Serologische Verfahren

2.5.2.1 Komplementbindungsreaktion (KBR)

Die KBR ist der erste serologische Test, der zur Diagnostik der Paratuberkulose be-schrieben wurde (BANG und ANDERSEN 1913; TWORT und INGRAM 1912). Bei der KBR handelt es sich um eine der ältesten serologischen Diagnostikmethoden, und entspre-chend zahlreich und unterschiedlich sind die Angaben über Spezifität und Sensitivität. Wäh-rend in einer Studie von einer niedrigen Spezifität und Sensitivität ausgegangen wird (COCITO et al. 1994), halten andere Autoren die KBR für durchaus vergleichbar mit den anderen serologischen Verfahren (COLLINS 1996). Die mangelnde Sensitivität ist der Schwachpunkt der KBR, so daß dieses Verfahren nur als Screening-Test angewendet werden sollte (BELLETTI et al. 1992). In Vergleichsuntersuchungen konnte die KBR die Sensitivität von neueren ELISA-Systemen nicht erreichen (MCNAB et al. 1991a).

Die KBR ist international anerkannt, und ein negatives Testergebnis ist in vielen Ländern Voraussetzung für den Import von Rindern (COCITO et al. 1994; COLLINS und SOCKETT

1 BACTEC 460 TB Becton Dickinson Laboratories, Inc., Sparks, MD

2 BACTEC MGIT 960 Becton Dickinson Laboratories, Inc., Sparks, MD

1993). Der Test ist nicht tierartspezifisch und durch seinen komplexen Aufbau nicht interna-tional standardisiert.

2.5.2.2 Agargelimmunodiffusionstest (AGIDT)

Mit diesem einfachen und kostengünstigen Verfahren kann mit geringem Aufwand in-nerhalb von 24 bis 48 Stunden eine Diagnose gestellt werden. Aber bei dem Vergleich von vier serologischen Testverfahren konnte bei einer Spezifität des Tests von 100 % nur eine Sensitivität von 26 % - die niedrigste Sensitivität aller untersuchten Verfahren – erreicht wer-den (SOCKETT et al. 1992b). Bei einem weiteren Vergleich des AGIDT mit einem ELISA-Verfahren wurde ebenfalls eine niedrigere Sensitivität des AGIDT ermittelt (CLARKE et al.

1996).

2.5.2.3 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

2.5.2.3.1 Nachweis von Antikörpern gegen M. paratuberculosis in Blut

Der diagnostische Wert des ELISA bei der Paratuberkulose ist hoch, da die Tiere lan-ge vor dem Auftreten klinischer Symptome erkannt werden. Der Antikörperspielan-gel steigt dann bis zum Auftreten klinischer Anzeichen an (COLLINS 1996).

Diese ELISA-Technik wurde erstmals im Jahr 1971 beschrieben (ENGWALL und PERL-MANN 1971). Zur serologischen Diagnostik der Paratuberkulose wurde das Verfahren sieben Jahre später eingeführt (JØRGENSEN und JENSEN 1978).

In den darauffolgenden Jahren wurden einige unterschiedliche ELISA-Verfahren entwickelt.

Bei der Erkennung subklinisch erkrankter Tiere weisen viele der Tests eine nur geringe Sen-sitivität und Spezifität auf (BECH-NIELSEN et al. 1992; COLLINS et al. 1991). Die Spezi-fität konnte durch Präabsorption der diagnostischen Seren mit einer Suspension von M. phlei gesteigert werden. (YOKOMIZO et al. 1985). Andere Autoren demonstrierten, daß die Präab-sorption mit M. phlei keine wesentlichen Vorteile erbringt (HILBINK et al. 1994).

Die beschriebenen ELISA-Methoden unterscheiden sich hinsichtlich der Präparation und der Qualität des Antigens, welches zum Beschichten der Mikrotiterplatten benutzt wird. Antige-ne, die einige Autoren (COLLINS und SOCKETT 1993; YOKOMIZO et al. 1988) in ihren

Arbeiten einsetzten, wurden aus einem M. paratuberculosis Stamm 18 isoliert, der sich später aufgrund molekularbiologischer Differenzierung als M. avium Stamm 18 herausstellte (CHIODINI 1993). Ein rekombinantes Polypeptid wurde als Antigen in einem anderen ELI-SA-System eingesetzt (VANNUFFEL et al. 1994). Es handelt sich hierbei um ein immunoge-nes 34-kDA-Protein. Die Kreuzreaktionen mit M. bovis und dem nahverwandten M. avium gingen deutlich zurück (DE KESEL et al. 1993).

