4.3 Validierung von Milchserologie und Milch-PCR in einer
4.3.1 Untersuchunsergebnisse
Kuh Nr. 209
Geburtsdatum: 07.12.1992 Abkalbetermin: 02.11.1998 / 31.10.99 (während der Verlaufsuntersuchung) Schlachttermin:17.11.1999
Ergebnisse der Eingangsuntersuchung:
Die blutserologische Untersuchung war positiv.
M. paratuberculosis konnte kulturell im Kot nicht nachgewiesen werden.
Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung:
M. paratuberculosis spezifische DNA wurde regelmäßig in der Milch sowie im Kolostrum (31.10.99) mittels PCR nachgewiesen. Die milch- und blutserologische Untersuchung war positiv. M. paratuber-culosis konnte kulturell im Kot nicht nachgewiesen werden. Der kulturelle Nachweis des Erregers im Ileocaecallymphknoten war positiv.
Entnahme-datum 10.7.99 27.7.99 31.10.99 5.11.99 1) 11.11.991)
Milch-ELISA
Abbildung 11: Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung in Einzelgemelkproben (Milch-PCR, ELISA), im Blutse-rum, Kot und Lymphknoten der Kuh Nr. 209
M: DNA-Marker (100 base pair ladder) Spur 1: Negativkontrolle ohne Template
Spur 2,4,6,8,10: Einzelgemelkproben der Kuh Nr. 209 Spur 3,5,7,9,11: interne Funktionskontrolle
Milch-ELISA/ Blut-ELISA: negativ EU ≤ 21 / EU ≤ 20 zweifelhaft EU 22-45 / EU 21-40 positiv EU ≥ 46 / EU ≥ 41
1) Diese Proben wurden wegen negativer interner Funktionskontrolle nachuntersucht.
Kuh Nr. 235
Geburtsdatum: 19.09.1999 Abkalbetermin: 23.12.1998 Schlachttermin: 17.11.1999 Ergebnisse der Eingangsuntersuchung:
Die blutserologische Untersuchung war positiv.
M. paratuberculosis konnte kulturell im Kot nachgewiesen werden.
Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung:
In der zweiten Hälfte des Untersuchungszeitraumes (ab 04.09.99) war es mittels Milch-PCR möglich M.
paratuberculosis spezifische DNA nachzuweisen. Zu diesem Zeitpunkt stieg der Antikörperspiegel in der Milch in den fraglichen (04.09.99/23.09.99) bzw. positiven (11.09.99) Bereich. Die blutserologische Untersuchung war positiv. M. paratuberculosis konnte kulturell im Kot nachgewiesen werden. Der kulturelle Nachweis des Erregers im Ileocaecallymphknoten war negativ.
Entnahme-datum 10.7.99 02.8.99 04.9.99 11.9.991) 23.9.99
Milch-ELISA
[[[[EU]]]] 13 15 42 51 48
Blut-ELISA
[[[[EU]]]] 61 75 68 70 69
Kotkultur - + + + +
Kulturbefund Ileocaecallymphknoten: negativ
Abbildung 12: Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung in Einzelgemelkproben (Milch-PCR, ELISA), im Blutse-rum, Kot und Lymphknoten der Kuh Nr. 235
M: DNA-Marker (100 base pair ladder) Spur 1: Negativkontrolle ohne Template
Spur 2,4,6,8,10: Einzelgemelkproben der Kuh Nr. 235 Spur 3,5,7,9,11: interne Funktionskontrolle
Milch-ELISA/ Blut-ELISA: negativ EU ≤ 21 / EU ≤ 20 zweifelhaft EU 22-45 / EU 21-40 positiv EU ≥ 46 / EU ≥ 41
1) Diese Proben wurden wegen negativer interner Funktionskontrolle nachuntersucht.
In den Einzelgemelkproben war ebenfalls ein Nachweis M. paratuberculosis spezifischer DNA erst am 04.09.99 möglich (Abbildung 13). Die Ausscheidungsrate zwischen den Vier-teln war unterschiedlich (04.09.99/11.09.99).
M1 10.07.99 02.08.99 04.09.99 11.09.99 23.09. 99 M
Abbildung 13: PCR-Analyse von Viertelgemelkproben der Kuh 235
M: DNA-Marker (100 base pair ladder); 1: Negativkontrolle ohne Template;
In den begrenzten Gelabschnitten sind die PCR-Ergebnisse der Viertelge-melkproben des darüber angegebenen Datums dargestellt. Pro Euterviertel sind zwei Spuren dargestellt, wobei zunächst die Probe dann die interne Funktions-kontrolle aufgetragen wurde.
