Paratuberkulose-Diagnostik in Milch:
Erreger- und Antikörpernachweis mittels PCR und ELISA
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines
DOCTOR MEDICINAE VETERINARIAE durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Corinna Winterhoff
aus Hagen/Westf.
Hannover 2000
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. G. F. Gerlach 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. Ch. Ring Tag der mündlichen Prüfung: 29.11.2000
Diese Arbeit wurde durch die Niedersächsische Tierseuchenkasse und die Landesvereinigung Milchwirtschaft Niedersachsen e.V. gefördert.
deren Phantasiebild.“
(Niccolo Machiavelli)
Meiner Mutter und meinem Vater
gewidmet.
Homuth, M., C. Winterhoff, K. Strutzberg (2000):
„Ergebnisse eines Ringversuchs zur serologischen, mikroskopischen und kulturellen Untersu- chung auf Paratuberkulose des Rindes in Niedersachsen“
Vortrag auf der 1. Arbeitstagung des veterinärmedizinischen Referenzlabors für Tuberkulose 28./29. März in Jena
Winterhoff, C., M. Homuth, K. Strutzberg, G.-F. Gerlach (2000):
„PCR zum diagnostischen Nachweis des Erregers der Paratuberkulose des Rindes aus Milch“
Poster, DVG-Tagung, Fachgruppe Bakteriologie und Mykologie 15.-17. Juni in Leipzig
1 Einleitung...10
2 Schrifttum...11
2.1 Mycobacterium paratuberculosis... 11
2.1.1 Taxonomie und Morphologie... 11
2.2 Paratuberkulose... 12
2.2.1 Pathogenese und Krankheitsbild... 12
2.2.2 Immunologie ... 13
2.2.3 Pathologie und Histologie... 13
2.3 Epidemiologie ... 14
2.3.1 Tenazität... 14
2.3.2 Wirtsspektrum... 16
2.3.3 Geographische Verbreitung ... 17
2.3.4 Empfänglichkeit der Wirtstiere... 18
2.3.5 Erregerausscheidung ... 19
2.3.6 Übertragungswege ... 20
2.3.7 Wirtschaftliche Bedeutung... 21
2.4 Bekämpfung und Sanierung... 22
2.4.1 Therapie ... 22
2.4.2 Impfung... 22
2.4.3 Sanierung ... 23
2.5 Nachweis und Diagnose... 24
2.5.1 Direkter Erregernachweis ... 24
2.5.2 Serologische Verfahren... 26
2.5.3 Polymerase Kettenreaktion (PCR) ... 29
3 Material und Methoden ...34
3.1 Material ... 34
3.1.1 Bakterienstämme und Medien ... 34
3.1.2 Probengewinnung... 35
3.2 Methoden ... 36
3.2.3 Bestimmung der Erregerdichte ... 36
3.2.4 Mikroskopischer und kultureller Nachweis von M. paratuberculosis... 37
3.2.5 Antigenherstellung... 38
3.2.6 Präparation von Fab-Fragmenten ... 38
3.2.7 DNA-Präparation von Mykobakterien... 39
3.2.8 Bestimmung der DNA-Konzentration ... 40
3.2.9 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) ... 40
3.2.10 Western-Blotting... 41
3.2.11 Agarosegelelektrophorese... 42
3.2.12 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)... 43
3.2.13 Andere Paratuberkulose-ELISA-Testverfahren... 45
3.2.14 Polymerasekettenreaktion (PCR)... 46
3.2.15 Methoden der statistischen Auswertung ... 49
4 Ergebnisse...52
4.1 Adaption des SVANOVIR®-ELISA für Blutserum an Milchserum... 52
4.1.1 Auswahl des ELISA... 52
4.1.2 Darstellung der Bindungsstelle des Svanovir®-Konjugates... 54
4.1.3 Milchaufreinigungsmethode ... 55
4.1.4 Reproduzierbarkeit... 56
4.1.5 Evaluierung des Milch-ELISA mittels ROC-Analyse ... 57
4.1.6 Korrelation des Blut- und Milch-ELISA bei festgelegten „Cut off“- Werten des Milch-ELISA ... 65
4.2 Entwicklung einer Milch-PCR... 68
4.2.1 Methode zur Milchaufbereitung... 68
4.2.2 Etablierung der PCR ... 70
4.3 Validierung von Milchserologie und Milch-PCR in einer Verlaufsuntersuchung ... 76
4.3.1 Untersuchunsergebnisse... 77
5.2 Entwicklung einer Milch-PCR... 96
5.3 Validierung von Milchserologie und Milch-PCR in einer Verlaufsuntersuchung ... 99
6 Zusammenfassung ...102
7 Summary...103
8 Literaturverzeichnis ...104
9 Anhang...129
9.1 Tabellenanhang ... 129
9.2 Kulturmedien zur Anzucht von M. avium ssp.paratuberculosis... 139
9.3 Agarosegelelektrophorese... 141
9.4 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)... 142
9.5 Coomassie®-Blau-Färbung... 143
9.6 Proteintransfer von SDS-Gelen im Tankblotting-Verfahren ... 144
9.7 Aufreinigung von IgG... 145
9.8 ELISA ... 145
9.9 Primer... 146
9.10 Chemikalien ... 147
9.11 Enzyme... 148
9.12 Abbildungsverzeichnis... 149
9.13 Tabellenverzeichnis ... 151
9.14 Abkürzungsverzeichnis... 152
1 Einleitung
Mycobacterium paratuberculosis verursacht eine chronische, granulomatöse und nicht therapierbare Enteritis bei Wiederkäuern, die Johne´sche Krankheit. Weltweit entstehen be- deutende wirtschaftliche Verluste infolge von Rückgang in der Milchleistung, Abmagerung und Fruchtbarkeitsstörungen. Die Paratuberkulose verbreitet sich innerhalb betroffener Be- stände nur relativ langsam. Die Ansteckung erfolgt über die Aufnahme von erregerhaltigem Kolostrum sowie Kot. Die Tiere infizieren sich in der Regel in den ersten Lebensmonaten und zeigen danach oft über Jahre keinerlei klinische Symptome, obwohl eine intermittierende oder kontinuierliche Erregerausscheidung über Kot und Milch erfolgt. Gerade die Ausscheidung über Milch wird in letzter Zeit kritisch betrachtet, da eine sichere Abtötung der Erreger durch Pasteurisierung in Frage gestellt worden ist (MILLAR et al. 1996).
Die wachsende wirtschaftliche Bedeutung der Paratuberkulose sowie die hohe Tenazität des Erregers, die auch eine vielmonatige Persistenz in der Außenwelt ermöglicht, lassen eine kontinuierliche Überwachung von Milchviehbetrieben sinnvoll erscheinen. Von einer derarti- gen Maßnahme wurde bisher Abstand genommen. Dies wird unter anderem durch die auf- wendige Probenentnahme (Kot und Blut) und Diagnostik (u.a. mehrmonatige Kotkultur) be- gründet.
Basierend auf diesen Überlegungen war das Ziel der Arbeit, auf der Basis des leicht zugängli- chen Materials „Milch“ kostengünstige, diagnostische Methoden zum Erreger- und Antikör- pernachweis zu entwickeln. Durch Etablierung einer Milch-PCR und eines Milch-ELISA konnte dieses Ziel erreicht werden. Beide Verfahren wurden abschließend in einer Ver- laufsuntersuchung mit zehn an Paratuberkulose erkrankten Milchkühen durch Blutserologie, Kotuntersuchungen sowie durch die Untersuchung des Ileocaecallymphknotens validiert.
2 Schrifttum
2.1 Mycobacterium paratuberculosis
Im Jahre 1895 wurde der Erreger bei einer Kuh mit chronischer Enteritis erstmals be- schrieben (JOHNE und FRONTHINGHAM 1895). Die Autoren nahmen an, daß es sich bei dem beschriebenen Fall um eine besondere Form von Darmtuberkulose handelt. Die Eigen- ständigkeit dieser Erkrankung wurde elf Jahre später erkannt (BANG 1906). Das Krankheits- bild wurde als „Enteritis chronica bovis pseudotuberculosa“ bezeichnet.
2.1.1 TAXONOMIE UND MORPHOLOGIE
Heute wird Mycobacterium paratuberculosis (M. paratuberculosis) in die Ordnung der Actinomycetales und der dazugehörigen Familie der Mycobacteriaceae eingeordnet. Auf- grund von biochemischen Charakteristika wird der Erreger als eine weitere Subspezies (ssp.) von Mycobacterium avium, neben M. avium ssp. silvaticum und M. avium ssp. avium, klassi- fiziert (M. avium ssp. paratuberculosis) (THOREL et al. 1990). Diese Klassifizierung wird in Europa bevorzugt, in den USA dagegen wird M. paratuberculosis eher als eigene Spezies angesehen (SWEENEY 1996).
In molekularbiologischen Untersuchungen an genomischer DNA zeigte sich, daß M. paratu- berculosis eine einzigartige Insertionssequenz (IS900) besitzt (GREEN et al. 1989). Bei M.
avium ssp. silvaticum und M. avium ssp. avium, nicht aber bei M. paratuberculosis konnten verwandte Sequenzen (IS901/IS902) gefunden werden (KLAUSEN et al. 1997; KUNZE et al.
1992).
M. paratuberculosis ist ein säurefestes, unbewegliches, schwach grampositives Stäbchen von 0,3-2 µm Breite und 0,3-0,5 µm Länge (BISPING und AMTSBERG 1988). Die Zellwand besteht aus einer äußeren Peptidglykanschicht, es folgt eine Schicht mit langkettigen Fettsäu- ren, die mit Arabinogalaktan gekoppelt sind. Nach außen wird die Zellwand durch eine Schicht von Peptidoglycolipiden abgeschlossen (CLARKE 1997). Das Lipoarabinomannan ist ein Glycolipid, welches in der Zellmembran verankert ist und von dort aus in die Zellwand reicht (BRENNAN und NIKAIDO 1995).
Charakteristisch für M. paratuberculosis ist das langsame, Mycobactin-abhängige Wachstum.
Mycobactin ist ein zellwandassoziiertes Siderophor, welches von allen Mykobakterien mit Ausnahme von M. leprae und M. paratuberculosis in vitro synthetisiert wird (WHEELER und RATLEDGE 1994).
