4.2 Klinischer Aspekt der Arbeit
4.2.3 Podozyturie bei VEGF Ablationstherapie
In dieser Arbeit konnten bei 8 von 19 Patienten unter Bevacizumab Therapie eine Ausscheidung von Podozyten mit dem Urin festgestellt werden. Insgesamt gab es bei 13 Urinproben dieser Patienten Podocalyxin und WT 1 doppeltpositive Zellen im Urin. Die Zellen konnten zum Teil in unterschiedlichen Urinproben des gleichen Patientens wiederholt kultiviert werden. Die Podozyten pro mg Urin Kreatinin der Patienten unter Bevacizumab Therapie lagen zwischen 0,12 und 10,56 Zellen/ mg Urin Kreatinin mit einem Mittelwert von 3,4 Zellen/ mg Urin
Kreatinin. Die Podozytenzahl des Patienten unter Sunitinib Therapie lag bei 5,6 Zellen/ mg Urin Kreatinin.
Abb. 34 zeigt beispielhaft eine Podocalyxin Färbung der Zellen, die im Urin der Patienten gefunden werden konnten, um die Vielfalt der Morphologie der Zellen darzustellen. Besonders im mittleren Bild sind die Fußfortsätze der Podozyten (Pfeile) zu erkennen. Im linken Bild haben sich einige Zellen abgekugelt.
Abb. 34: Podocalyxin positive Zellen aus dem Urin von Bevacizumab Patienten. Immunfluoreszenzfärbung.
Der Sekundärantikörper war Cy3 gekoppelt (rote Fluoreszenz). Aufnahme mit dem Fluoreszenzmikroskop.
Abb. 35 fasst die jeweils höchsten UAC Ratios und die Podozyturie jedes Patienten innerhalb der Studiendauer zusammen. Bei den umkreisten Punkten handelt es sich um Patienten, bei denen mindestens einmal im Laufe der Studiendauer eine Podozyturie festgestellt werden konnte. Die Zahlen neben den Kreisen geben die Podozyten pro mg Urin Kreatinin an.
Abb. 35: Darstellung der jeweils höchsten UAC Ratios und der Podozyturie der Patienten unter
Bevacizumab und Sunitinib Therapie. Umkreist sind diejenigen Patienten, die mindestens einmal während der Studiendauer eine Podozyturie hatten. Die Zahlenwerte geben die Podozyten pro mg Urin Kreatinin an.
In Abb. 36 ist das Verhältnis zwischen Podozyten im Urin pro mg Urin Kreatinin und den UAC Ratios der gleichen Urinproben der Bevacizumab Patienten dargestellt. Als Podozyten wurden Podocalyxin und WT 1 doppeltpositive Zellen definiert.
Die Korrelation zwischen den Podozyten im Urin pro mg Kreatinin und dem UAC Ratio war mit r = 0,25 sehr gering. Das Bestimmtheitsmaß r² diesen beiden Parametern betrug 0,063.
U A C R a ti o i n g /m g
Bevacizumab Sunitinib
0.12 0.27
10.56
4.5
1.92
4.1 4.2
2.26 6.3
5,6
0.27 2.44 3.77 3.77
Abb. 36: Graphische Darstellung des Verhältnisses zwischen den Podozyten im Urin pro mg Kreatinin (Y Achse) und den UAC Ratios (X Achse) der Bevacizumab Patienten.
Zusammenfassend wurde bei 42% der Patienten unter einer Bevacizumab Therapie eine Podozyturie nachgewiesen und bei allen Patienten erhöhte UAC Ratios gemessen.
Unter den Sunitinib Patienten befand sich nur einer mit Zellen im Urin, die sich durch podozytäre Marker anfärben ließen. Dieser Fall soll hier näher betrachtet werden:
Es handelte sich um einen 61 jährigen Patienten 9 Monate nach Therapiebeginn mit Sunitinib aufgrund eines metastasierenden Nierenzellkarzinoms.