Kuh Nr. 238
Geburtsdatum: 05.04.1994 Abkalbetermin: 21.05.1998 (Abort: 12.08.1999) Schlachttermin: 18.11.1999 Ergebnisse der Eingangsuntersuchung:
Die blutserologische Untersuchung war zweifelhaft.
M. paratuberculosis konnte kulturell im Kot nachgewiesen werden.
Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung:
M. paratuberculosis spezifische DNA konnte mittels Milch-PCR nicht nachgewiesen werden. Die milchserologische Untersuchung war negativ, die Blutserologie zweifelhaft. Der kulturelle Nachweis des Erregers im Kot und Ileocaecallymphknoten war negativ
Entnahme-datum 03.9.991) 11.9.991) 17.9.99 23.9.99 20.11.99
Milch-ELISA
[[[[EU]]]] 36 44 39 37 28
Blut-ELISA
[[[[EU]]]] 56 68 75 85 57
Kotkultur - - - -
-Kulturbefund Ileocaecallymphknoten: positiv
Abbildung 14: Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung in Einzelgemelkproben (Milch-PCR, ELISA), im Blutse-rum, Kot und Lymphknoten der Kuh Nr. 238
M: DNA-Marker (100 base pair ladder) Spur 1: Negativkontrolle ohne Template
Spur 2,4,6,8,10: Einzelgemelkproben der Kuh Nr. 238 Spur 3,5,7,9,11: interne Funktionskontrolle
Milch-ELISA/ Blut-ELISA: negativ EU ≤ 21 / EU ≤ 20 zweifelhaft EU 22-45 / EU 21-40 positiv EU ≥ 46 / EU ≥ 41
1) Diese Proben wurden wegen negativer interner Funktionskontrolle nachuntersucht.
Mittels Milch-PCR konnte M. paratuberculosis spezifische DNA in den Viertelgemelkproben nicht nachgewiesen werden (Abbildung 15).
M1 03.9.99 11.9.99 17.9.99 23.9.99 20.11. 99 M
Abbildung 15: PCR-Analyse von Einzelgemelkproben der Kuh 238
M: DNA-Marker (100 base pair ladder); 1: Negativkontrolle ohne Template;
In den begrenzten Gelabschnitten sind die PCR-Ergebnisse der Viertelge-melkproben des darüber angegebenen Datums dargestellt. Pro Euterviertel sind zwei Spuren dargestellt, wobei zunächst die Probe dann die interne Funktions-kontrolle aufgetragen wurde.
Kuh Nr. 239
Geburtsdatum: 30.10.1999 Abkalbetermin: 21.04.1999 Schlachttermin: 11.08.1999 aufgrund klinischer Paratuberkulose Ergebnisse der Eingangsuntersuchung:
Die blutserologische Untersuchung war positiv.
M. paratuberculosis konnte kulturell im Kot nachgewiesen werden.
Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung:
M. paratuberculosis spezifische DNA konnte mittels Milch-PCR regelmäßig nachgewiesen werden. Die milch- und blutserologische Untersuchung war positiv. Der kulturelle Nachweis des Erregers im Kot und Ileocaecallymphknoten war positiv.
Entnahme-datum 10.7.99 27.7.99 07.8.99 09.8.99 11.8.99
Milch-ELISA
[[[[EU]]]] 51 62 62 68 72
Blut-ELISA
[[[[EU]]]] 48 50 51 46 55
Kotkultur + + + + +
Kulturbefund Ileocaecallymphknoten: positiv
Abbildung 16: Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung in Einzelgemelkproben (Milch-PCR, ELISA), im Blutse-rum, Kot und Lymphknoten der Kuh Nr. 239
M: DNA-Marker (100 base pair ladder) Spur 1: Negativkontrolle ohne Template
Spur 2,4,6,8,10: Einzelgemelkproben der Kuh Nr. 239 Spur 3,5,7,9,11: interne Funktionskontrolle
Milch-ELISA/ Blut-ELISA: negativ EU ≤ 21 / EU ≤ 20 zweifelhaft EU 22-45 / EU 21-40 positiv EU ≥ 46 / EU ≥ 41
Kuh Nr. 282
Geburtsdatum: 08.11.1996 Abkalbetermin: 23.03.1999 Schlachttermin: 16.11.1999 Ergebnisse der Eingangsuntersuchung:
Die blutserologische Untersuchung war negativ.
