Etablierung der PCR

Die PCR wurde als touchdown-PCR mit den Primern nach DORAN et al. 1994 eta-bliert. Der Ansatz hatte ein Volumen von 50 µl und setzte sich wie folgt zusammen: 20 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, Primerpaar je 5µM, 2,5 U Taq-DNA-Polymerase (Gibco, Eggenstein).

4.2.2.1 Bestimmung der Nachweisgrenze

Zur Ermittlung der Nachweisgrenzen wurde eine Suspension mit definierter Erreger-dichte benötigt. Dafür wurde von einer Erregersuspension in PBS eine Verdünnungsreihe angefertigt, die von einer Suspension mit einer optischen Dichte von 0,1 bei 660 nm ausging.

Diese Verdünnungsstufe enthielt bei mehrmaliger Zählung in der THOMA-Kammer eine Er-regerdichte von 10⁷ M. paratuberculosis pro ml. Durch Zentrifugieren (14000 rpm, 30 Minu-ten) wurden die Keime pelletiert und die Milch nachweislich nicht infizierter Kühe experi-mentell damit kontaminiert.

Im Folgenden wurde die Nachweisgrenze wiederholt an Milch von Kühen verschiedener Laktations- und Eutergesundheitsstadien ermittelt. Zur Absicherung der erhaltenen Nach-weisgrenzen wurden die Bestimmungen mehrmals durchgeführt. Die Tabelle 8 zeigt den Ver-gleich der Empfindlichkeit der PCR. In Milchproben der Hochlaktation war bei 14 Wieder-holungen eine Nachweisgrenze von mindestens 10³ Erregern pro ml Milch verifizierbar. 10³ Erreger pro ml Milch konnten auch in einer bakteriell stark belasteten Mastitis-Milch repro-duzierbar nachgewiesen werden. Für Kolostrum wurde eine Nachweisgrenze von 10⁴ Erre-gern pro ml Milch ermittelt.

Tabelle 9: Vergleich der Empfindlichkeit der Milch-PCR in experimentell kontaminierter Milch verschiedener Laktationsstadien sowie bakteriell stark belasteten Masti-tis-Milch bei mehrmaligen Wiederholungen

Nachweisgrenze (Erreger pro ml Milch)

10² 10³ 10⁴ Anzahl der

Wie-derholungen

Frühlaktation-Kolostrum 6 6

Hochlaktation 9 5 14

Milchart

Hochlaktation-bakt. Mastitis 8 8

PCR positives Ergebnis

In Abbildung 8 ist das Ergebnisse einer Nachweisgrenzenbestimmungen bei Milch aus der Phase der Hochlaktation dargestellt. Es wurde eine Nachweisgrenze von 10² Erreger pro ml Milch ermittelt. Absolut konnte somit pro PCR-Ansatz ein Erreger nachgewiesen werden, da von 1 ml Milch (10² Erreger pro ml) 200 µl im Aufreinigungskit eingesetzt, danach in 100 µl Puffer eluiert und vom Eluat 5 µl in der PCR eingesetzt wurden.

Abbildung 8: Ermittlung der Nachweisgrenze experimentell kontaminierter Milch (Hoch-laktation)

M: DNA-Marker (100 base pair ladder) Spur 1: Negativkontrolle ohne Template Spur 2: Erregerdichte 10 / ml Milch Spur 3: Erregerdichte 10² / ml Milch Spur 4: Erregerdichte 10³ / ml Milch Spur 5: Erregerdichte 10⁴ / ml Milch Spur 6: Erregerdichte 10⁵ / ml Milch Spur 7: Erregerdichte 10⁶ / ml Milch Spur 8: Erregerdichte 10⁷ / ml Milch

4.2.2.2 Interne Funktionskontrolle

Für den diagnostischen Einsatz von PCR-Tests wird neben einer standardisierbaren Probenaufbereitung eine interne Funktionskontrolle gefordert (IEVEN und GOOSSENS 1997).

Interne Funktionskontrollen können im Rahmen einer Multiplex-PCR (EDINGLOH et al.

1999) eine Aussage über die Funktionalität jedes einzelnen PCR-Ansatzes ermöglichen.

Positiver Milch wurde Mycobacterium phlei und in weiteren Vorversuchen Mycobacterium avium vor der Aufreinigung zugesetzt, um in der anschließenden PCR mit einem weiteren Primerpaar ein zweites Amplifikat zu erhalten. Die Erregerdichten wurden, wie unter 3.2.3, beschrieben bestimmt. Bei M. phlei wurde eine Region nachgewiesen, die nur einmal im Ge-nom vorkommt (Primer 264/283) (SCHEIBL 1996). Die Erregerdichte von M. phlei in der Milch mußte 10⁹ Keime/ml Milch betragen, um in der PCR ein Amplifikat zu erhalten. In dieser Keimkonzentration war es nicht mehr möglich die M. paratuberculosis spezifische DNA zu amplifizieren.