Bei einer Generationszeit von 1,3 bis 4,4 Tagen werden sichtbare Kolonien auf festen Nähr- böden erst nach 8-12 Wochen erwartet (LAMBRECHT et al. 1988). Als Standard-Nährboden für die Anzucht von M. paratuberculosis wird das eidotterhaltige Medium nach Herrold (Her- rold’s egg yolk medium) angesehen (MERKAL et al. 1968), auch in flüssigen Nährmedien, wie z.B. Watson-Reid-Medium, kann M. paratuberculosis kultiviert werden.
Die Subspezies M. paratuberculosis ist also nur durch eine einzelne phänotypische Eigen- schaft (Mycobactinabhängigkeit) und eine einzelne genotypische Eigenschaft (IS 900) cha- rakterisiert.
2.2 Paratuberkulose
2.2.1 PATHOGENESE UND KRANKHEITSBILD
Die Erreger der Paratuberkulose gelangen über die orale Aufnahme in den Darm, wo sie durch die M-Zellen im Domeepithel der Peyer´schen Platten die Darmschleimhaut über- winden (CHIODINI et al. 1984; MOMOTANI et al. 1988). Die Mykobakterien werden dar- aufhin von den subepithelialen und intraepithelialen Makrophagen aufgenommen, in denen sie lange Zeit überleben und sich vermehren können. Bedingt durch das intrazelluläre Wachstum von M. paratuberculosis kommt es zum Absterben des Makrophagen und zur er- neuten Aufnahme in weitere Phagozyten. Es entsteht in diesem Bereich eine chronische ka- tarrhalische Entzündung begleitet von Hyperplasie (MERKAL et al. 1970). Die Infektion breitet sich im Dünndarm aus und befällt großflächigere Regionen sowie angrenzende Kör- perbereiche wie Leber, Niere und Milz. Es kommt zu einer Enteropathie mit Proteinverlust und schließlich zur Hypoproteinämie. Später werden die überfüllten epitheloiden Zellen ins Darmlumen abgestreift, und die Mykobakterien werden mit dem Kot ausgeschieden. Die ge- fundenen Zellzahlen liegen bei 108 Zellen/g Kot bzw. 1012 Zellen/ Tag (CHIODINI et al.
1984).
Die Paratuberkulose hat eine lange Inkubationszeit (ca. 2-5 Jahre) und verläuft meist subkli- nisch, wobei der Erreger intermittierend ausgeschieden werden kann. Symptomatisch werden drei unterschiedliche klinische Stadien unterschieden. Im ersten, subklinischen Stadium scheiden die Tiere den Erreger nicht aus und zeigen keinerlei klinische Symptome. Im näch- sten Stadium wird der Erreger intermittierend mit dem Kot und der Milch ausgeschieden (SWEENEY et al. 1992b; TAYLOR et al. 1981). Im dritten Stadium sind die Tiere klinisch erkrankt. In diesem letzten Stadium ist eine Verdachtsdiagnose aufgrund des zuerst intermit- tierenden, später anhaltenden, therapieresistenten Durchfalls mit fortschreitender Abmagerung bei jedoch kaum gestörtem Allgemeinbefinden und erhaltener Freßlust meist leicht zu stellen.
Wesentlich schwieriger gestaltet sich die Erkennung von subklinisch infizierten Tieren, die über Jahre hinweg die Erreger ausscheiden können.
2.2.2 IMMUNOLOGIE
Wenn die Erreger der Paratuberkulose phagozytiert werden, kommt es zur zellulären Immunantwort. Die Freisetzung der Bakterien aus den abgestorbenen Makrophagen führt im nächsten Stadium zu einer humoralen Immunantwort. Das Gleichgewicht verschiebt sich von der zellvermittelten zur humoralen Immunreaktion, die schließlich vorherrscht (CHIODINI et al. 1984). Im Finalstadium der Erkrankung, jedoch auch während anderer Phasen der Infekti- on, kann der Zustand der Anergie eintreten. In diesem Zustand fehlen sämtliche Reaktionen der Immunabwehr auf die antigenen Eigenschaften des Erregers (MERKAL et al. 1970).
2.2.3 PATHOLOGIE UND HISTOLOGIE
Die pathologischen Veränderungen zeigen das Bild einer chronisch-hyperplastischen Enteritis. Besonders im Bereich des Ileums, aber auch im mittleren Jejunum, Caecum und Colon ist eine deutliche Verdickung der Schleimhaut erkennbar. Im klassischen Fall zeigt die Schleimhaut einen hirnwindungsartigen Verlauf. Die mesenterialen Lymphgefäße sind hoch- gradig gestaut, die Lymphknoten dieses Bereiches sind stark geschwollen und können bis auf das Fünffache vergrößert sein. Im Anschnitt zeigen sie eine mit granulomatösen Entzün- dungsherden durchsetzte Schnittfläche.
Histologisch sind in der Darmwand große Mengen an epitheloiden Zellen und Makrophagen, sowie einzelne Riesenzellen von Langhanstyp und eine mäßige Lymphoplasmeninfiltration zu
beobachten. Die Zellinfiltrate können die Krypten verdrängen und sich in Mucosa und Sub- mucosa ausdehnen (POHLENZ 1991).
Bei der gelegentlich auftretenden generalisierten Infektion finden sich in verschiedenen inne- ren Organen wie Leber, Milz, Niere, Lunge und Uterus miliare Herde, die histologisch aus epitheloiden Zellen und wenigen Langhansschen Riesenzellen aufgebaut sind (CHIODINI et al. 1984; ROSENBERGER 1978).
2.3 Epidemiologie
2.3.1 TENAZITÄT
Der Erreger der Paratuberkulose ist ein sehr widerstandsfähiger Keim, der in der Au- ßenwelt lange überleben kann. So beträgt die Überlebensdauer in Mist und anaerober Gülle bis zu 9 Monate (GAY und SHERMAN 1992; JØRGENSEN 1977). Im Weidekot infizierter Rinder kann der Erreger noch nach 11 Monaten nachgewiesen werden (ROSENBERGER 1978). Die Nachweisdauer noch lebender Mykobakterien beträgt im Boden 11 Monate und im Wasser 17 Monate (GAY und SHERMAN 1992). Die Überlebensdauer im Boden kann durch saure pH-Bedingungen günstig beeinflußt werden (RICHARDS 1988). Ein ursächlicher Zu- sammenhang zwischen saurem Boden-pH und erhöhten Prävalenzen für Paratuberkulose ist noch nicht abschließend geklärt (JOHNSON-IFEARULUNDU und KANEENE 1997). Auch gegen Austrocknung ist M. paratuberculosis äußerst resistent. So kann der Erreger eine 47 Monate anhaltende Austrocknung überleben. Direkte Sonneneinstrahlung tötet den Erreger allerdings bereits nach 100 Stunden (GAY und SHERMAN 1992).
Auch in der Kälberaufzucht stellt die Tenazität des Erregers ein Problem dar. In kontrolliert infizierten (102 bis 104 KBE/ml) Kolostrumproben, konnte nach Pasteurisierung (63°C für 30 min) in 2 von 18 Proben M. paratuberculosis kulturell nachgewiesen werden (MEYLAN et al. 1996). Die Autoren empfehlen aber trotz einer Reduktion des IgG-Gehaltes um 12,3 % eine Thermobehandlung von Kolostrum in Problembetrieben, da die Zahl der Mykobakterien deutlich reduziert werden konnte.
Die hohe Thermotoleranz von M. paratuberculosis zeigt ein besonderes Problem in der Qua- litätssicherung des Lebensmittels Milch auf. So wurde schon 1993 gezeigt, daß bei einer Er- hitzung von Milch auf 63°C für 30 Minuten oder 72°C für 15 Sekunden in ca. 5-9 %, bzw. 3-
5 % der Milchproben M. paratuberculosis noch kulturell nachgewiesen werden konnte.
(CHIODINI und HERMON-TAYLOR 1993). Hierbei wurden zur Inokulation der Milchpro- ben ca. 1 x 104 KBE/ml sowohl boviner als auch humaner Isolate verwendet. Isolate humanen Ursprungs waren generell Hitze-resistenter als bovine Isolate. Im Laufe der nächsten Jahre wurden vermehrt Untersuchungen zur Überlebensrate von M. paratuberculosis Isolaten in pasteurisierter Milch vorgenommen. Bei Pasteurisierungsbedingungen von 63,5°C für 30 Mi- nuten und 71,7°C für 15 Sekunden konnten in Milch Überlebensraten <1 % dokumentiert werden (GRANT et al. 1996). Die eingesetzten Inokulationsdosen waren mit 107 und 104 KBE/ml relativ hoch, und zudem entsprachen die experimentellen Bedingungen nicht ganz den kommerziellen Pasteurisierungsbedingungen. Aber auch mit niedrigeren Keimzahlen (103-102 KBE/ml Milch) konnte durch HTST-Bedingungen (high temperature, short time:
71,7°C für 15 Sekunden) M. paratuberculosis nicht vollständig inaktiviert werden (GRANT et al. 1998). Dieselben Autoren konnten ein Jahr später bei Pasteurisierungsbedingungen mit steigender Temperatur bei gleichbleibender Einwirkzeit (72°,75°,78°,80°,85°,90°C für 15 Sekunden) und gleichbleibender Temperatur bei längerer Einwirkzeit (72°C für 20 Sekunden und 72°C für 25 Sekunden) dokumentieren, daß bei einer eingesetzten Inokulationsdosis von 106 KBE/ml Milch sich längere Einwirkzeiten effektiver bei der Inaktivierung von M. paratuberculosis auswirken als höhere Temperaturen (GRANT et al. 1999). Auch bei Ino- kulationsdosen von nur 101 KBE/ml Milch kann M. paratuberculosis die HTST- Pasteurisierung überleben (SUNG und COLLINS 1998). In einer weiteren Untersuchung wurde eine Anlage, die industrielle Pasteurisationsbedingungen exakt nachzeichnet, verwen- det (STABEL et al. 1997). Bei Einsatz von tiefgefrorenen und Ultraschall-behandelten My- kobakterien konnten die Autoren nach Pasteurisierung keine überlebensfähigen Erreger nachweisen. Die Bedeutung dieser Daten wird kontrovers diskutiert (GRANT 1998). Trotz- dem kann nicht ausgeschlossen werden, daß M. paratuberculosis die kommerzielle Milch- Pasteurisierung überlebt. So konnte in England mittels PCR in pasteurisierter Milch, die im Einzelhandel erhältlich war, M. paratuberculosis nachgewiesen werden (MILLAR et al.