M. paratuberculosis konnte kulturell im Kot nicht nachgewiesen werden.
Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung:
M. paratuberculosis spezifische DNA konnte mittels Milch-PCR nicht nachgewiesen werden. Die milch- und blutserologische Untersuchung war negativ. Der kulturelle Nachweis des Erregers im Kot und Ileocaecallymphknoten war negativ.
Mittels Milch-PCR war M. paratuberculosis spezifische DNA in den Viertelgemelken nicht nachweis-bar.
Entnahme-datum 10.7.99 27.7.99 05.8.99 12.8.99 23.9.99
Milch-ELISA
[[[[EU]]]] 1 1 1 1 1
Blut-ELISA
[[[[EU]]]] 9 10 7 8 10
Kotkultur - - - -
-Kulturbefund Ileocaecallymphknoten: negativ
Abbildung 17: Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung in Einzelgemelkproben (Milch-PCR, ELISA), im Blutse-rum, Kot und Lymphknoten der Kuh Nr. 282
M: DNA-Marker (100 base pair ladder) Spur 1: Negativkontrolle ohne Template
Spur 2,4,6,8,10: Einzelgemelkproben der Kuh Nr. 282 Spur 3,5,7,9,11: interne Funktionskontrolle
Milch-ELISA/ Blut-ELISA: negativ EU ≤ 21 / EU ≤ 20 zweifelhaft EU 22-45 / EU 21-40 positiv EU ≥ 46 / EU ≥ 41
Kuh Nr. 284
Geburtsdatum: 25.14.1996 Abkalbetermin: 01.05.1999 Schlachttermin: 18.11.1999 Ergebnisse der Eingangsuntersuchung:
Die blutserologische Untersuchung war negativ.
M. paratuberculosis konnte kulturell im Kot nicht nachgewiesen werden.
Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung:
M. paratuberculosis spezifische DNA konnte mittels Milch-PCR nicht nachgewiesen werden. Die milch- und blutserologische Untersuchung war negativ. Der kulturelle Nachweis des Erregers im Kot und Ileocaecallymphknoten war negativ. Mittels Milch-PCR war M. paratuberculosis spezifische DNA in den Viertelgemelken nicht nachweisbar.
Entnahme-datum 10.7.99 17.7.99 27.7.99 07.8.99 11.9.99
Milch-ELISA
[[[[EU]]]] 2 2 2 2 2
Blut-ELISA
[[[[EU]]]] 20 16 15 16 19
Kotkultur - - - -
-Kulturbefund Ileocaecallymphknoten: negativ
Abbildung 18: Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung in Einzelgemelkproben (Milch-PCR, ELISA), im Blutse-rum, Kot und Lymphknoten der Kuh Nr. 284
M: DNA-Marker (100 base pair ladder) Spur 1: Negativkontrolle ohne Template
Spur 2,4,6,8,10: Einzelgemelkproben der Kuh Nr. 284 Spur 3,5,7,9,11: interne Funktionskontrolle
Milch-ELISA/ Blut-ELISA: negativ EU ≤ 21 / EU ≤ 20 zweifelhaft EU 22-45 / EU 21-40 positiv EU ≥ 46 / EU ≥ 41
Kuh Nr. 76
Geburtsdatum: 15.10.1993 Abkalbetermin: 13.09.1998 Schlachttermin: 16.11.1999 Ergebnisse der Eingangsuntersuchung:
Die blutserologische Untersuchung war positiv.
M. paratuberculosis konnte kulturell im Kot nicht nachgewiesen werden.
Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung:
M. paratuberculosis spezifische DNA konnte mittels Milch-PCR regelmäßig nachgewiesen werden. Die milch- und blutserologische Untersuchung war positiv. Der kulturelle Nachweis des Erregers im Kot (27.7.99/07.8.99/12.8.99) und Ileocaecallymphknoten war positiv.