Insgesamt waren im Urin des Patienten 13,8 Zellen pro mg Urin Kreatinin durch DAPI Zellkernfärbung zu finden. Von diesen waren 6,9 Zellen pro mg Urin Kreatinin Podocalyxin positiv. 5,6 Zellen pro mg Urin Kreatinin waren WT 1 positiv. Alle WT 1 positiven Zellen im Urin des Patienten waren auch Podocalyxin positiv (Abb. 37).
ll h m g c re a ti n in e
UAC Ratio in mg/mg 0
2 4 6 8 10 12
0 100 200 300
P o d o z y te n i m U ri n / m g K re a ti n in
UAC Ratio in g/mg
13.8
Abb. 37: Oben: Immunfluoreszenzfärbung mit Podocalyxin und WT 1 einer repräsentativen Zelle aus dem Urin eines Patienten unter Sunitinib Therapie. Der Sekundärantikörper von Podocalyxin war Cy3 gekoppelt (rote Fluoreszenz) und der Sekundärantikörper von WT 1 war FITC gekoppelt (grüne Fluoreszenz).
Aufnahme mit dem Fluoreszenzmikroskop. Unten: graphische Darstellung der unterschiedlichen Zellen im Urin des Patienten.
Das Nierenzellkarzinom befand sich bei Diagnosestellung im Stadium pT3a, pN2, L1, V1, G2 und war histologisch als gemischtzellig eingestuft worden. Trotz einer radikalen
Tumornephrektomie bestanden bereits Nebennierenmetastasen, V.a. pulmonale Filae und Kleinhirnmetastasen. Die Sunitinib Therapie wurde mit 50 mg im 4 2 Regime (4 Wochen Therapie gefolgt von 2 wöchiger Therapiepause) in Kombination mit IL 21 durchgeführt.
Nach 2 ½ Wochen wurde die IL 21 Therapie wegen Neutropenie abgebrochen und nur die Podocalyxin WT 1 übereinandergelegt
Die Therapie mit Sunitinib wurde in den ersten 9 Monaten von dem Patienten gut vertragen.
Abb. 38: Oben: Serum Kreatinin in mol/l (rosa) und Serum Harnstoff in mmol/l (blau) des Fallbeispiel Patienten unter Sunitinib Therapie. Unten: vergrößerter Ausschnitt aus der Abb. A mit Einzeichnung des Zeitpunktes der Podozyturie.
Die ersten 290 Tage nach Therapiebeginn mit Sunitinib lagen sowohl der Serum Harnstoff als auch das Serum Kreatinin im Normalbereich mit Werten um 70 80 mol/l Serum Kreatinin und 4 5 mmol/l für den Serum Harnstoff. Dann stieg das Serum Kreatinin innerhalb weniger Tage auf 583 mol/l und der Serum Harnstoff auf 30,1 mmol/l.
Abb. 38 stellt den zeitlichen Verlauf des Serum Kreatinin (in rosa) und des Serum Harnstoff (in blau) des Patienten graphisch dar. Auf der X Achse sind die Tage seit Therapie mit Sunitinib aufgetragen, auf der linken Y Achse die Serum Kreatininwerte in mol/l und auf der rechten Y Achse die Serum Harnstoffwerte in mmol/l. Der 10. und 11. Monat nach Therapiebeginn ist noch einmal vergrößert hervorgehoben, um den Anstieg der Nierenwerte genauer zu verdeutlichen.
Parallel zu dem drastischen Anstieg der Nierenparameter konnten im Urin die oben
beschriebenen und in Abb. 34 beispielhaft dargestellten Zellen kultiviert und gefärbt werden. Der Patient fiel außerdem durch eine große Proteinurie von 9 g/d zeitgleich mit der Ausscheidung der Zellen auf. Der Albumin Kreatinin Ratio des Patienten betrug zu diesem Zeitpunkt 1.037 g/mg.
Aufgrund des akuten oligurischen Nierenversagens wurde der Patient nierenbiopsiert und histologisch eine fokale segmentale Gomerulosklerose (FSGS) zusammen mir einer akuten interstitiellen Nephritis (AIN) in der verbliebenen Einzelniere diagnostiziert.
Abb. 39 zeigt histologische Bilder der Nierenbiopsie des Patienten, die die FSGS des Patienten demonstrieren.