1996). Den Autoren gelang der Nachweis in 7 % der 312 in Süd- und Westengland gekauften Proben.
Die Zahl der wirksamen Desinfektionsmitteln ist begrenzt. Die meisten Desinfektionsmittel sind unwirksam gegen M. paratuberculosis, insbesondere dann, wenn sich der Erreger im Kot befindet. Als wirksam haben sich Formaldehyd-haltige Desinfektionsmittel erwiesen.
2.3.2 WIRTSSPEKTRUM
Die Paratuberkulose ist eine Darmerkrankung der Wiederkäuer. Neben den Hauswie- derkäuern wie Rind, Schaf und Ziege ist die Infektion auch bei Wild und Zoowiederkäuern nachgewiesen worden (CHIODINI und VAN KRUININGEN 1983; CLARKE 1997; WEBER et al. 1991). Ebenso wurde die Infektion bei Lamas, Kamelen, Antilopen, Büffeln, Yaks, Gnus und anderen Wiederkäuern beschrieben (STEHMAN 1996; WILLIAMS und SPRA- KER 1979). Bei niedriger Bestandsdichte des Wildes ist zwar eine Weiterverbreitung des Er- regers unwahrscheinlich, die Wahrscheinlichkeit wächst aber mit höheren Bestandsdichten etwa durch Gatterhaltung, so daß Wild eine potentielle Infektionsquelle für Hauswiederkäuer darstellen kann (CHIODINI und VAN KRUININGEN 1983).
In Schottland konnte sowohl M. paratuberculosis im Kot von Kaninchen nachgewiesen als auch die typischen pathologischen Befunde im Darm der Tiere dokumentiert werden (GREIG et al. 1997).
Es gelang nach oraler Verabreichung des Erregers in größeren Mengen sowohl Schweine als auch Pferde zu infizieren (LARSEN et al. 1972). Beim Pferd (LIENAUX 1913), beim Schwein (RUNNELS 1955), beim Hund (VOGEL 1970) und beim Esel (VAN ULSEN 1970) konnten auch natürliche Infektionen nachgewiesen werden. Ebenso konnte die Empfänglich- keit von Hühnern gegenüber dem Bakterium demonstriert werden (LARSEN und MOON 1972). Bei all diesen Tieren kommt es zwar zu einer Vermehrung des Erregers, die klinische Symptomatik einer Darmerkrankung ist jedoch nicht festzustellen (CHIODINI et al. 1984).
Bei infizierten Primaten hingegen zeigte sich ein deutliches klinisches Bild. In einer Herde von 38 Stummelschwanz-Makaken waren 29 Tiere mit Mykobakterien, die in der PCR (IS 900) positiv waren und ein mycobactinabhängiges Wachstum aufzeigten, infiziert. Die Aus- scheidung der Keime mit dem Kot konnte nachgewiesen werden. Innerhalb von fünf Jahren starben 13 Tiere mit klinischen und pathologischen Erscheinungen ähnlich der Paratuberkulo- se-Infektion beim Rind (MCCLURE et al. 1987).
Weiterhin wird diskutiert, ob unterschiedliche Biotypen von M. paratuberculosis innerhalb der Hauswiederkäuerarten existieren. Unterschiede in den erforderlichen Kultivierungsbedin- gungen für spezifisch bovine und ovine M. paratuberculosis Isolate deuten darauf hin. Trotz hoher genetischer Homologie gelang der Nachweis drei unterschiedlicher Typen von M. pa- ratuberculosis mit Hilfe von Hybridisierungstechniken (COLLINS et al. 1990; DE LISLE et al. 1992). Unklarheit besteht darüber, inwieweit sich unterschiedliche Tierarten Spezies über-
greifend infizieren können. Es bestehen Hinweise darauf, daß sich die Hauswiederkäuer un- tereinander anstecken können (STEHMAN 1996), da experimentelle Infektionen vom Rind und Hirsch auf Schafe gelangen, und Rinder mit ovinen Stämmen infiziert werden konnten (ANGUS und GILMOUR 1971; JUSTE et al. 1994; KLUGE et al. 1968; TAYLOR 1953).
Die Beziehung zwischen der bovinen Paratuberkulose und der Crohn’schen Erkrankung des Menschen ist noch nicht geklärt. Die Crohn’sche Erkrankung wurde 1932 als eine eigenstän- dige Darmerkrankung, abgegrenzt zu der Darmtuberkulose beschrieben (CROHN et al. 1932).
Sie äußert sich als eine granulomatöse Ileocolitis, von der insbesondere jüngere Menschen betroffen sind. Schon im Jahr 1913 wurden Vermutungen geäußert, basierend auf der Ähn- lichkeit der Krankheitsbilder von Morbus Crohn und Paratuberkulose, daß M. paratuberculo- sis eine entscheidende Rolle in der Pathogenese von Morbus Crohn zukommt (CHIODINI 1989; TAMBOLI 1996). Einige Autoren bezeichnen Paratuberkulose als eine potentielle Zo- onose (CHIODINI und ROSSITER 1996; HERMON-TAYLOR et al. 1990).
In den vergangenen 15 Jahren haben sich eine Vielzahl von Untersuchungen mit dem labor- diagnostischen Nachweis von M. paratuberculosis bei Morbus Crohn-Patienten beschäftigt.
Es wurden ELISA-Tests, Western-Blot-Verfahren, PCR und mikrobiologische Kultivie- rungstechniken eingesetzt. Die Ergebnisse sind insgesamt sehr heterogen. Dies spiegelt sich in zwei Untersuchungen dieses Jahres wieder. Es wird einerseits ein eindeutiger Zusammen- hang von M. paratuberculosis und Morbus Crohn gesehen, da der Erreger bei Patienten nach- gewiesen werden konnte. Diese Patienten zeigten nach einer Kombinations-Therapie mit ins- besondere gegen Mykobakterien wirksamen Antibiotika eine Verbesserung und in einigen Fällen eine scheinbare Heilung (HERMON-TAYLOR et al. 2000). Andererseits wird nicht bestritten, daß M. paratuberculosis und Morbus Crohn gemeinsam auftreten können, es ist aber bis heute ungeklärt, ob M. paratuberculosis vor oder nach dem Ausbrechen der Crohn‘
schen Erkrankung sich im Darm des Patienten manifestierte. Auch sind die Koch’schen Po- stulate nicht erfüllt (COOK 2000).
2.3.3 GEOGRAPHISCHE VERBREITUNG
Die Paratuberkulose ist eine weltweit verbreitete Darmerkrankung der Wiederkäuer.
Das erste Auftreten wurde aufgrund von eingesandten Untersuchungsmaterialien eines Tier- arztes Harms aus Jever beschrieben (JOHNE und FRONTHINGHAM 1895). In Deutschland
ist die Paratuberkulose seit 1970 eine meldepflichtige Erkrankung. In der Zeit zwischen 1971 und 1981 traten 90 % aller in Deutschland gemeldeten Paratuberkulosefälle in Norddeutsch- land und hier vor allem in der Küstenregion auf (SCHLIESSER und SCHAAL 1984). Die Paratuberkulose ist aber in ganz Europa verbreitet, wobei neben Norddeutschland, besonders die Niederlande, Großbritannien (CETINKAYA et al. 1996) und Dänemark (JØRGENSEN 1977; NIELSEN et al. 2000) von der Paratuberkulose betroffen sind. Aufgrund der Merzung aller Paratuberkulose-infizierten Rinderherden ist Schweden das einzige Paratuberkulose-freie Land innerhalb der Europäischen Gemeinschaft (VISKE et al. 1996). Für Italien schwankten die Angaben für Herdenprävalenzen von 2,8 % bis 10-15 % (BELLETTI et al. 1992; KOR- MENDY et al. 1989). Die Seroprävalenz innerhalb der Milchkühe in der Plateau de Diesse- Region in Frankreich betrug auf der Grundlage eines kommerziellen ELISA-Verfahrens (Commonwealth Serum Laboratoires) 5,99 % (MEYLAN et al. 1995). Die individuellen Prä- valenzen innerhalb verschiedener Herden schwankten dabei von 0 -17 %. In vielen der ande- ren europäischen Ländern wurden bisher keine flächendeckenden Untersuchungen durchge- führt
Außerhalb Europas wurden in den USA umfangreiche Untersuchungen zum Vorkommen der Paratuberkulose durchgeführt. In den Jahren 1983 und 1984 wurden die Lymphknoten des Ileocaecalbereichs von klinisch gesund erscheinenden Schlachtrindern untersucht (MERKAL et al. 1987). Die kulturellen Ergebnisse ergaben eine Prävalenz von 1,6 % bei Rindern und 2,9
% bei Milchkühen in insgesamt 32 Staaten der USA.
Von dem „Office International des Epizooties“ (OIE) wird die Paratuberkulose der Wieder- käuer als eine Liste B-Erkrankung geführt. Damit wird sie als eine Erkrankung mit sozioöko- nomischer Bedeutung und/oder Bedeutung für die menschliche Gesundheit eingestuft.
2.3.4 EMPFÄNGLICHKEIT DER WIRTSTIERE
Die Empfänglichkeit der Wirtstiere bei der Paratuberkulose-Erkrankung ist altersab- hängig. Kälber unter 30 Tagen zeigen die höchste Empfänglichkeit, jedoch treten klinische Erkrankungen in der Regel erst im Alter von 2 bis 5 Jahren auf. Bei sehr hohen Infektionsdo- sen können auch Kälber unter 12 Monaten bereits klinisch erkranken (CLARKE 1997;
HIETALA 1992). Die Resistenz gegen eine Infektion mit dem Erreger wächst mit zunehmen- den Alter des Tieres (LARSEN et al. 1975). Dies wird in Zusammenhang mit der starken,
zahlenmäßige Verringerung der M-Zellen bei adulten Tiere gebracht. So gelten Rinder über 2 Jahre in der Regel als resistent gegenüber einer Infektion. Die Schwere der klinischen Er- scheinungen ist mit zunehmenden Alter bei der Erstinfektion deutlich herabgesetzt (CHIODINI et al. 1984). Auch Risikofaktoren wie Intensivhaltung, schlechte Fütterung, sau- rer Boden und Stressfaktoren, wie Transport und Abkalbung, wirken sich begünstigend auf eine Infektion aus.
2.3.5 ERREGERAUSSCHEIDUNG
Die Erregerausscheidung mit dem Kot steht bei der Paratuberkulose im Vordergrund.