Entnahme-datum 10.7.99 17.7.99 27.7.99 07.8.99 12.8.99
Milch-ELISA
[[[[EU]]]] 52 59 50 67 50
Blut-ELISA
[[[[EU]]]] 77 72 76 78 76
Kotkultur - - + + +
Kulturbefund Ileocaecallymphknoten: positiv
Abbildung 19: Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung in Einzelgemelkproben (Milch-PCR, ELISA), im Blutse-rum, Kot und Lymphknoten der Kuh Nr. 76
M: DNA-Marker (100 base pair ladder) Spur 1: Negativkontrolle ohne Template
Spur 2,4,6,8,10: Einzelgemelkproben der Kuh Nr. 76 Spur 3,5,7,9,11: interne Funktionskontrolle
Milch-ELISA/ Blut-ELISA: negativ EU ≤ 21 / EU ≤ 20 zweifelhaft EU 22-45 / EU 21-40 positiv EU ≥ 46 / EU ≥ 41
Kuh Nr. 37
Geburtsdatum: 30.01.1991 Abkalbetermin: 17.04.1999 Schlachttermin: 16.11.1999 Ergebnisse der Eingangsuntersuchung:
Die blutserologische Untersuchung war negativ.
M. paratuberculosis konnte kulturell im Kot nicht nachgewiesen werden.
Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung:
M. paratuberculosis spezifische DNA konnte mittels Milch-PCR nicht nachgewiesen werden. Die milch- und blutserologische Untersuchung war negativ. Der kulturelle Nachweis des Erregers im Kot und Ileocaecallymphknoten war negativ.
Mittels Milch-PCR war M. paratuberculosis spezifische DNA in den Viertelgemelken nicht nachweis-bar.
Entnahme-datum 10.7.99 17.7.99 27.7.99 07.8.99 11.9.99
Milch-ELISA
[[[[EU]]]] 15 15 17 16 10
Blut-ELISA
[[[[EU]]]] 16 14 19 10 10
Kotkultur - - - -
-Kulturbefund Ileocaecallymphknoten: negativ
Abbildung 20: Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung in Einzelgemelkproben (Milch-PCR, ELISA), im Blutse-rum, Kot und Lymphknoten der Kuh Nr. 37
M: DNA-Marker (100 base pair ladder) Spur 1: Negativkontrolle ohne Template
Spur 2,4,6,8,10: Einzelgemelkproben der Kuh Nr. 37 Spur 3,5,7,9,11: interne Funktionskontrolle
Milch-ELISA/ Blut-ELISA: negativ EU ≤ 21 / EU ≤ 20 zweifelhaft EU 22-45 / EU 21-40 positiv EU ≥ 46 / EU ≥ 41
Kuh Nr. 37 M
Geburtsdatum: 08.01.1992 Abkalbetermin: 09.08.1998 Schlachttermin: 19.11.1999 Ergebnisse der Eingangsuntersuchung:
Die blutserologische Untersuchung war positiv.
M. paratuberculosis konnte kulturell im Kot nicht nachgewiesen werden.
Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung:
M. paratuberculosis spezifische DNA konnte mittels Milch-PCR nicht nachgewiesen werden. Die se-rologische Untersuchung der Milch ergab ein zweifelhaftes, die des Blutserums ein positives Ergebnis.
An zwei Terminen (07.08.99/12.08.99) konnte der Erreger kulturell im Kot nachgewiesen werden. Der kulturelle Nachweis im Lymphknoten war positiv.
Mittels Milch-PCR war M. paratuberculosis spezifische DNA in den Viertelgemelken nicht nachweis-bar.
Entnahme-datum 10.7.99 17.7.99 27.7.99 07.8.991) 12.8.99
Milch-ELISA
Abbildung 21: Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung in Einzelgemelkproben (Milch-PCR, ELISA), im Blutse-rum, Kot und Lymphknoten der Kuh Nr. 37 M
M: DNA-Marker (100 base pair ladder) Spur 1: Negativkontrolle ohne Template
Spur 2,4,6,8,10: Einzelgemelkproben der Kuh Nr. 37 M Spur 3,5,7,9,11: interne Funktionskontrolle
Milch-ELISA/ Blut-ELISA: negativ EU ≤ 21 / EU ≤ 20 zweifelhaft EU 22-45 / EU 21-40 positiv EU ≥ 46 / EU ≥ 41
1) Diese Probe wurde wegen negativer interner Funktionskontrolle nachuntersucht.
Kuh Nr. 80
Geburtsdatum: 20.12.1993 Abkalbetermin: 20.08.1999 Schlachttermin: 16.09.1999 aufgrund klinischer Paratuberkulose Ergebnisse der Eingangsuntersuchung:
Die blutserologische Untersuchung war positiv.
