bildeten diese beiden Splicevarianten auch Homodimere. Ein Proteintransportstopp auf Golgi Eben führte nicht zu einer im Western Blot sichtbaren Akkumulation von VEGF B in den humanen Podozyten. Durch Ausfällung von Proteinen im Zellkulturüberstand humaner Podozyten ließ sich VEGF B nicht nachweisen. Eine Erkärung hierfür wäre, dass Podozyten VEGF B zwar exprimieren aber nicht oder nur in geringer Menge sezernieren und die Methode des Western Blots nicht sensitiv genug war. Ein VEGF B ELISA, der sensitiver gewesen wäre, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht zuverlässig etabliert werden. Somit sind keine sicheren Aussagen über die VEGF B Sekretion von Podozyten zu treffen.

Eine positive Immunfluoreszenzfärbung als ein weiterer Hinweis für podozytäres VEGF B war hingegen bei undifferenzierten und auch bei differenzierten humanen Podozyten möglich.

Derzeitig gibt es neben der vorliegenden Arbeit und der Veröffentlichung der Autorin keine weiteren Veröffentlichungen über VEGF B in Podozyten.

VEGF C mRNA konnte in murinen und humanen Podozyten nachgewiesen werden. Auf Proteinebene ließen sich im Western Blot mehrere Spaltprodukte dieser VEGF Isoform finden.

Ein Proteintransportinhibitor bewirkte eine Verringerung der Bandendensitäten für die kleineren VEGF C Spaltprodukte. Von diesen ist bekannt, dass sie erst nach dem Golgi Apparat gebildet werden und anschließend sezerniert werden. Somit waren sie nach der Behandlung mit dem Golgi Inhibitor im Zelllysat nicht mehr nachweisbar.

Ein spezifischer VEGF C ELISA von Kulturüberstand humaner Podozyten bestätigte die Sekretion von VEGF C durch humane Podozyten, die drei Mal höher als die podozytäre VEGF A Sekretion war. Dies mag zum einen an einer generell höheren Sekretionsrate von VEGF C liegen. Nahe liegend ist aber auch, den Unterschied mit der löslichen Variante des VEGFR 1 zu erklären. In dieser Arbeit konnte eine erhebliche Konzentration von sVEGFR 1 im

Zellkulturüberstand humaner Podozyten durch einen spezifischen ELISA gemessen werden, was zeigt, dass Podozyten die lösliche Variante des Rezeptors sezernieren. sVEGFR 1 neutralisiert VEGF A, das an diesen Rezeptor bindet, nicht aber VEGF C, das nur an den VEGFR 2 und an den VEGFR 3 bindet. Somit könnte es auch sein, dass durch den ELISA sVEGFR 1 gebundenes VEGF A nicht detektiert wurde und die gemessene Menge so niedriger ausfiel als die wirklich vorhandene.

Immunfloreszenzfärbungen waren für VEGF C in undifferenzierten und in differenzierten Podozyten positiv. Die beschriebenen Ergebnisse sind starke Argumente für eine podozytäre VEGF C Expression. Im Einklang stehen diese Erkentnisse mit Ergebnissen von ., die ebenfalls die Expression von VEGF C in humanen Podozyten zeigen konnten (35).

VEGF D ist bisher nur im lymphatischen Gewebe beschrieben worden (18).

Erstmalig wurde im Rahmen dieser Arbeit VEGF D und erstaunlicherweise auch VEGF E bei differenzierten murinen und humanen Podozyten auf mRNA Ebene nachgewiesen und

gleichzeitig die Verunreinigung der mRNA Proben sowie der fälschliche Nachweis von genomischer DNA ausgeschlossen.

Der positive Nachweis für VEGF E ist insofern bemerkenswert, da diese Isoform bisher nur im Orfvirus beschrieben wurde. Der Nachweis von VEGF E mRNA in Podozyten kann zum einen so gedeutet werden, dass die Zellen mit dem Virus infiziert waren oder dass die Zellen diese VEGF Isoform selber bildeten.

An dieser Stelle sei auf eine Veröffentlichung von - % . verwiesen, die die Hypothese aufstellte, dass das zelluläre VEGF E Gen im vertebralen Genom ähnlich wie das Parapoxvirus OV IL 10 –Gen existiert und in gewissen Perioden oder speziellen Geweben im

embryonalen oder postnatalen /erwachsenen Stadium benutzt wird (36) Es wird vermutet, dass das OV Protein in seiner Evolution vom Schaf, das als Wirt diente, aufgenommen wurde (37).

5.1.2 VEGF Rezeptoren in humanen Podozyten

Auf mRNA Ebene konnten in dieser Arbeit der VEGFR 1 in seiner löslichen und

membranständigen Variante, der VEGFR 2, der VEGFR 3 und die Korezeptoren NP 1 und NP 2 in differenzierten murinen und humanen Podozyten nachgewiesen werden. Auf Proteinebene konnten alle drei Hauptrezeptoren bei murinen und humanen Podozyten durch entsprechende Banden im Western Blot bestätigt werden. Mehrere Banden für die membranständigen VEGFR 1, VEGFR 2 und den VEGFR 3 waren auf unterschiedliche Glykolysierungsstadien dieser Rezeptoren zurückzuführen.

Wie Western Blots von Zelllysat unterschiedlich lang differenzierter humaner Podozyten zeigten, werden alle drei VEGF Rezeptoren erst ab dem siebten Differenzierungstag in signifikanter Proteinmenge exprimiert. Die fehlende Rezeptorexpression bei undifferenzierten humanen Podozyten und die membranständige Lokalisation der drei Rezeptoren bei differenzierten humanen Podozyten wurden auch durch entsprechende Immunfluoreszenzfärbungen gezeigt.

Die Ergebnisse stehen somit im Widerspruch zu denen von ., die den VEGFR 2 in humanen Podozyten nicht nachweisen konnten (16).

Im Einklang stehen die Erkenntnisse dieser Arbeit mit dem Nachweis der Expression aller VEGF Rezeptoren (außer VEGF Rezeptor 3, der nicht untersucht wurde) auf mRNA Level durch (30)Die Proteinexpression wurde von nicht untersucht.

Die Ergebnisse dieser Arbeit zur Expression von VEGF Isoformen und VEGF Rezeptoren in Podozyten sind in der Abb. 41 schematisch zusammengefasst.

VEGFR 1 VEGFR 2

VEGFR 3

VEGF A mRNA VEGF C mRNA VEGF B mRNA

VEGF A protein VEGF C protein VEGF B protein

?

VEGF A mRNA VEGF C mRNA VEGF B mRNA

VEGF A protein VEGF C protein VEGF B protein

?

Abb. 41: Zusammenfassende schematische Darstellung der im Rahmen dieser Arbeit erlangten Ergebnisse zur podozytären Expression von VEGF Isoformen und VEGF Rezeptoren auf mRNA Ebene und auf Proteinebene.