Klinisch erkrankte Rinder scheiden ca. 108 KBE/g Kot aus (CHIODINI und HERMON- TAYLOR 1993). Auch subklinisch infizierte Tiere scheiden den Erreger intermittierend mit dem Kot aus (COLLINS 1996). Dabei kann aber die Ausscheidungsrate wesentlich geringer sein als in der klinischen Phase der Erkrankung. Die Tiere scheiden ca. 101 bis 102 Erreger/g Kot aus (WHITLOCK et al. 1994). Da die Anzahl der ausgeschiedenen Erreger schwankt, scheiden nur wenige subklinisch infizierte Rinder M. paratuberculosis in ausreichender Men- ge für eine kulturelle Untersuchung aus (GAY und SHERMAN 1992).
Die Ausscheidung von M. paratuberculosis über Kolostrum und Milch scheint ebenfalls eine große Bedeutung für die Verbreitung der Erkrankung zu besitzen. Etwa ein Drittel klinisch erkrankter Kühe scheidet M. paratuberculosis mit der Milch aus (TAYLOR et al. 1981). In diesem Versuch konnte durch die parallel durchgeführte Untersuchung auf koliforme Keime eine Kontamination der Milch durch Kot ausgeschlossen werden. Bei der Untersuchung von Euterlymphknoten und Milchproben subklinisch infizierter Kühe konnte in 27 % der Lymphknoten und in 11,6 % der Milchproben M. paratuberculosis kulturell nachgewiesen werden (SWEENEY et al. 1992b). Die Untersuchungen weisen darauf hin, daß M. paratuber- culosis über hämatogene und/oder über lymphogene Infektionswege in das Euter und die be- nachbarten Lymphknoten gelangt. Die Häufigkeit des kulturellen Nachweises in Lymphkno- ten oder Milch korrelierte mit der Stärke der Ausscheidung im Kot. Die Autoren empfehlen auf Grund dieser Ergebnisse, in von Paratuberkulose betroffenenen Betrieben, Kälber generell mit Milchaustauscher zu füttern, da die Gefahr einer oralen Übertragung durch Milch von subklinisch infizierten Kühen auf Kälber besteht.
Auch in Kolostrumproben von subklinisch infizierten Kühen konnte M. paratuberculosis kulturell nachgewiesen werden (STREETER et al. 1995). Dabei konnte der Erreger in 36,4 % der Kolostrumproben von Kühen, die M. paratuberculosis in starken Maße mit dem Kot aus- scheiden, und in 16 % der Kolostrumproben von geringgradig ausscheidenen Kühen nachge- wiesen werden. Da diese Werte wesentlich höher sind als die bei entsprechenden Untersu- chungen in Milchproben, stellt das Kolostrum eine gefährliche Infektionsquelle für Kälber auch bei subklinisch infizierten Kühen dar.
Weiterhin ist belegt, daß M. paratuberculosis aus Uterusspülflüssigkeit klinisch erkrankter Kühe isoliert werden kann (ROHDE und SHULAW 1990). Ebenso konnte gezeigt werden, daß klinisch erkrankte Bullen (LARSEN und KOPECKY 1970) und auch subklinisch infi- zierte Bullen (LARSEN et al. 1981) M. paratuberculosis mit dem Samen ausscheiden.
2.3.6 ÜBERTRAGUNGSWEGE
Die Infektion der Tiere erfolgt vor allem postnatal durch orale Aufnahme des Erregers im Kälberalter, über erregerhaltiges Kolostrum oder über kotverschmierte Zitzen. Es liegen jedoch keine Angaben über die Höhe der infektiösen Dosis vor (SWEENEY 1996). Tiere, die den Erreger mit dem Kot ausscheiden, können direkt Weiden, Futter oder auch Wasserstellen kontaminieren. Ferner kann der Landwirt direkt oder indirekt, über kontaminierte Geräte, die Umgebung des Kalbes mit M. paratuberculosis kontaminieren (SWEENEY 1996).
Auch die intrauterine Infektion scheint eine bedeutsame Rolle zu spielen. Für Feten von kli- nisch erkrankten Kühen besteht ein Risiko von 26,4 %, daß sie sich intrauterin mit dem Erre- ger der Paratuberkulose infizieren (SEITZ et al. 1989). Dieses Risiko wird für subklinisch infizierte Tiere mit knapp 10 % angegeben (SWEENEY et al. 1992c). Der Nachweis gelang allerdings nur bei Tieren, die den Erreger auch in großen Mengen mit dem Kot ausschieden.
Die intrauterin infizierten Kälber entwickeln keine meßbare Immunantwort (LARSEN et al.
1975). Aus der Untersuchung der BVD-Ätiologie ist bekannt, daß die im zweiten Drittel der Trächtigkeit infizierten Kälber zu immuntoleranten Ausscheidern werden. Diese Möglichkeit muß auch bei der intrauterinen Infektion mit M. paratuberculosis in Betracht gezogen wer- den. Beim Embryotransfer ist eine Übertragung der Erkrankung vom infizierten Empfänger-
tier auf den Fetus möglich. Empfängertiere sollten daher aus nachweislich Paratuberkulose- freien Betrieben stammen.
Im Samen von infizierten Bullen konnte M. paratuberculosis nachgewiesen werden. Jedoch konnte experimentell eine Übertragung des Erregers durch den Deckakt oder durch künstliche Besamung nicht bewiesen werden (SWEENEY 1996). Für die künstliche Besamung besteht ein nur geringes Risiko, wenn Kotproben der Spenderbullen regelmäßig kulturell untersucht werden (LARSEN et al. 1981). Allerdings wurde auf die möglichen Gefahren einer Übertra- gung der Paratuberkulose durch die künstliche Besamung hingewiesen (PHILPOTT 1993).
2.3.7 WIRTSCHAFTLICHE BEDEUTUNG
Wirtschaftliche Schäden entstehen einmal durch den direkten Verlust oder den gerin- gen Schlachterlös von Tieren, die klinisch an Paratuberkulose erkrankt sind. Aber insbesonde- re subklinisch infizierte Tiere können durch eine geringere Milchleistung und verminderte Fertilität wirtschaftliche Schäden verursachen (HUTCHINSON 1996). Der Abfall in der Milchleistung bei Tieren, die klinisch an Paratuberkulose erkrankt sind, ist beachtlich. So produzieren erkrankte Kühe im Durchschnitt über 15 % weniger Milch als nicht infizierte Kühe. Subklinisch infizierte Rinder produzieren durchschnittlich ca. 5-15 % weniger Milch als nicht infizierte Rinder (RIEMANN und ABBAS 1983; WILSON et al. 1993). Im Ver- gleich zu vorangegangenen Laktationen konnte für ein klinisch erkranktes Tier ein Rückgang von bis zu 19,5 % (BENEDICTUS et al. 1987) und für ein subklinisch infiziertes Tier ein Rückgang von 6 % ermittelt werden (HUTCHINSON 1996). Beim Vergleich der Milchlei- stung ELISA-positiv mit ELISA-negativ getesteter Kühe war der Rückgang in der ELISA- positiven Versuchsgruppe signifikant (NORDLUND et al. 1996).
Die Erkrankung nimmt auch Einfluß auf die Milchinhaltsstoffe. So betrug der Rückgang des Fett- und Proteingehaltes in der Milch 21 % für klinisch erkrankte und 17,5 % für subklinisch erkrankte Rinder (BENEDICTUS et al. 1987).
Ebenso darf die Anzahl der Tiere, die aufgrund von Sekundärerkrankungen, wie Mastitis und Sterilität, geschlachtet werden, nicht unterschätzt werden (MERKAL et al. 1975). Ein Zu- sammenhang zwischen klinischer Mastitis und Paratuberkulose konnte jedoch nicht doku- mentiert werden (WILSON et al. 1993). Allerdings konnten andere Autoren demonstrieren,
daß bei der serologischen Untersuchung von 304 Milchviehherden in Ontario ein serologisch positives Ergebnis mit einem erhöhten Zellgehalt der Milch korreliert war (MCNAB et al.
1991b). Auch die Angaben über Zwischenkalbezeiten sind widersprüchlich. Die Zwischen- kalbezeiten infizierter Kühe betragen nach einer Untersuchung 15,18 Monate bei serologisch positiven Kühen im Gegensatz zu 13,45 Monaten bei negativ getesteten Kühen (RIEMANN und ABBAS 1983). Im Gegensatz dazu wurde in einer weiteren Studie eine Zwischenkalbe- zeit von 12,65 Monaten bei kulturell positiven Kühen und 13,08 Monaten bei kulturell nega- tiven Tieren ermittelt (DINSMORE 1986).
2.4 Bekämpfung und Sanierung
2.4.1 THERAPIE
Die Paratuberkulose ist nicht heilbar. Daher ist eine Therapie, die eine vorübergehende Besserung der klinischen Symptome bewirkt, nur bei genetisch wertvollen Tieren angezeigt.
Diese müssen während der folgenden Zeit getrennt gehalten werden, da sie weiterhin den Er- reger mit dem Kot ausscheiden. Die Therapie ermöglicht es, von den Tieren hochwertige Em- bryo- oder Samenproben zu entnehmen (ST JEAN 1996).
Die Zielzellen für M. paratuberculosis sind die intestinalen Makrophagen, deshalb müssen wirksame Therapeutika zellwandgängig sein. Nach Isoniazid-Behandlung für 26 Tage waren Kühen bis zu 6 Monate nach dem Ende der Therapie klinisch unauffällig (BALDWIN 1976).
Auch Clofazimin induziert eine klinische Remission, verhindert aber nicht die Ausscheidung des Erregers. Im Gegensatz dazu zeigen mit Streptomycin oder Dapson behandelte Tiere be- reits 3 bis 4 Wochen nach dem Ende der Therapie wieder klinische Symptome. Derzeit stellt Isoniazid, evtl. in Kombination mit Rifampicin, das Mittel der Wahl dar (ST JEAN 1996). Die Kosten dieser Behandlung sind untragbar, und die Rückstände in dem Lebensmittel Fleisch sind als bedenklich anzusehen.