M. paratuberculosis konnte kulturell im Kot nicht nachgewiesen werden.
Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung:
M. paratuberculosis spezifische DNA konnte mittels Milch-PCR regelmäßig nachgewiesen werden. Die milch- und blutserologische Untersuchung war positiv. Der kulturelle Nachweis des Erregers im Kot und Ileocaecallymphknoten war positiv.
Entnahme-datum 20.8.99 25.8.99 01.8.99 11.9.99 16.9.99
Milch-ELISA
[[[[EU]]]] 100 100 79 90 98
Blut-ELISA
[[[[EU]]]] 67 95 100 100 100
Kotkultur + + + + +
Kulturbefund Ileocaecallymphknoten: positiv
Abbildung 22: Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung in Einzelgemelkproben (Milch-PCR, ELISA), im Blutse-rum, Kot und Lymphknoten der Kuh Nr. 80
M: DNA-Marker (100 base pair ladder) Spur 1: Negativkontrolle ohne Template
Spur 2,4,6,8,10: Einzelgemelkproben der Kuh Nr. 80 Spur 3,5,7,9,11: interne Funktionskontrolle
Milch-ELISA/ Blut-ELISA: negativ EU ≤ 21 / EU ≤ 20 zweifelhaft EU 22-45 / EU 21-40 positiv EU ≥ 46 / EU ≥ 41
Tabelle 10: Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung
(+)1: im Untersuchungszeitraum vorwiegend positiv Kultur: ‚+‘ M. paratuberculosis nachweisbar
‚-‘ M. paratuberculosis nicht nachweisbar
ELISA: ‚+‘ Antikörper gegen M. paratuberculosis nachweisbar
‚-‘ Antikörper gegen M. paratuberculosis nicht nachweisbar
‚?‘ als verdächtig geltende Proben
PCR: ‚+‘ M. paratuberculosis spezifische DNA nachweisbar
‚-‘ M. paratuberculosis spezifische DNA nicht nachweisbar
Die Verlaufsuntersuchung an 10 Milchkühen zeigte die gute Korrelation der Milch-PCR mit der Lymphknotenkultur sowie mit dem Blut- und Milch-ELISA; dagegen ist keine Überein-stimmung mit den Ergebnissen der Kotkultur ersichtlich. Weiterhin besteht eine gute Korre-lation zwischen beiden serologischen Untersuchungsmethoden. Bei vier der sechs kulturell im Lymphknoten positiven Tieren (209, 239, 76, 80) wurde M. paratuberculosis spezifische DNA regelmäßig auch in der Milch (Einzelgemelkproben) nachgewiesen. Diese Tiere wiesen
im gesamten Untersuchungszeitraum im Blut- und Milch-ELISA einen als positiv zu bewer-tenden Antikörperspiegel auf. Bei zwei in der Lymphknotenkultur positiven Tieren (238, 37 M) konnte keine M. paratuberculosis spezifische DNA in der Milch nachgewiesen werden;
die blutserologische Untersuchung war positiv, die milchserologische Untersuchung überwie-gend positiv. Bei einem weiteren Tier (235), das serologisch positiv, aber im Ileocaecal-lymphknoten kulturell negativ war, war es in Einzelgemelkproben in der zweiten Hälfte des Untersuchungszeitraumes möglich mittels Milch-PCR M. paratuberculosis spezifische DNA nachzuweisen. Die Nachtestung der Viertelgemelkproben im Fall negativer Einzelgemelkpro-ben zeigte unterschiedliche Erreger-Ausscheidungsraten innerhalb der Euterviertel.
5 Diskussion
In Niedersachsen wird seit 1990 ein durch die Niedersächsische Tierseuchenkasse ge-förderter Versuch zur Bestandssanierung Paratuberkulose-infizierter Milchviehherden durch-geführt. Über einen Zeitraum von 5 Jahren werden in genau definierten Zeitabständen einer-seits die Blutproben aller über zwei Jahre alten Milchkühe serologisch mittels ELISA und andererseits die Kotproben kulturell untersucht. Die Probenentnahme wird von Tierärzten durchgeführt und gestaltet sich besonders in den Sommermonaten schwierig.
In den am Sanierungsprogramm beteiligten Herden hat die Paratuberkuloseinzidenz deutlich abgenommen und wird am Ende des Programms vermutlich zwischen 2 % und 4 % liegen. In diesem Prävalenzbereich treten keine klinisch kranken Tiere mehr auf, und Leistungseinbußen sind für den Landwirt nicht spürbar. Daher stößt in diesen Betrieben eine Fortsetzung der re-lativ zeit- und kostenintensiven Blut- und Kotuntersuchung auf geringe Akzeptanz.