Bei M. avium mußte die Erregerdichte 10⁵ Keime/ml Milch betragen. Es handelte sich bei dem Amplifikat um einen Ausschnitt eines Insertionselements (IS 901), das mehrmals im Genom vorhanden ist. Doch auch hier war es nicht möglich gleichzeitig M. paratuberculosis spezifische DNA zu amplifizieren. In den beschriebenen Vorversuchen gelang es nicht, in einem einzigen PCR-Ansatz zwei Amplifikate zu erhalten.

Schließlich wurde als interne Funktionskontrolle M. paratuberculosis-DNA zusätzlich zum Template in der PCR eingesetzt, indem ein vollständiger PCR-Ansatz geteilt und eine Hälfte mit M. paratuberculosis-DNA versetzt wurde.

Mittels Titration der Template-DNA in der PCR konnte die geeignete Konzentration für die interne Funktionskontrolle ermittelt werden. Nach spektralphotometrischer Bestimmung er-gab sich eine DNA-Konzentration der Ausgangslösung von 0,75 µg/µl. Die geeignete Kon-zentration für die interne Funktionskontrolle betrug bei einer Verdünnung der Ausgangslö-sung von 1:10⁵ 7,5 pg/µl. Von der verdünnten Lösung wurde 1 µl pro PCR-Ansatz eingesetzt.

Abbildung 9: Bestimmung der optimalen Konzentration an M. paratuberculosis-DNA für die interne Funktionskontrolle

M: DNA-Marker (100 base pair ladder) Spur 1: Negativkontrolle ohne Template Spur 2: Verdünnung 1: 7,5x10⁴

Spur 3: Verdünnung 1: 10⁵ Spur 4: Verdünnung 1: 5x10⁵ Spur 5: Verdünnung 1: 10⁶

Abbildung 10 zeigt die Ergebnisse einer PCR-Analyse dreier verschiedener Milchproben. In der links aufgetragenen Probe (Spur 2 und Spur 3) konnte M. paratuberculosis spezifische DNA nachgewiesen werden. Die interne Funktionskontrolle ist positiv. In der mittleren Probe (Spur 4 und Spur 5) konnte keine M. paratuberculosis spezifische DNA nachgewiesen wer-den. Auch hier ist die interne Funktionskontrolle positiv. In der rechten Probe (Spur 6 und Spur 7) wurde die interne Funktionskontrolle nicht amplifiziert. Diese Probe wurde erneut aufgereinigt.

Abbildung 10: PCR-Analyse dreier ausgewählter Milchproben zur Interpretation der internen Funktionskontrolle

M: DNA-Marker (100 base pair ladder) Spur 1: Negativkontrolle ohne Template

Spur 2: Probe der Kuh 239 von 10.07.1999 mit interner Funktionskontrolle (Spur 3)

Spur 4: Probe der Kuh 282 von 10.07.1999 mit interner Funktionskontrolle (Spur 5)

Spur 6: Probe der Kuh 235 von 11.09.1999 mit interner Funktionskontrolle (Spur 7)

Als negativ gewertet wurde eine Milchprobe, wenn nur der Ansatz mit der internen Funk-tionskontrolle ein Amplifikat in der Größe von 548 bp aufwies. Wenn sowohl in dem Ansatz, indem sich nur die Probe befand, als auch in dem Ansatz mit Probe und interner Funktions-kontrolle das PCR-Produkt amplifiziert wurde, wurde die Probe als positiv bewertet. Die Pro-ben, in denen keine interne Funktionskontrolle amplifiziert werden konnte, wurden einer er-neuten Aufreinigung unterzogen.

4.2.2.3 Sequenzierung zufällig ausgewählter PCR-Produkte

Die zur Bestätigung der Amplifikate durchgeführte Sequenzierung von zwei zufällig ausgewählten PCR-Produkten bestätigte die angegebene Länge des Amplifikates von 548 bp zum Nachweis von M. paratuberculosis (DORAN et al. 1994). Die Sequenzen der ausge-wählten Amplifikate stimmten mit den Datenbankeinträgen überein.

4.3 Validierung von Milchserologie und Milch-PCR in einer Verlaufsuntersuchung