2.4.2 IMPFUNG
Erstmals im Jahr 1926 wurde eine Impfung gegen Paratuberkulose beschrieben (VALLEE und RINJARD 1926). Zur Zeit wird in den USA ein Hitze-inaktivierter Impfstoff
(SWEENEY 1996), in Europa auch ein Lebendimpfstoff verwendet. Die bisher verwendeten Impfstoffe bieten zwar Schutz vor klinischen Erscheinungen, verhindern aber nicht die Infek- tion sowie die spätere Ausscheidung des Erregers (CHIODINI 1996). Allerdings konnte teil- weise beobachtet werden, daß geimpfte Tiere den Erreger in geringeren Mengen ausscheiden als nicht geimpfte Kühe. Als problematisch erwiesen sich jedoch die starke Kreuzreaktion mit bovinem Tuberkulin und die großen Granulome, die sich an der Injektionsstelle bilden kön- nen.
Anhand eines Impfversuchs in zwei Milchviehbetrieben in den Niederlanden konnte doku- mentiert werden, daß die Zahl der aufgrund klinischer Paratuberkulose geschlachteten Rinder als auch die Zahl der subklinischen Fälle gesenkt werden konnte (WENTINK et al. 1994).
Die Impfung soll durch die Verminderung des Infektionsdrucks und die Reduktion der sub- klinischen und klinische Fälle einen wirtschaftlichen Vorteil bieten (VAN SCHAIK et al.
1996).
Bei einem Impfversuch in Ungarn konnte die Ausscheidungsrate von M. paratuberculosis im Kot deutlich abgesenkt, aber der Erreger nicht eliminiert werden (KORMENDY 1994). Da- hingegen stieg die Anzahl positiver und verdächtiger Reaktionen mit bovinem und aviärem Tuberkulin im Tuberkulintest.
2.4.3 SANIERUNG
In Deutschland wurden von einigen Bundesländern Bestrebungen zur Sanierung Pa- ratuberkulose-infizierter Rinderbestände eingeleitet.
In Nordrhein-Westfalen ist seit 1992 eine „Richtlinie für die Sanierung von mit Paratuberku- lose infizierten Rinderbeständen“ in Kraft.
In Niedersachsen wird seit 1990 ein durch die Niedersächsische Tierseuchenkasse geförderter Versuch zur Bestandssanierung Paratuberkulose-infizierter Milchviehherden durchgeführt (REHM 1999). Die „Satzung über die Gewährung von Beihilfen bei der Paratuberkulose der Rinder“ wurde resultierend aus den Ergebnissen im Jahr 1998 überarbeitet und genehmigt.
2.5 Nachweis und Diagnose
2.5.1 DIREKTER ERREGERNACHWEIS
2.5.1.1 Mikroskopischer Erregernachweis
Der mikroskopische Erregernachweis wird als schnell durchzuführende Methode bei der Untersuchung von Kot- und Rektumschleimhautproben sowie postmortal bei der Untersu- chung von Mesenteriallymphknoten angewendet. Zur Darstellung von Mykobakterien wird die ZIEHL-NEELSEN Färbung (DREWS 1983) als Methode der Wahl angesehen. Charakte- ristisch für M. paratuberculosis sind schlanke, deutlich rot gefärbte Stäbchen, die in Nestern liegen. Diese typische Lagerung ist durch die Ausbildung interzellulärer Filamente bedingt (MERKAL 1973). Einzeln liegende, säurefeste Stäbchen können bei der mikroskopischen Untersuchung nicht gewertet werden, da es sich meist um atypische, saprophytäre Mykobak- terien handelt, die auch im Kot gesunder Tiere vorkommen. Die Mikroskopie eignet sich zur Bestätigung eines klinischen Befundes. Sie ist aber aufgrund mangelnder Sensitivität zur Er- kennung subklinisch erkrankter Tiere ungeeignet (MERKAL et al. 1968). Andere Autoren empfehlen das mikroskopische Verfahren nicht nur aufgrund der schnellen Durchführbarkeit, sondern auch zur Absicherung der Diagnose bei klinisch erkrankten Tieren in Verbindung mit serologischen Methoden (SCHLIESSER und SCHAAL 1984). Der direkte mikroskopische Nachweis von M. paratuberculosis gelingt allerdings nur in ca. 25 bis 35 % der kulturell- positiv getesteten Kotproben, bzw. 60 % der kulturell positiv getesteten Lymphknoten (HIETALA 1992).
2.5.1.2 Kultureller Erregernachweis
Erschwerend für die Anzüchtung von M. paratuberculosis in vitro sind die hohen Nährbodenansprüche des Erregers und sein extrem langsames, strikt an das Vorhandensein von Mycobactin gebundenes Wachstum. Wegen der langen Bebrütungszeit müssen Begleit- keime durch Zusatzstoffe im Nährboden gehemmt werden. Auch das Probenmaterial muß vor der Beimpfung dekontaminiert werden.
Die kulturelle Untersuchung von Ileocaecallymphkoten gilt bis heute als der zuverlässigste Test für den Nachweis von M. paratuberculosis und wird deshalb auch als „Goldstandard“
bezeichnet (MERKAL et al. 1987). Allerdings birgt diese Methode keine 100 % Sensitivität (WHITLOCK et al. 1997). So gelang in 18 % der Kühe, die einen positiven Befund in der kulturellen Kotuntersuchung aufwiesen, kein Nachweis aus den Ileocaecallymphknoten.
Bei der kulturellen Anzucht werden flüssige oder feste Nährmedien mit und ohne Zusatz von Mycobactin mit Lymphknotenmaterial inokuliert und für mindestens 3 Monate bei 37°C be- brütet. Die Diagnose, daß es sich um M. paratuberculosis handelt, kann gestellt werden, wenn langsam wachsende, Mycobactin-abhängige, in Haufen liegende, säurefeste Stäbchen nach- gewiesen werden.
Der kulturelle Nachweis des Erregers in Kotproben gelingt nur, wenn mindestens 10-100 vermehrungsfähige Keime pro Gramm Kot vorhanden sind (WHIPPLE et al. 1992). Der Nachweis von M. paratuberculosis im Kot von erkrankten Tieren gilt als 100 % spezifisch für das Vorliegen der Erkrankung (COLLINS 1996). In einer anderen Studie konnte demonstriert werden, daß ein kultureller Nachweis der Darmpassanten aus dem Kot nach oraler Aufnahme des Erregers in größeren Mengen möglich ist (SWEENEY et al. 1992a). Die Sensitivität des kulturellen Kotnachweises wird auf ca. 50 % geschätzt, da ca. die Hälfte der subklinisch infi- zierten Tiere den Erreger nicht oder nur intermittierend ausscheiden (COLLINS 1996; STA- BEL 1997).
Die für den kulturellen Nachweis von M. paratuberculosis aus dem Kot beschriebenen Ver- fahren unterscheiden sich in der Art der Dekontamination zur Unterdrückung der Begleitflora, in der eventuell durchgeführten Konzentrierung des Erreger durch Sedimentation, Zentrifuga- tion oder Filtration und der Art des verwendeten Anzuchtmediums (KIM et al. 1989; RIDGE 1993; STABEL 1997; WHIPPLE et al. 1992).
Zur Reduzierung der Begleitflora wird am häufigsten Hexadecylpyridiniumchlorid (HPC) verwendet (COLLINS 1996). Aber auch Oxalsäure, NaOH und Natriumhypochlorid werden eingesetzt. Die Zentrifugation der Proben erhöht die Kontaminationsgefahr mit Begleitkeimen (WHIPPLE et al. 1992). Dahingegen kann ein Sedimentationsverfahren Verluste der Kulturen durch Kontaminationen verringern.
Die Anzucht der Kulturen erfolgt auf Herrold’s egg yolk Medium ohne und mit Mycobactin- zusatz (HEY und HEYM). Inzwischen sind Medien auch kommerziell erhältlich (3.1.1).
Eine Alternative zur klassischen Kultivierung stellt das BACTEC System1 dar. Das dort ein- gesetzte Medium arbeitet auf der Basis eines Flüssigmediums, dem 14C-markiertes Palmitat zugesetzt ist. Das Wachstum von M. paratuberculosis kann anhand der Freisetzung von 14CO2
gemessen werden. Diese Technik in Kombination mit einem Konzentrierungsverfahren er- laubt einen schnelleren und sensitiveren Nachweis als die klassische Kultivierung (COLLINS 1996; SOCKETT et al. 1992a; WHITTINGTON et al. 1998). Ein Nachteil der Methode, die Erzeugung von radioaktiven Abfall, wird durch ein neues BACTEC System ausgeschaltet2. Dieser Vollautomat mißt die Abnahme der O2-Konzentration durch Veränderung von Fluo- reszenzsignalen in einem modifizierten Middlebrook-Medium, die aufgrund des Wachtums der Mykobakterien entsteht. Die kulturelle Diagnostik wird mittels dieses Systems bei klini- schen Materialien bis auf 24 Tage verkürzt (KÜHN und HELBING 2000).
2.5.2 SEROLOGISCHE VERFAHREN
2.5.2.1 Komplementbindungsreaktion (KBR)
Die KBR ist der erste serologische Test, der zur Diagnostik der Paratuberkulose be- schrieben wurde (BANG und ANDERSEN 1913; TWORT und INGRAM 1912). Bei der KBR handelt es sich um eine der ältesten serologischen Diagnostikmethoden, und entspre- chend zahlreich und unterschiedlich sind die Angaben über Spezifität und Sensitivität. Wäh- rend in einer Studie von einer niedrigen Spezifität und Sensitivität ausgegangen wird (COCITO et al. 1994), halten andere Autoren die KBR für durchaus vergleichbar mit den anderen serologischen Verfahren (COLLINS 1996). Die mangelnde Sensitivität ist der Schwachpunkt der KBR, so daß dieses Verfahren nur als Screening-Test angewendet werden sollte (BELLETTI et al. 1992). In Vergleichsuntersuchungen konnte die KBR die Sensitivität von neueren ELISA-Systemen nicht erreichen (MCNAB et al. 1991a).
Die KBR ist international anerkannt, und ein negatives Testergebnis ist in vielen Ländern Voraussetzung für den Import von Rindern (COCITO et al. 1994; COLLINS und SOCKETT
1 BACTEC 460 TB Becton Dickinson Laboratories, Inc., Sparks, MD
2 BACTEC MGIT 960 Becton Dickinson Laboratories, Inc., Sparks, MD
1993). Der Test ist nicht tierartspezifisch und durch seinen komplexen Aufbau nicht interna- tional standardisiert.