Um langfristig eine flächendeckende Tilgung der Paratuberkulose zu erreichen, ist zusätzlich zur Sanierung besonders stark betroffener Betriebe auch die Ermittlung eines Paratuberkulo-sestatus bisher nicht untersuchter Betriebe erforderlich. Da die Prävalenz in solchen Betrieben zwischen 0 % und 25 % liegt, ist durch stichprobenartige Untersuchungen von Tieren in ei-nem Betrieb keine sichere Aussage über den Herdenstatus zu machen. Andererseits ist die flächendeckende, kombinierte Blut- und Kotuntersuchung aller Tiere nicht finanzierbar. Eine mögliche Lösung – sowohl zur Aufrechterhaltung des Gesundheitsstatus nach 5-jähriger Teil-nahme am Sanierungsprogramm der Niedersächsischen Tierseuchenkasse, wie auch zur Erhe-bung des Paratuberkulosestatus in bisher nicht untersuchten Herden – wäre die Einführung eines ELISA auf der Basis von Milchserum eventuell kombiniert mit einem schnellen Erre-gernachweis aus Milch mittels PCR.
5.1 Adaption des Svanovir®- ELISA für Blutserum an Milchserum
Im Rahmen dieser Arbeit wurde, basierend auf einem Blutserum-ELISA-System (JARK 1996), ein Milch-ELISA entwickelt. Für die Entwicklung war entscheidend, daß eine Korrelation der IgG Konzentration in Milch und Blutserum besteht, da der größte Anteil der
in der Milch enthaltenen Immunglobuline mit dem Blut in die Milchdrüse transportiert wird (CAFFIN et al. 1983; CAFFIN und POUTREL 1987). Diese Korrelation zwischen Blut- und Milch-Antikörperspiegeln konnte auch für M. paratuberculosis spezifische Antikörper auf der Basis eines LAM-ELISA bereits ermittelt werden (SWEENEY et al. 1994). Bei der Validie-rung dieses ELISA wurde der kulturelle Nachweis von M. paratuberculosis in Kot als „Gold-standard“ angesehen.
Um das für die Etablierung des Milch-ELISA am besten geeignete Testsystem zu identifizie-ren wurde zunächst ein Ringversuch, an dem sieben Untersuchungsstellen in Niedersachsen beteiligt waren, durchgeführt und ausgewertet. In diesem Versuch wurden die drei zur Zeit in Deutschland erhältlichen Paratuberkulose-ELISA-Testkits anhand von 60 Seren, die von 10 klinisch verdächtigen Tieren zu verschiedenen Zeitpunkten genommen worden waren, mit-einander verglichen. Mittels Kultur des Ileocaecallymphknotens konnte bei sechs Tieren M.
paratuberculosis nachgewiesen werden. Bei einem weiteren Tier wurde in der Milchuntersu-chung die Ausscheidung des Erregers mit der Milch mittels PCR bewiesen. Bei drei der kli-nisch verdächtigen Tiere war ein kultureller Nachweis des Erregers im Ileocaecallymphkno-ten nicht möglich. Bei der Bewertung dieses Ergebnisses ist zu beachIleocaecallymphkno-ten, daß sogar die kultu-relle Untersuchung des Ileocaecallymphknotens keinen absolut sicheren „Goldstandard“ dar-stellt, sondern nur die sicherste unter Schlachthofbedingungen noch praktikable Möglichkeit.
Als „Goldstandard“ wird dabei das Testverfahren bezeichnet, das die Basis für die Beurtei-lung eines diagnostischen Tests darstellt. Der „Goldstandard“ sollte also eine sichere Aussage darüber erlauben, ob eine Krankheit vorliegt oder ein Tier gesund ist. Es konnte jedoch in anderen Untersuchungen bewiesen werden, daß bei 18 % von an Paratuberkulose erkrankten Tieren kein Nachweis des Erregers im Ileocaecallymphknoten gelang (WHITLOCK und BU-ERGELT 1996). In einer weiteren Untersuchung konnte demonstriert werden, daß nur bei 65
% der Kotkultur positiven Tiere der Erreger kulturell im Ileocaecallymphknoten nachweisbar war (PAVLIK et al. 1999).
