3.3 Statistik
4.1.12 Bedeutung des VEGFR 2 in der VEGF Signalkaskade in humanen Podozyten
4.1.12 Bedeutung des VEGFR 2 in der VEGF Signalkaskade in humanen Podozyten
Die Bedeutung des VEGFR 2 für pro survival Signalwege nach Stimulation mit VEGF A und VEGF C wurde mit Hilfe eines spezifischen VEGFR 2 Inhibitors (SU1498) analysiert. Dazu wurden die Podozyten für eine Stunde dem VEGFR 2 Inhibitor (5 g/ml) ausgesetzt und
anschließend mit exogenem VEGF A (20 ng/ml)/ VEGF C (5 ng/ml) stimuliert. Durch vorherige Behandlung mit dem VEGFR 2 Inhibitor konnte die durch exogenes VEGF A oder exogenes VEGF C ausgelöste AKT Phosphorylierung deutlich abgeschwächt werden
(Abb. 23). Dies zeigt, dass VEGFR 2 der Hauptrezeptor für die AKT/PKB Phosphorylierung als Antwort auf eine VEGF A und VEGF C Stimulierung ist.
Abb. 33: Western Blots zur Demonstration der Rolle von VEGFR 2 für die AKT Phosphorylierung nach
4.1.13 VEGF Ablationsversuche im Western Blot
Nachdem die positiven Effekte von VEGF Isoforemen für die Signaltransduktion in humanen Podozyten gezeigt wurden, sollten die Auswirkungen einer VEGF Ablation untersucht werden.
7 Tage differenzierte humane Podozyten wurden für diesen Versuch unterschiedlichen Konzentrationen von VEGF A , B und C Neutralisierungs Antikörpern, unterschiedlichen Konzentrationen von Bevacizumab oder verschiedenen Konzentrationen des VEGFR 2/ 3 TRI ausgesetzt. Im Western Blot wurden anschließend die Auswirkungen auf anti apoptotische (AKT) und pro apoptotische (p38) Signalwege betrachtet.
Durch einen Mediumwechsel mit 1 % FCS Gehalt (Hungermedium) wurden alle Zellen vor den Ablationsversuchen in den gleichen Zellzyklus gebracht.
Als Negativkontrollen wurde die Reaktion humaner Podozyten auf einen Rabbit IgG AK, auf einen Goat IgG AK, auf NaOH und auf Ethanol betrachtet. Diese Substanzen hatten alle keine Auswirkungen auf die Phosphorylierung von AKT oder p38 (Abb. 24F).
Die Normalisierung für pp38 ist mit GAPDH und die für pAKT mit AKT durchgeführt worden.
Gleiche Bandendensitäten bei allen Proben für AKT und GAPDH bestätigen, dass Unterschiede in den phosphorylierten Banden nicht einfach nur auf unterschiedliche Proteinmengen in den Taschen der Elektophorese zurückzuführen waren. Die Diagramme neben den Western Blots zeigen die pAKT/AKT Ratios als schwarze Säulen und die pp38/GAPDH Ratio als gestreifte Säulen.
Alle VEGF Ablationsversuche wurden drei Mal unabhängig voneinander mit vergleichbarem Ergebnis durchgeführt.
VEGF A Neutralisierung
Wie Abb. 24A zeigt, hatte die Behandlung humaner Podozyten mit steigenden Konzentrationen des VEGF A Neutralisierungs AK eine Abnahme der Aktivität des anti apoptotischen AKTs zur Folge. Nach einer 16 stündigen VEGF A Ablation mit einer Konzentration von 0,5 g/ml war eine signifikante Reduzierung der AKT Phosphorylierung sichtbar (p < 0,001 im Vergleich zum Basisphosphorylierungsgrad von AKT). Der AKT Signalweg wurde ab einer Konzentration von 1 g/ml VEGF A Neutralisierungs Antikörper komplett inhibiert.
Im Gegensatz dazu bewirkte die VEGF A Neutralisierung ab einer Konzentration von 0,5 g/ml
eine Phosphorylierung des pro apoptotischen p38, das bei unbehandelten Zellen und bei der IgG Kontrolle unphosphoryliert vorlag.
VEGF B Neutralisierung
Abb. 24B zeigt den Western Blot einer 16 stündigen VEGF B Ablation bei humanen Podozyten für pAKT und pp38. Sowohl die graphische Darstellung mit vergleichbaren Säulenhöhen für die pAKT/AKT Ratios und die pp38/GAPDH Ratios als auch die Western Blots mit gleich starken Banden zeigten, dass eine VEGF B Ablation in den Konzentrationen von 0 5 g/ml weder Auswirkungen auf die Phosphorylierung des anti apoptotischen AKT noch auf die des pro apoptotischen p38 in humanen Podozyten hatten.