2.5.2.2 Agargelimmunodiffusionstest (AGIDT)
Mit diesem einfachen und kostengünstigen Verfahren kann mit geringem Aufwand in- nerhalb von 24 bis 48 Stunden eine Diagnose gestellt werden. Aber bei dem Vergleich von vier serologischen Testverfahren konnte bei einer Spezifität des Tests von 100 % nur eine Sensitivität von 26 % - die niedrigste Sensitivität aller untersuchten Verfahren – erreicht wer- den (SOCKETT et al. 1992b). Bei einem weiteren Vergleich des AGIDT mit einem ELISA- Verfahren wurde ebenfalls eine niedrigere Sensitivität des AGIDT ermittelt (CLARKE et al.
1996).
2.5.2.3 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
2.5.2.3.1 Nachweis von Antikörpern gegen M. paratuberculosis in Blut
Der diagnostische Wert des ELISA bei der Paratuberkulose ist hoch, da die Tiere lan- ge vor dem Auftreten klinischer Symptome erkannt werden. Der Antikörperspiegel steigt dann bis zum Auftreten klinischer Anzeichen an (COLLINS 1996).
Diese ELISA-Technik wurde erstmals im Jahr 1971 beschrieben (ENGWALL und PERL- MANN 1971). Zur serologischen Diagnostik der Paratuberkulose wurde das Verfahren sieben Jahre später eingeführt (JØRGENSEN und JENSEN 1978).
In den darauffolgenden Jahren wurden einige unterschiedliche ELISA-Verfahren entwickelt.
Bei der Erkennung subklinisch erkrankter Tiere weisen viele der Tests eine nur geringe Sen- sitivität und Spezifität auf (BECH-NIELSEN et al. 1992; COLLINS et al. 1991). Die Spezi- fität konnte durch Präabsorption der diagnostischen Seren mit einer Suspension von M. phlei gesteigert werden. (YOKOMIZO et al. 1985). Andere Autoren demonstrierten, daß die Präab- sorption mit M. phlei keine wesentlichen Vorteile erbringt (HILBINK et al. 1994).
Die beschriebenen ELISA-Methoden unterscheiden sich hinsichtlich der Präparation und der Qualität des Antigens, welches zum Beschichten der Mikrotiterplatten benutzt wird. Antige- ne, die einige Autoren (COLLINS und SOCKETT 1993; YOKOMIZO et al. 1988) in ihren
Arbeiten einsetzten, wurden aus einem M. paratuberculosis Stamm 18 isoliert, der sich später aufgrund molekularbiologischer Differenzierung als M. avium Stamm 18 herausstellte (CHIODINI 1993). Ein rekombinantes Polypeptid wurde als Antigen in einem anderen ELI- SA-System eingesetzt (VANNUFFEL et al. 1994). Es handelt sich hierbei um ein immunoge- nes 34-kDA-Protein. Die Kreuzreaktionen mit M. bovis und dem nahverwandten M. avium gingen deutlich zurück (DE KESEL et al. 1993).
Auch ein Zellwandbestandteil, das Lipoarabinomannan (LAM), wird als Antigen bei einigen ELISA-Systemen eingesetzt (JARK 1996; SUGDEN et al. 1986; SUGDEN et al. 1989;
SWEENEY et al. 1994).
Eine vergleichende Studie zeigte für den LAM-ELISA eine signifikant höhere Sensitivität als für einen ELISA mit einem aus dem M. avium Stamm 18 isolierten Antigen (REICHEL et al.
1999).
Die drei zur Zeit in Deutschland kommerziell erhältlichen ELISA-Systeme sind die von Bun- desinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin (BgVV) zugelasse- ne Testkits der Firmen Idexx, Wörrstadt (HerdChek™ Mycobacterium paratuberculosis), Riemser Arzneimittel GmbH, Insel Riems (ELISA zur Serodiagnostik der bovinen Paratuber- kulose) und Svanova, Schweden (Svanovir® Paratuberkulose ELISA).
Der „HerdChek™ Mycobacterium paratuberculosis“- ELISA hat, mit Bezug auf die kultu- relle Kotuntersuchung, eine Sensitivität von 57 % und eine Spezifität von 99,7 % (ROSSITER und BURHANS 1996). In diesem ELISA-System werden die Seren mit M.
phlei-Extrakt vorabsorbiert. Er gilt in den USA als das zur Zeit sensitivste serologische Test- system (COLLINS 1996). Das im Test verwendete Festphasenantigen stammt aus dem M.
avium Stamm 18.
Der „ELISA zur Serodiagnostik der bovinen Paratuberkulose“ (Riemser Arzneimittel GmbH, Insel Riems) beruht auf einem ELISA-System, das in einem Feldversuch mit 327 Kühen eine Sensitivität von 57 % und eine Spezifität von 98 % aufwies (MILNER et al. 1990). Auch in diesem ELISA-System werden die Seren mit M. phlei-Extrakt vorabsorbiert.
Der „Svanovir® Paratuberkulose ELISA“, ein auf LAM basierender ELISA, wurde als einzi- ger der drei ELISA-Systeme mit Bezug auf die kulturelle Untersuchung der Ileocaecal- lymphknoten evaluiert. Er hat in ersten Untersuchungen eine scheinbare Spezifität von 99 % und eine scheinbare Sensitivität von 93,75 % (JARK 1996; JARK et al. 1997).
2.5.2.3.2 Nachweis von Antikörpern gegen M. paratuberculosis in Milch
Ein ELISA zur Detektion von Antikörpern gegen M. paratuberculosis in Milchproben stellt aufgrund der leichten Probennahme eine kostengünstige Alternative zum Blut-ELISA dar (RICHARDS 1990).
Auf der Basis eines LAM-ELISA konnte eine gute Korrelation zwischen Blut- und Milch- ELISA ermittelt werden (SWEENEY et al. 1994). Milch- und Blutproben von 764 Kühen aus 13 Betrieben, von denen 2 Betriebe bisher keine Paratuberkulose-Erkrankungen zu verzeich- nen hatten, wurden mittels LAM-ELISA getestet. Ebenso wurden Kotproben dieser Tiere kulturell auf M. paratuberculosis untersucht. Der kulturelle Nachweis von M. paratuberculo- sis wurde als „Goldstandard“ angesehen. Die Inter-Assay-Variation betrug für den Milch- ELISA 0,19 und für den Blut-ELISA 0,15. Die Validierung des Milch-ELISA erfolgte anhand der ROC-Kurve. Es ergaben sich bei einer Sensitivität von 50 % bzw. 60 % eine Spezifität von 87 % bzw. 83 %. Der Korrelationskoeffizient betrug r = 0,71. Dies weist auf eine gute Korrelation zwischen Blut- und Milch-ELISA hin.
Ein anderer Milch-ELISA wurde auf der Basis eines Protoplasma-Antigens (PPA-3) entwik- kelt (HARDIN und THORNE 1996). Die Autoren konnten nachweisen, daß eine Vorabsorp- tion der Milch mit M. phlei-Extrakt keine signifikanten Unterschiede der ELISA-Ergebnisse ergab. Die Korrelation der Ergebnisse des Milch- und Blut-ELISA war sehr gering (r = 0,08).
Anhand von Untersuchungen an Tankmilchproben mittels eines kommerziell erhältlichen ELISA-Systems wurde die Prävalenz in dänischen Milchviehherden bestimmt (NIELSEN et al. 2000). Als Antigen wurden Bestandteile des M. avium Stammes 18 eingesetzt. Die Auto- ren ermittelten eine Sensitivität von 97 % und eine Spezifität von 86 %. Der ELISA war nur wenig zuverlässig, da geringe Schwankungen des „Cut off“ Wertes die Prävalenz extrem ver- änderten.
2.5.3 POLYMERASE KETTENREAKTION (PCR)
Die PCR ist eine schnelle Methode zur „In-Vitro-Amplifikation“ von Nukleinsäuren.
Diese ermöglicht es, einen bestimmten Zielabschnitt (Target) einer vorliegenden Nukleinsäu- re (Template-DNA), z. B. eines Krankheitserregers, selektiv zu vermehren. Das Orginalproto- koll für die PCR wurde erstmals 1985 veröffentlicht (SAIKI et al. 1985).
2.5.3.1 Lysis und DNA-Präparation von Mykobakterien für die PCR
Die mechanische Lysis von Mykobakterien mit Glas- oder Zirkoniumbeads in einem
„Bead beater“ wird von mehreren Autoren beschrieben (BLEUMINK-PLUYM et al. 1994;
CHALLANS et al. 1994; COLLINS et al. 1993). Die Bakteriensuspension wird mit den Beads gemischt und in dem „Bead beater“ für einige Minuten bei einer Frequenz von 100 Hz kräftig geschüttelt. Die Zellwände werden so zerstört und die DNA freigesetzt.
Auch alleiniges Kochen der Suspension für 15 Minuten (MOSS et al. 1991) bzw. 20 Minuten (HURLEY et al. 1993) setzte geeignete DNA zur Verwendung in der PCR frei.
Andere Autoren präparierten die DNA von Mykobakterien enzymatisch und setzten dazu Subtilisin, Lysozym sowie SDS und Pronase ein (VISUVANATHAN et al. 1989). Ebenfalls eine enzymatische Methode mit Lysozym und Proteinase K, bei der nach Cäsiumchloridbe- handlung 30 Volumina destilliertes Wasser hinzugegeben wurde, um durch osmotischen Schock die Zellwände zu sprengen, ergab eine Ausbeute von 1,2-2 mg DNA/g Zellfeuchtge- wicht (BOSE et al. 1993).
2.5.3.2 DNA-Extraktion
Meist wird das Untersuchungsmaterial nach dem Zellaufschluß einer weiteren Be- handlung zur Reinigung und gleichzeitigen Konzentrierung der Nukleinsäuren unterzogen.
Eine Chloroform-Phenolextraktion ist die klassische Methode (SAMBROOK et al. 1989). Die hydrophilen DNA-Moleküle reichern sich in der wäßrigen Phase an und können aus dieser zurückgewonnen werden. Die Präzipitation der gelösten DNA erfolgt mit Hilfe von Ethanol.
Zum Nachweis von M. tuberculosis in Gewebeproben wurde nach enzymatischen Aufschluß der Proben die DNA durch Chloroform-Phenolextraktion mit anschließender Ethanolfällung gewonnen (TAN et al. 1997).