In dem genannten Ringversuch zeigte der ELISA zur Serodiagnostik der bovinen Paratuber-kulose (Riemser Arzneimittel GmbH, Insel Riems) insgesamt eine gute Reproduzierbarkeit bei den Ergebnissen der Untersuchungsstellen. Eine Untersuchungsstelle zeigte allerdings stark abweichende Ergebnisse; es ist jedoch nicht auszuschließen, daß es sich bei diesen Er-gebnissen um einen Durchführungs- oder Auswertungsfehler handelt. Der ELISA erkennt nur
vier der sechs Lymphknoten-Kultur positiven Tiere. Die übrigen klinisch verdächtigen Tiere sowie das Milch-PCR positive Tier werden vom ELISA nicht erkannt. Die Abweichung von der angegebenen Sensitivität von 57 % ist dadurch zu erklären, daß es sich bei den unter-suchten Tieren nicht um eine zufällige Stichprobe handelt und daß die Validierung dieses ELISA auf der Basis der Kotkultur als „Goldstandard“ vorgenommen wurde (MILNER et al.
1990). Der kulturelle Nachweis des Erregers im Kot ist jedoch als „Goldstandard“ für die Pa-ratuberkulosediagnostik absolut ungeeignet, da die Tiere im subklinischen Stadium den Erre-ger nicht und später auch nur intermittierend ausscheiden (COLLINS 1996). Die mangelnde Eignung der kulturellen Kotuntersuchung als Referenzgröße wird auch durch andere Arbeiten belegt (MEYER ZU VILSENDORF 1995). Dieser Autor stellt in seinen Untersuchungen fest, daß die Kotkultur gegenüber der kulturellen Untersuchung des Ileocaecallymphknotens nur eine Sensitivität von 33 % besitzt.
Ebenso wurde die Validierung des HerdChek™ M.pt Ab-ELISA (Idexx, Wörrstadt) anhand der Kotkultur vorgenommen (ROSSITER und BURHANS 1996). Auch dieser Test erkennt bei Beginn des Ringversuchs ein „Goldstandard“ (Ileocaecallymphknoten-Kultur) positives Tier nicht. Gegen Ende des Ringversuchs wird noch ein weiteres „Goldstandard“ (Ileocae-callymphknoten-Kultur) positives Tier von dem ELISA nicht als positiv erkannt. Die übrigen klinisch verdächtigen Tiere sowie das Milch-PCR positive Tier werden vom ELISA nicht erkannt. Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse in den sieben Untersuchunsstellen ist unein-geschränkt gut.
Als einziger der eingesetzten ELISA-Tests erkennt der Svanovir®- ELISA (Svanova, Schwe-den) jedes der Lymphknoten-Kultur positiven Tiere sowie das nur in der Milch-PCR positive Tier (235) und dies schon in der ersten Woche der Untersuchung. Von den übrigen klinisch verdächtigen Tieren wird eine Kuh im gesamten Untersuchungszeitraum von allen teilneh-menden Untersuchungsstellen als negativ beurteilt. Zwei weitere klinisch verdächtige Tiere werden überwiegend von allen Untersuchungsstellen als zweifelhaft ermittelt.
Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse der Untersuchungsstellen ist beim Svanovir®- ELISA uneingeschränkt gut. Die positive Beurteilung aller „Goldstandard“ (Ileocaecallymphknoten-Kultur) positiven Tiere und eine frühe Erkennung auch schon subklinisch erkrankter Tiere stimmt mit den früheren Ergebnissen zur Validierung des ELISA mittels Ileocaecal-lymphknoten-Kultur überein (JARK 1996; REHM 1999). Auch konnten beide Autoren de-monstrieren, daß der Svanovir®- ELISA insbesondere Tiere im relativ frühen Stadium der
Infektion, bevor die Tiere den Erreger kontinuierlich im Kot ausscheiden, erkennt. In einer Dissertation wurde an Proben von Kühen in Nordrhein-Westfalen der HerdChek™ M.pt Ab-ELISA mit dem Svanovir®- ELISA verglichen (VOM SCHLOß 2000); dabei wurde ermittelt, daß der Svanovir®- ELISA infizierte Kühe signifikant eher erkennt als der HerdChek™ M.pt Ab-ELISA.