VEGF C Neutralisierung
Die VEGF C Ablation hatte bei 7 Tage differenzierten humanen Podozyten wie die VEGF A Ablation eine deutliche Abnahme der AKT Phosphorylierung mit steigender Konzentration des VEGF C Neutralisierungs Antikörpers zur Folge (Abb. 24C).
Durch den Einsatz von 1,25 g/ml VEGF C Neutralisierungs Antikörper war bereits eine leichte (noch nicht signifikante) Abnahme der Phosphorylierung von AKT und eine schon signifikante p38 Posphorylierung zu bemerken (p < 0,05 im Vergleich zu 0 g/ml). 2,5 g/ml VEGF C Neutralisierungs Antikörper reduzierten den Basisphosphorylierungsgrad von AKT um etwa 50 % und nach 16 stündiger Behandlung mit 5 g/ml VEGF C Neutralisierungs Antikörper betrug die AKT Phosphorylierung nur noch 34 % des Ausgangswertes.
Parallel zur Abnahme der AKT Aktivität war eine Zunahme der pro apoptotischen p38 Phosphorylierung detektierbar. Bei einer Konzentration von 10 g/ml des VEGF C
Neutralisierungs Antikörpers war keine signifikante Phosphorylierung von AKT mehr sichtbar.
Der pp38/GAPDH Ratio war bei dieser Konzentration hingegen maximal.
Bevacizumab Behandlung
Auch durch die Behandlung 7 Tage differenzierter Podozyten mit Bevacizumab in Konzentrationen von 0 50 g/ml für 16 h konnte eine deutliche Abnahme der AKT Phosphorylierung bewirkt werden (Abb. 24D).
Die unbehandelten Zellen hatten noch eine recht hohen pAKT/AKT Ratio, die zu Zwecken der
Vergleichbarkeit wieder mit 100 % gleichgesetzt wurde. 0,25 g/ml Bevacizumab bewirkten in 16 h keine signifikante Änderung der AKT Phosphorylierung. Eine Bevacizumab Konzentration von 5 g/ml reduzierte die pAKT/AKT Ratio allerdings auf 45 % und führte gleichzeitig zu einer hoch signifikanten Zunahme der Phosphorylierung von p38 (p < 0,001 im Vergleich zu
0 g/ml). Bei einer Bevacizumab Konzentration von 50 g/ml gab es überhaupt keine pAKT Bande mehr und die pp38 Bande trat maximal hervor.
VEGFR 2/ 3 Kinaseninhibition
Die Konzentrationen des VEGFR 2/ 3 TKI, der ein Multi Tyrosin Kinase Inhibitor ist, waren so gewählt, dass ein direkter Effekt auf die AKT Phosphorylierung ausgeschlossen werden konnte, da die mittlere Hemmschwelle für die AKT Phosphorylierung bei >1x10 M lag. Trotzdem hatte die Behandlung 7 Tage differenzierter humaner Podozyten mit dem VEGFR 2/ 3 TKI mit steigender Konzentration eine signifikante Abnahme der AKT Phosphorylierung zur Folge (Abb.
24E). Während 50 nM VEGFR 2/ 3 TKI die Phosphorylierung des AKT nur leicht verringerte (nicht signifikant), sank der AKT Phosphorylierungsgrad nach 16 stündiger Behandlung mit 100 nM VEGFR 2/ 3 TKI auf 50 %. Nach der Behandlung der Zellen mit 200 nM lag AKT nahezu komplett dephosphoryliert vor. Entgegengesetzt zur Dephosphorylierung von AKT bewirkte der VEGFR 2/ 3 TKI eine Phosphorylierung von p38. Diese war nach der Behandlung mit 50 nM VEGFR 2/ 3 TKI bereits hoch signifikant im Vergleich zu unbehandelten Zellen.
Ethanol, das als Negativkontrolle ebenfalls für 16 h auf eine Zellplatte gegeben wurde, hatte keinen Einfluss auf die Signaltransduktionskaskaden.
Zusammenfassend lässt sich belegen, dass eine Ablation von podozytärem VEGF A und C, sowie eine Inhibierung der VEGFR 2/ 3 in humanen Podozyten zu einer Inhibition von pro survival und zu einer Aktivierung von pro apoptotischen Signalwegen führt. Die Ablation von podozytärem VEGF B hat hingegen keine Auswirkungen.
g/ml
Abb. 24: Legende siehe Seite 80.
0 0,1 0,5 1 5 g/ml
g/ml
Abb.: 24: Legende siehe Seite 80.