Die Grundlage für die Aufreinigung von Nukleinsäuren über eine Silikamatrix ist die Beob- achtung, daß DNA in Gegenwart chaotroper Agentien wie Natriumjodid und Natriumperchlo- rat oder Guanidin-Thiocyanat bzw. –hydrochlorid an Silika (Siliziumdioxid)- bzw. Glasparti- kel bindet (BOOM et al. 1990). Liegen hohe Konzentrationen chaotroper Stoffe vor, werden Nukleinsäuren an die Silika-Partikel gebunden und lösen sich von diesen bei niedrigen Kon- zentrationen der chaotropen Substanzen wieder ab. Durch diese selektive Bindung kann DNA von Störstoffen befreit und danach durch Schwächung der Bindung wieder von der Matrix
gelöst werden. Trotz dieser DNA-Aufreinigungsmethode wurde in einer weiteren Untersu- chung zum Nachweis von M. tuberculosis demonstriert, daß einige Proben noch PCR- Inhibitoren enthielten (NOORDHOEK et al. 1995).
Zunehmend werden auch DNA-Extraktionskits auf der Basis von Chloroform-Extraktion oder DNA-bindenden Matrices angeboten und eingesetzt. Die DNA-Extraktionskits sind oft zeit- sparend und bieten aufgrund des standardisierten Verfahrens eine gute Reproduzierbarkeit.
DNA-bindende Matrices sind darüber hinaus mit einer geringeren anfallenden Menge an toxi- schem Sondermüll verbunden. Es werden DNA-Extraktionskits für nahezu alle DNA-haltigen Medien angeboten.
2.5.3.3 Aufreinigung von Milchproben für die PCR
Um aus dem komplexen, die PCR vollständig hemmenden Medium Milch (POWELL et al. 1994) Erreger-DNA zu isolieren, werden mehrere Möglichkeiten genutzt.
Zum Nachweis von Coxiella burnettii aus Milch wurde nach Proteinase K-Abbau der Protein- strukturen die DNA mittels Chloroform-Phenolextraktion gewonnen (WILLEMS et al. 1994).
Die Autoren erreichen mit dieser Methode eine Nachweisgrenze von einem Erreger pro ml Milch. Ebenfalls zum Nachweis von Coxiella burnettii aus Milch wurde von einem anderen Autor nach Beschallung, Entrahmung, Auslabung und Ultrazentrifugation der Molke zur DNA-Extraktion ein kommerziell erhältliches DNA-Extraktionskit (Qiamp® Tissue Kit, Qia- gen, Hamburg) eingesetzt (EDINGLOH et al. 1999; EDINGLOH 1999). Die Nachweisgrenze lag bei 4 Erregern pro ml Milch.
Dasselbe DNA-Extraktionskit wurde in einer Arbeit zum Nachweis von Mycobacterium tu- berculosis in Milch, Lymphknoten und Nasenabstrichen eingesetzt (VITALE et al. 1998). Die Milchproben wurden enzymatisch vorverdaut und die DNA laut Anleitung extrahiert.
Erstmals im Jahr 1996 wurde der Nachweis von M. paratuberculosis in Milchproben be- schrieben (MILLAR et al. 1996). In dieser Untersuchung wurden die Milchproben durch Zentrifugation in Pellet, Fett und Milchserum fraktioniert. Die Mykobakterien wurden durch 20 minütiges Kochen der unterschiedlichen Milchfraktionen aufgeschlossen und der Über- stand nach Zentrifugation direkt in der PCR eingesetzt. Andere Autoren beschrieben den Nachweis von M. paratuberculosis in Milchproben, die enzymatisch vorbehandelt wurden (HERMAN et al. 1999).
2.5.3.4 Ausschluß falscher Ergebnisse in der PCR
Häufig auftretende Probleme beim Einsatz der PCR sind falsch negative Ergebnisse infolge einer Hemmung der Polymerase und falsch positive Ergebnisse durch Kontamination der PCR-Ansätze mit der gesuchten DNA.
Eine zentrale Rolle bei der Hemmung der Polymerase spielt dabei die Verfügbarkeit des Co- faktors Magnesium (ROLFS et al. 1992). Hemmstoffe binden häufig freies Magnesium. Zu den Hemmstoffen, die aus der Probe bei der Aufbereitung nicht ausreichend eliminiert wur- den, gehören EDTA, Proteine, Heparin u.v.a.. Auch können Reste der Lösungen, die zur DNA-Isolierung eingesetzt wurden, wie SDS und Proteinase K, die PCR empfindlich stören.
Zwar kann die Konzentration der Hemmstoffe durch Verdünnung der DNA-Lösung gesenkt werden, aber somit sinkt auch die Sensitivität der PCR. Empfehlenswert ist die erneute Auf- reinigung der Probe. Als Maßnahmen zur Kontrolle der PCR-Ansätze sollte zu jedem Ansatz ein Vergleichsansatz mit einem Gemisch aus Proben-DNA und zugesetzter amplifizierbarer DNA erstellt werden.
Durch Kontaminationen sowie durch unspezifische Reaktionen kann es zu falsch positiven Ergebnissen kommen. Die Kontaminationsgefahr ist besonders hoch in der Diagnostik, da es zu einer Anreicherung von DNA im Labor kommt. Die Kontrolle der PCR-Ansätze kann durch einen Ansatz, dem statt DNA Wasser zugesetzt wurde, gewährleistet werden.
Daraus ergibt sich, daß vor allem für den Erregernachweis aus klinischem Probenmaterial eine genaue Kenntnis über Hemmstoffe und Kontaminationsquellen erforderlich ist (IEVEN und GOOSSENS 1997). Es kommt bei einer möglichst einfach gestalteten Prozedur der DNA-Extraktion auf die sichere Reproduzierbarkeit der Ergebnisse an.
2.5.3.5 PCR zum Nachweis des Erregers aus klinischem Untersuchungsmaterial
Ein spezifischer Nachweis von M. paratuberculosis in Kot mittels PCR stellt zwar ei- ne schnelle Alternative für den Nachweis von mittel- bis hochgradig ausscheidenden Kühen dar; er ist jedoch als Nachweis von nur mit wenigen Mykobakterien belastetem Kot ungeeig- net, da mindestens 104 KBE/g Kot zum Nachweis benötigt werden (VARY et al. 1990;
WHIPPLE et al. 1992).
Ein kommerziell erhältliches Kit (DNA-Probe®-Test, Idexx, Wörrstadt) mit dem ein IS900 Fragment einer Länge von 229 bp aus aufbereiteten Kotproben vervielfältigt und dann mit
einer Gensonde nachgewiesen wird, wurde in einer vergleichenden Untersuchung als der kulturellen Untersuchung unterlegen gewertet, da eine Sensitivität von 55 % gegenüber 89 % und 74 % in zwei verschiedenen kulturellen Verfahren zu verzeichnen war (SOCKETT et al.
1992a). Andere Autoren konnten in Untersuchungen demonstrieren, daß mittels DNA- Probe®-Test lediglich ein Drittel der kulturell positiven Kotproben identifiziert werden konn- ten (WHIPPLE et al. 1992). Neuere Untersuchungen unterstützen diese Ergebnisse (ZIMMER et al. 1999). In einer anderen Untersuchung konnte in der PCR bei allen Proben mit einem Gehalt von > 1600 KBE/g Kot M. paratuberculosis-spezifische DNA nachgewiesen werden.
Bereits ab einem Gehalt von 480 KBE/g Kot sank die Sensitivität allerdings auf 60 % (COLLINS et al. 1993).
Für einen weiteren PCR-gestützten Nachweis von M. paratuberculosis aus dem Kot ermittel- ten die Autoren eine Sensitivität von 34 % und eine Spezifität von 100 % (SOCKETT et al.
1992a).
Der Nachweis des IS900 von M. paratuberculosis aus Milch wurde erstmals 1996 beschrie- ben (MILLAR et al. 1996). Die Autoren untersuchten 312 pasteurisierte Milchproben in der Zeit von September 1991 bis März 1993 und darüber hinaus noch Milchproben von sicher nicht infizierten und infizierten Kühen. Die Nachweisgrenze lag bei 200 bis 300 Keimen pro ml Milch. Bei den künstlich mit lebenden Erregern kontaminierten Milchproben konnte nach Zentrifugation der Erreger mittels PCR im Pellet oder im Rahm nachgewiesen werden. Den Autoren war es möglich in 7 % der pasteurisierten Milchproben M. paratuberculosis nachzu- weisen.
Bei Einsatz einer nested-PCR kann die Nachweisgrenze auf 30 KBE/ml Milch gesenkt wer- den (HERMAN et al. 1999). Auch hier konnte der Erreger im Milchfett nachgewiesen wer- den.
Für einen PCR-gestützten Nachweis des IS900 von M. paratuberculosis aus Lymphknoten wurde eine Methode zur Zelllyse auf der Basis der Zerstörung des Erregers mit Zirkonium- beads in einem „Bead beater“ beschrieben (CHALLANS et al. 1994). Es folgt eine Chloro- form-Phenolextraktion. Die Nachweisgrenze lag bei 35-45 Keimen/g Gewebe.
3 Material und Methoden
Rezepte für Lösungen, Puffer und Medien sind jeweils im Anhang aufgeführt.
3.1 Material
3.1.1 BAKTERIENSTÄMME UND MEDIEN
Die Untersuchungen wurden mit dem M. paratuberculosis-Stamm 6783 aus der Stammsammlung des Instituts für Mikrobiologie und Tierseuchen durchgeführt. Es handelt sich hierbei um einen Mykobakterienstamm, der in Norddeutschland isoliert wurde. Der Stamm zeigt ein mycobactinabhängiges Wachstum und kann zusätzlich durch den Nachweis des Insertionselementes IS900 mittels PCR als M. paratuberculosis identifiziert werden. Der Bakterienstamm ist bei der Deutschen Gesellschaft für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM, Braunschweig) unter der DSM-Nr. 10129 hinterlegt.
Tabelle 1: Herkunft der Bakterienstämme
Isolat Herkunft
M. avium ssp. paratuberculosis Isolat 6783
klinisches Isolat (DSM 10129) M. avium ssp. avium
DSM 44158
Deutsche Gesellschaft für Mikroor- ganismen und Zellkulturen (DSM,
Braunschweig) M. phlei
NCTC 8151
National Collection of Type Cultu- res (NCTC, Central Public Health
Laboratory, Colindale, UK)
Alle Isolate wurden zunächst aus Stammkulturen des Institutes auf Middlebrook Me- dium (9.2) angezogen. M. paratuberculosis 6783 und M. phlei wurden dann in Watson-Reid- Medium (9.2), M. avium 44158 in Long Medium (9.2) subkultiviert.