Für die Sicherung eines Sanierungserfolges ist gerade die frühe Erkennung subklinisch infi-zierter Tiere von großer Bedeutung. Ebenso ist es für die Qualitätssicherung des Lebensmit-tels Milch wichtig, die Kühe vor der Ausscheidung des Erregers zu erkennen. Diese Kriterien waren nur mit dem Svanovir®- ELISA zu erfüllen. Zusätzlich zu den fachlichen Kriterien hat der Svanovir®- ELISA einen Vorteil im „handling“ (keine Vorinkubation) und er stellt das kostengünstigste Produkt auf dem Markt dar. Aus diesen Gründen wurde der Svanovir® -ELISA als Basis zur Entwicklung eines Milch--ELISA ausgewählt.
Im ELISA-Kit des Svanovir®- ELISA ist ein konjugierter, monoklonaler anti-Rind-IgG-Antikörper enthalten, dessen Spezifität für IgG Subtypen und deren Bindungsdomäne nicht bekannt sind. Da Kuhmilch, anders als die Milch anderer Tierarten, überwiegend Immunglo-bulin IgG1 enthält, erschien es wahrscheinlich, daß der monoklonale Antikörper auch für den Milch-ELISA einsetzbar war. Allerdings mußte dazu sicher gestellt werden, daß der mono-klonale Antikörper unabhängig von den IgG-Subklassen am Fc-Fragmente bindet. Darum wurde nach enzymatischen Verdau mit Papain des IgG, welches aus dem positiven Kon-trollserum des Svanovir®- ELISA-Testkits aufgereinigt wurde, gezeigt, daß der monoklonale Antikörper an das Fc-Fragment bindet und somit ohne Einschränkung für den Milch-ELISA verwendet werden kann.
Weiterhin war es für die Etablierung eines Milch-ELISA erforderlich, eine schnelle und re-produzierbare Methode zur Milchaufreinigung zu etablieren. Die beste Trennung des Milchse-rums wurde durch die Behandlung der Milch mit dem Labferment Rennin erreicht (MANZ et al. 1986). Diese extrem zeitintensive und aufwendige Methode wurde mit der in anderen Milch-ELISA - z.B. zur Brucellen Diagnostik - angewandten Methode (MACMILLAN et al.
1990) verglichen. Die untersuchten Milchproben wiesen keine Unterschiede in den Extinktio-nen im Svanovir®- ELISA auf, so daß mit der Zentrifugationsmethode eine einfache und schnelle Milchaufreinigung für den Milch-ELISA etabliert werden konnte.
Bei der Etablierung eines serologischen Testverfahrens ist die Zuverlässigkeit, gemessen an-hand der Reproduzierbarkeit, ein entscheidendes Kriterium. Die Reproduzierbarkeit von Tag zu Tag wurde an 20 Milchproben an 8 verschiedenen Tagen überprüft. Es ergab sich ein durchschnittlicher Variationskoeffizient von 17,13 %. Damit entspricht der Test den Forde-rungen der OIE (Office International des Epizooties) (OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES 1996).
Wenn die Reproduzierbarkeit eines serologischen Testverfahrens sichergestellt ist, muß als nächster Schritt bei der Etablierung eine Validierung mithilfe eines anerkannten Referenzver-fahrens erfolgen. Für den Milch-ELISA wurde dies anhand der blutserologischen Untersu-chung von 601 Tieren mittels Svanovir®- ELISA durchgeführt, da dieser ELISA vom BgVV zugelassen und auf der Basis der Lymphknotenkultur validiert worden war. Die kulturelle Untersuchung von Kotproben, die zur Beurteilung anderer ELISA-Systeme diente, wurde aus den schon genannten Gründen, wie die fehlende Ausscheidung bei subklinisch infizierten Tieren und die nur intermittierende Ausscheidung bei erkrankten Tieren, nicht in die Validie-rung des Milch-ELISA einbezogen.
Die Bestimmung des optimalen „Cut off“ wurde mit Hilfe einer ROC-Analyse durchgeführt (JENSEN und POULSEN 1992). Hierbei werden Sensitivität und Spezifität bei verschiedenen Schwellenwerten in einer Kurve dargestellt. Die Schwellenwerte mit der höchsten Sensitivität
Die Bestimmung des optimalen „Cut off“ wurde mit Hilfe einer ROC-Analyse durchgeführt (JENSEN und POULSEN 1992). Hierbei werden Sensitivität und Spezifität bei verschiedenen Schwellenwerten in einer Kurve dargestellt. Die Schwellenwerte mit der höchsten Sensitivität