Auch ein Zellwandbestandteil, das Lipoarabinomannan (LAM), wird als Antigen bei einigen ELISA-Systemen eingesetzt (JARK 1996; SUGDEN et al. 1986; SUGDEN et al. 1989;

SWEENEY et al. 1994).

Eine vergleichende Studie zeigte für den LAM-ELISA eine signifikant höhere Sensitivität als für einen ELISA mit einem aus dem M. avium Stamm 18 isolierten Antigen (REICHEL et al.

1999).

Die drei zur Zeit in Deutschland kommerziell erhältlichen ELISA-Systeme sind die von Bun-desinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin (BgVV) zugelasse-ne Testkits der Firmen Idexx, Wörrstadt (HerdChek™ Mycobacterium paratuberculosis), Riemser Arzneimittel GmbH, Insel Riems (ELISA zur Serodiagnostik der bovinen Paratuber-kulose) und Svanova, Schweden (Svanovir^® Paratuberkulose ELISA).

Der „HerdChek™ Mycobacterium paratuberculosis“- ELISA hat, mit Bezug auf die kultu-relle Kotuntersuchung, eine Sensitivität von 57 % und eine Spezifität von 99,7 % (ROSSITER und BURHANS 1996). In diesem ELISA-System werden die Seren mit M.

phlei-Extrakt vorabsorbiert. Er gilt in den USA als das zur Zeit sensitivste serologische Test-system (COLLINS 1996). Das im Test verwendete Festphasenantigen stammt aus dem M.

avium Stamm 18.

Der „ELISA zur Serodiagnostik der bovinen Paratuberkulose“ (Riemser Arzneimittel GmbH, Insel Riems) beruht auf einem ELISA-System, das in einem Feldversuch mit 327 Kühen eine Sensitivität von 57 % und eine Spezifität von 98 % aufwies (MILNER et al. 1990). Auch in diesem ELISA-System werden die Seren mit M. phlei-Extrakt vorabsorbiert.

Der „Svanovir^® Paratuberkulose ELISA“, ein auf LAM basierender ELISA, wurde als einzi-ger der drei ELISA-Systeme mit Bezug auf die kulturelle Untersuchung der Ileocaecal-lymphknoten evaluiert. Er hat in ersten Untersuchungen eine scheinbare Spezifität von 99 % und eine scheinbare Sensitivität von 93,75 % (JARK 1996; JARK et al. 1997).

2.5.2.3.2 Nachweis von Antikörpern gegen M. paratuberculosis in Milch

Ein ELISA zur Detektion von Antikörpern gegen M. paratuberculosis in Milchproben stellt aufgrund der leichten Probennahme eine kostengünstige Alternative zum Blut-ELISA dar (RICHARDS 1990).

Auf der Basis eines LAM-ELISA konnte eine gute Korrelation zwischen Blut- und Milch-ELISA ermittelt werden (SWEENEY et al. 1994). Milch- und Blutproben von 764 Kühen aus 13 Betrieben, von denen 2 Betriebe bisher keine Paratuberkulose-Erkrankungen zu verzeich-nen hatten, wurden mittels LAM-ELISA getestet. Ebenso wurden Kotproben dieser Tiere kulturell auf M. paratuberculosis untersucht. Der kulturelle Nachweis von M. paratuberculo-sis wurde als „Goldstandard“ angesehen. Die Inter-Assay-Variation betrug für den Milch-ELISA 0,19 und für den Blut-Milch-ELISA 0,15. Die Validierung des Milch-Milch-ELISA erfolgte anhand der ROC-Kurve. Es ergaben sich bei einer Sensitivität von 50 % bzw. 60 % eine Spezifität von 87 % bzw. 83 %. Der Korrelationskoeffizient betrug r = 0,71. Dies weist auf eine gute Korrelation zwischen Blut- und Milch-ELISA hin.

Ein anderer Milch-ELISA wurde auf der Basis eines Protoplasma-Antigens (PPA-3) entwik-kelt (HARDIN und THORNE 1996). Die Autoren konnten nachweisen, daß eine Vorabsorp-tion der Milch mit M. phlei-Extrakt keine signifikanten Unterschiede der ELISA-Ergebnisse ergab. Die Korrelation der Ergebnisse des Milch- und Blut-ELISA war sehr gering (r = 0,08).

Anhand von Untersuchungen an Tankmilchproben mittels eines kommerziell erhältlichen ELISA-Systems wurde die Prävalenz in dänischen Milchviehherden bestimmt (NIELSEN et al. 2000). Als Antigen wurden Bestandteile des M. avium Stammes 18 eingesetzt. Die Auto-ren ermittelten eine Sensitivität von 97 % und eine Spezifität von 86 %. Der ELISA war nur wenig zuverlässig, da geringe Schwankungen des „Cut off“ Wertes die Prävalenz extrem ver-änderten.