Das erste Bild zeigt die HE Färbung eines Golmerulums. Die Kapillarlichtungen waren nicht mehr abgrenzbar und die Gefäßschlingen waren mit der Bowmann Kapsel verhaftet. Außerdem waren in den segmentalen Läsionen Schaumzellen zu erkennen.
Im elekronenmikroskopischen Bild zeigten sich die Endothelzellen ohne Fensterung, ein aufgelockerter und verbreitereter Subendothelialraum sowie Podozyten ohne Fußfortsätze.
Die Versilberungsfärbung demonstrierte eine Proliferation der Podozyten, Schaumzellen und kollabierte Kapillarschlingen.
Abb. 39: Fokale segmentale Glomerulosklerose (FSGS) eines Patienten unter Sunitinib Therapie. 1) HE Färbung eines Glomerulums 2) elekronenmikroskopisches Bild; durchgängiger Pfeil = Endothelzellen ohne Fensterung; gestichelter Pfeil = Podozyten ohne Fußfortsätze; Stern = verbreiterter aufgelockerter
Subendothelialraum. 3) Versilberungsfärbung eines Glomerulums der Nierenbiopsie.
In Abb. 40 sind Charakteristika der interstitiellen Nephritis des Patienten erkennbar. Die HE Färbung der Nierenbiopie zeigt ein interstitielles Infiltrat aus Lymphozyten, Monozyten und eosinophilen Granulozyten.
Abb. 40: HE Färbung der Nierenbiopsie des Patienten unter Sunitinib Therapie, die die interstitielle Nephritis zeigt. Stern: lymphomonozellläres Infiltrat im Interstitium. Pfeil: Eosinophile Granulozyten.
*
1 2 3
Der Patient blieb dialysepflichtig und verstab 14 Monate nach der Diagnose des metastasierenden Nierenzellkarzinom an seinem Tumorleiden.
Die Tabelle 28 fasst alle Daten zu den Studienteilpatienten noch einmal zusammen.
Tabelle 28: Daten zu den Studienpatienten für den klinischen Teil der Arbeit.
Bevacizumab Sunitinib
Gesamtstudienteilnehmer (n) 19 8
Altersspanne in Jahren (∅∅∅∅) 29 84 (53) 59 71 (67) Kombination mit 5 FU*, Leucoverin und Oxaliplatin oder Irinotecan)
*5 FU = 5 Fluorouracil; ** höchste UAC Ratio während der Therapiezeit (mittlere Beobachtungszeit der Patienten = 8 Wochen)
Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass in der vorliegenden Arbeit zum Teil pathologische UAC Ratios und Podozyturie bei Patienten unter Bevacizumab und Sunitinib Therapie
nachgewiesen wurden, die einen Hinweis auf eine mögliche glomeruläre Schädigung unter einer VEGF Ablationstherapie geben.
Dieser Fall sowie die Fallserie von Patienten unter Bevacizumab und Sunitinib Therapie wurden im Nephrology Dialysis and Transplantation PLUS publiziert (Müller Deile J, Bröcker V,
Grünwald V, Hiss M, Bertram A, Kubicka S, Ganser A, Haller H, Schiffer M: Renal side effects of VEGF blocking therapy. 3: 172 175, 2010).
5 Diskussion
Podozyten sind als wichtige Produzenten von VEGF im Glomerulum beschrieben worden.
Dennoch waren Ergebnisse zu der Bedeutung von podozytärem VEGF im physiologischen und pathologischen Kontext des Glomerulums bislang nicht eindeutig.
Bisher wurde meistens die parakrine Funktion von podozytärem VEGF betrachtet, da die Expression des VEGFR 2 und des VEGFR 3 auf glomerulären Endothelzellen beschrieben wurde.
In der vorliegenden Arbeit wird ein systematischen Überblick über die Expression von VEGF Isoformen und VEGF Rezeptoren in Podozyten gegeben und der Schwerpunkt auf die bis dahin noch weitgehend unbekannten autokrinen Funktionen von podozytärem VEGF gelegt.