3.1.2 PROBENGEWINNUNG
3.1.2.1 Blutproben
Blutproben wurden durch Punktion der Vena coccygea mediana gewonnen und nach etwa einer Stunde Lagerzeit bei Raumtemperatur bei mindestens 1500 x g3 für 10 Minuten zentrifugiert. Das Serum wurde abpipettiert und bei –20°C4 längerfristig gelagert.
3.1.2.2 Milchproben
Es wurden zweimal 10 ml als Viertelgemelkprobe zu Beginn der Melkzeit steril ent- nommen. Milchproben wurden bis zu einer Woche bei 4°C und längerfristig bei –20°C
4gelagert.
3.1.2.3 Kotproben
Kotproben wurden aus dem Enddarm der Tiere entnommen. Die Proben wurden bei –20°C4gelagert.
3.1.2.4 Organproben
Nach der Schlachtung wurden die Ileocaecallymphknoten entnommen. Die Lymphknoten wurden bei –20°C4 gelagert.
3 C312, Jouan, Unterhaching
4 Liebherr, Ochsenhausen
3.2 Methoden
3.2.1 ANZUCHT DES ERREGERS
Für die Kultivierung von M. paratuberculosis wurden 800 ml-Zellkulturflaschen (NUNC, Wiesbaden) mit Watson-Reid-Medium verwendet. Von einer Reinkultur wurden Bakterien mit einer Impföse entnommen und in ca. 2 ml n-Pentan vereinzelt. Die Mykobakte- riensuspension wurde mit einer Glaspipette auf die Oberfläche des Mediums aufgetragen. Die Bakterien blieben nach der Verdunstung des n-Pentans an der Oberfläche liegen. Das Wachstum vollzog sich inselartig. Die Inkubation erfolgte unter aeroben Bedingungen bei 37°C5. Nach ca. zwei Monaten konnten die Bakterien geerntet werden.
3.2.2 ANZUCHT ANDERER MYKOBAKTERIEN
M. avium wurde in Flüssigmedium nach Long und M. phlei in Watson-Reid-Medium exclusive Mycobactin bei 37°C aerob angezüchtet5.
3.2.3 BESTIMMUNG DER ERREGERDICHTE
(DREWS 1983)
Die Bakterienzelldichte wurde durch Messung der optischen Dichte von Flüssigkultu- ren bei 660 nm(OD660) gegen unbeimpftes Medium ermittelt6. Nach Ernte der Mykobakterien wurde die OD660 mit sterilem PBS (9.8) auf 0,1 eingestellt. Die Zählung erfolgte in der THOMA-ZEISS-Zählkammer7. Die Zellzahl wurde gemäß der Formel: Zellzahl gesamt x 15,625 x Vorverdünnung x 1000 = Bakterien pro ml ermittelt.
5 Brutschrank, Memmert, Schwabach
6 Spectralphotometer Ultrospec III, Pharmacia, Freiburg
7 Mikroskop: Dialux 22 EB, Leitz, Wetzlar
3.2.4 MIKROSKOPISCHER UND KULTURELLER NACHWEIS VON M. PARATUBERCULOSIS
3.2.4.1 Mikroskopie
Die mikroskopische Untersuchung von Kotproben und Lymphknoten auf säurefeste Stäbchen wurde mittels ZIEHL-NEELSEN Färbung durchgeführt. Die Kotproben wurden dünn auf einen Glasobjektträger ausgestrichen, luftgetrocknet und hitzefixiert. Bei den Lymphknotenproben wurde eine frische Schnittfläche des Lymphknotens auf einen Objekt- träger ausgestrichen, ebenfalls luftgetrocknet und hitzefixiert. Die Ausstriche wurden nach ZIEHL-NEELSEN (DREWS 1983) gefärbt und mikroskopiert7.
3.2.4.2 Kultur
Zur kulturellen Untersuchung von Kotproben wurden ca. 3 g Kot in 5 ml 0,75 % HPC (Hexapyridiumchlorid)-Lösung suspendiert. Nach Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur wurden drei Schrägagarröhrchen (Enclitt, Oelzschau), eines mit Löwenstein-Jensen-Agar und zwei mit Mycobactin-Zusatz zur Überprüfung der Mycobactinabhängigkeit, mit dem Boden- satz beimpft.
Die Anzucht von M. paratuberculosis aus Lymphknoten erfolgte durch Ausstreichen frischer Schnittflächen von abgeflammten und unter sterilen Bedingungen aufgeschnittenen Lymphknoten auf die Nährbodenoberflächen. Sofern sich Kontaminationen zeigten, wurden die Lymphknoten wie Kotproben mit 0,75 % HPC dekontaminiert.
Sichtbare Kolonien traten nach frühestens zehn Wochen auf und wurden mikroskopisch7 mittels ZIEHL-NEELSEN Färbung auf das Vorhandensein säurefester Stäbchen untersucht.
3.2.5 ANTIGENHERSTELLUNG
(JARK 1996; RINGENA 1995)
M. paratuberculosis wurde hierzu in Flüssigmedium nach Watson-Reid angezüchtet.
Nach ca. 3 Monaten wurden die Bakterien durch Zentrifugation bei 3000 x g8 geerntet. Das Pellet wurde gewogen und mit 1 ml A. dest pro 0,6 g Bakterienfeuchtmasse resuspendiert und bei 100°C im Wasserbad für 10 Minuten inaktiviert. Die Mykobakteriensuspension wurde mittels French Press9 bei einem Druck von 15.000 psi aufgeschlossen. Die groben Zellbe- standteile wurden durch Zentrifugation (6500 x g) pelletiert. Der erhaltene Überstand wurde mit dem identischen Volumen Proteinase K-Puffer (9.7) versetzt. Die Proteinase K wurde 15 Minuten bei 37°C10 inkubiert und danach in einer Konzentration von 100 mg/g Bakterienma- sse eingesetzt. Der Verdau wurde für eine Stunde im Hitzeblock bei 37°C durchgeführt und durch Erhitzen auf 100°C für 5 Minuten beendet. Die Suspension wurde erneut bei 6500 x g zentrifugiert. Es folgte eine Filtration (Porengröße 0,45µm, Millex®HA, Millipore) des Über- standes. Das Filtrat wurde mittels Ultrafiltration weiter aufgereinigt (Centriplus®30, AMI- CON®). Das Retentat wurde bei -80°C gelagert.
3.2.6 PRÄPARATION VON FAB-FRAGMENTEN
(HARLOW und LANE 1988)
Die Immunglobuline der IgG Klasse des positiven Kontrollserums aus dem Svanovir® Paratuberkulose ELISA-Testkit (Svanova, Schweden) wurden mittels Papain gespalten und elektrophoretisch aufgetrennt, um im Western Blot zu prüfen, an welches Fragment der monoklonale Antikörper des Testkits (Svanova, Schweden) bindet. Hierzu wurden 2 ml des Serums mittels dreimaliger Zentrifugation8 in einem Zentrifugations Filter (Centriplus®30, AMICON®) in den Puffer für die Papain-Spaltung (9.7) umgepuffert und das Volumen auf 200 µl aufgefüllt. 100 µl immobilisiertes Papain wurden zweimal mit dem Puffer gewaschen und 100 µl IgG-Lösung hinzugegeben. Es folgte eine Inkubation unter Schütteln für 5 Stun-
8 Sorvall RC, Du Pont Ind., Bad Homburg
9 French Pressure Cell, American Instrument Company, Inc., Silver Spring, Maryland
den bei 37°C. Danach wurden 600 µl 10 mM Tris-HCl pH 7,5 zugegeben, der Verdau ge- mischt und zentrifugiert (9000 x g, 5 Minuten). Die ABICAP ProteinA-Mikroaffinitätssäule wurde mit 10 mM Tris-HCl pH 7,5 äquilibriert und dann der Überstand auf die Säule appli- ziert. Die nicht gebundenen Fab-Fragmente wurden mit 10 mM Tris-HCl pH 7,5 von der Säule gewaschen. Gebundene Fc-Fragmente und nicht verdaute IgG-Moleküle wurden mit 450 µl Elutionspuffer (9.7) eluiert und durch Vorlage von 50 µl Neutralisierungspuffer (9.7) neutrali- siert.
Die Fab-Fragmente in der Waschlösung konnten durch einen Zentrifugations Filter (Centri- plus®30, AMICON®) aufkonzentriert werden. Die Ausgangs-IgG-Lösung, die Fab-Fragmente und die Fc-Fragmente wurden unter nicht reduzierenden Bedingungen aufbereitet und in zwei SDS-Gelelektrophoresen (3.2.9) aufgetrennt. In einem Gel wurden die aufgetrennten Proteine mittels Coomassie-Blau®-Färbung (3.2.9.2) dargestellt; von einem weiteren wurde ein We- stern Blot (3.2.10) erstellt und mit dem monoklonalen Antikörper entwickelt.
3.2.7 DNA-PRÄPARATION VON MYKOBAKTERIEN
(BOSE et al. 1993)
Etwa 100 mg Bakterienpellet wurden zweimalig mit TE-Puffer (9.3) gewaschen. Dar- aufhin wurde das gleiche Volumen gesättigte CsCl-Lösung mit 1 % Triton-X zugegeben.
Nach gründlichen Mischen (10 Minuten) wurde die Suspension mit dem 30fachen Volumen A. dest. aufgefüllt. Nach Zentrifugation8 (4000 x g, 15 Minuten) wurde der Überstand mit Lysozym (Endkonzentration 1 mg/ml) für eine Stunde auf Eis verdaut. Nach Zugabe von SDS (Endkonzentration 0,5 %) und Proteinase K (Endkonzentration 100 µg/ml) folgte eine Inku- bation für 4 Stunden im Wasserbad bei 55°C. Der Zellsuspension wurde 1 ml Guanidium- thiocyanat (0,5 g/ml) zugegeben und bei 65°C für 30 Minuten unter Schütteln inkubiert. Dann wurden die Zelltrümmer von der Lösung durch Zentrifugation (4000 x g, 15 Minuten) ent- fernt. Aus dem Überstand wurde die DNA mittels Chloroform-Phenol-Extraktion gewonnen (SAMBROOK et al. 1989).
10 Blockthermostat BT 100, Landgraf Hannover