Bevacizumab
100
Abb. 24: Western Blots unterschiedlicher VEGF Ablationsversuche zur Untersuchung der AKT und der p38 Phosphorylierung. AKT und GAPDH dienten der Normalisierung. A) VEGF A Neutralisierungs Antikörper (αVEGF A), B) VEGF B Neutralisierungs Antikörper (αVEGF B), C) VEGF C Neutralisierungs Antikörper (αVEGF C), D) Bevacizumab, E) VEGFR 2/ 3 Tyrosin Kinase Inhibitor (VEGFR 2/ 3 TKI), F) Positivkontrolle mit H2O2; Negativkontrollen mit IgG, NaOH und Ethanol. Es wurden jeweils 10 g Protein aufgetragen. Rechts: graphische Darstellung der Mittelwerte der pAKT/AKT Ratios ± SEM und der Mittelwerte der pp38/GAPDH Ratios ± SEM der Ablationsversuche. Die pAKT/AKT Ratios der
unbehandelten Zellen und die höchsten pp38/GAPDH Ratios wurden auf 100 % gesetzt. Die Auswertung der Bandenintensitäten geschah mit dem Programm Quantity One. n = 3; * = p < 0,05; ** = p < 0,001 im
E
4.1.14 VEGF Ablation im zeitlichen Verlauf
Die Versuche der VEGF Ablation im zeitlichen Verlauf sollten zeigen, wie schnell der pro apoptotische Effekt in humanen Podozyten auftrat. Für alle Versuche wurden 50 g/ml Bevacizumab und 200 nM VEGFR 2/3 TKI eingesetzt.
Mit diesen Konzentrationen konnte in vorangegangen Ablationsversuchen nach 16 h eine komplette Inhibierung des AKT Signalweges und eine starke Aktivierung des p38 Signalweges erzielt werden (Abb. 25).
Die Dephosphorylierung des pro survival AKT Signalweges trat bereits nach 30 minütiger VEGF Ablation ein. Die Ergebnisse waren mit p < 0,05 nach 30 min und mit p < 0,001 nach 1 h signifikant (Student’s t Test). Die Phosphorylierung von pro apoptotischen p38 geschah zeitlich etwas später (ab 2 h nach Bevacizumab Behandlung).
Aus den Western Blot Banden und der graphischen Darstellung der pAKT/AKT und der pp38/GAPDH Ratios ist ersichtlich, dass der Tyrosin Kinase Inhibitor in einer Konzentration von 200 nM nach 1h den pro apoptotischen Signalweg aktivierte und den anti apoptotischen Signalweg inhibierte.
Die morphologischen Veränderungen kultivierter humaner Podoyten durch Bevacizumab und den VEGFR 2/3 TKI sind neben den Western Blots im zeitlichen Verlauf dargestellt.
Für den VEGF A und den VEGF C Neutralisierungs Antikörper konnten vergleichbare Effekte beobachtet werden (nicht gezeigt).
Die humanen Podozyten wuchsen vor Beginn des Versuches in normaler Morphologie mit ausgebreitetem Zellkörper und ausgestreckten Fußfortsätzen.
Nach der Behandlung mit Bevacizumab und dem VEGFR 2/ 3 TKI nahmen die Zellen im Laufe der Zeit eine zunehmend kugelige Gestalt an und zogen sich zusammen. 6 h nach der Behandlung waren fast nur noch die Zellkerne erkennbar und nach 8 h schwammen tote Zellen im Medium, die sich von der Kulturplatte gelöst hatten.
Somit konnte gezeigt werden, dass der pro apoptotische Effekt einer VEGF Ablation schon nach kurzer Zeit auftritt und neben der Beeinflussung entsprechender Signalkaskaden auch
morphologische Veränderungen der Zellen bewirkt.
Bevacizumab
pAKT/AKT Ratio pp38/GAPDH Ratio
Abb. 25: Western Blot für den zeitlichen Verlauf der VEGF ABlation. 7 Tage differenzierte humane Podozyten wurden mit 50 g/ml Bevacizumab (A) und 200 nM des VEGFR 2/ 3 TKI (B) behandelt. Es wurden jeweils 10 g Protein aufgetragen. Unter den Western Blots: graphische Darstellung der
pAKT/AKT und der pp38/GAPDH Ratios der Ablationsversuche. Die Ausgangs pAKT/AKT Ratios und die höchsten pp38/GAPDH Ratios wurden auf 100 % gesetzt. Die Auswertung der Bandenintensitäten geschah mit dem Programm Quantity One; n = 3; */+ = p < 0,05 und **/++ = 0,001 im Vergeleich zur alleinigen Ablation; Student’s t Test; OD = optische Dichte. Rechts: Auswirkungen auf die Morphologie humaner
OD in %
B VEGFR 2/ 3 TKI
h