Polymerase Kettenreaktion (PCR)

Die PCR ist eine schnelle Methode zur „In-Vitro-Amplifikation“ von Nukleinsäuren.

Diese ermöglicht es, einen bestimmten Zielabschnitt (Target) einer vorliegenden Nukleinsäu-re (Template-DNA), z. B. eines KrankheitserNukleinsäu-regers, selektiv zu vermehNukleinsäu-ren. Das Orginalproto-koll für die PCR wurde erstmals 1985 veröffentlicht (SAIKI et al. 1985).

2.5.3.1 Lysis und DNA-Präparation von Mykobakterien für die PCR

Die mechanische Lysis von Mykobakterien mit Glas- oder Zirkoniumbeads in einem

„Bead beater“ wird von mehreren Autoren beschrieben (BLEUMINK-PLUYM et al. 1994;

CHALLANS et al. 1994; COLLINS et al. 1993). Die Bakteriensuspension wird mit den Beads gemischt und in dem „Bead beater“ für einige Minuten bei einer Frequenz von 100 Hz kräftig geschüttelt. Die Zellwände werden so zerstört und die DNA freigesetzt.

Auch alleiniges Kochen der Suspension für 15 Minuten (MOSS et al. 1991) bzw. 20 Minuten (HURLEY et al. 1993) setzte geeignete DNA zur Verwendung in der PCR frei.

Andere Autoren präparierten die DNA von Mykobakterien enzymatisch und setzten dazu Subtilisin, Lysozym sowie SDS und Pronase ein (VISUVANATHAN et al. 1989). Ebenfalls eine enzymatische Methode mit Lysozym und Proteinase K, bei der nach Cäsiumchloridbe-handlung 30 Volumina destilliertes Wasser hinzugegeben wurde, um durch osmotischen Schock die Zellwände zu sprengen, ergab eine Ausbeute von 1,2-2 mg DNA/g Zellfeuchtge-wicht (BOSE et al. 1993).

2.5.3.2 DNA-Extraktion

Meist wird das Untersuchungsmaterial nach dem Zellaufschluß einer weiteren Be-handlung zur Reinigung und gleichzeitigen Konzentrierung der Nukleinsäuren unterzogen.

Eine Chloroform-Phenolextraktion ist die klassische Methode (SAMBROOK et al. 1989). Die hydrophilen DNA-Moleküle reichern sich in der wäßrigen Phase an und können aus dieser zurückgewonnen werden. Die Präzipitation der gelösten DNA erfolgt mit Hilfe von Ethanol.

Zum Nachweis von M. tuberculosis in Gewebeproben wurde nach enzymatischen Aufschluß der Proben die DNA durch Chloroform-Phenolextraktion mit anschließender Ethanolfällung gewonnen (TAN et al. 1997).

Die Grundlage für die Aufreinigung von Nukleinsäuren über eine Silikamatrix ist die Beob-achtung, daß DNA in Gegenwart chaotroper Agentien wie Natriumjodid und Natriumperchlo-rat oder Guanidin-Thiocyanat bzw. –hydrochlorid an Silika (Siliziumdioxid)- bzw. Glasparti-kel bindet (BOOM et al. 1990). Liegen hohe Konzentrationen chaotroper Stoffe vor, werden Nukleinsäuren an die Silika-Partikel gebunden und lösen sich von diesen bei niedrigen Kon-zentrationen der chaotropen Substanzen wieder ab. Durch diese selektive Bindung kann DNA von Störstoffen befreit und danach durch Schwächung der Bindung wieder von der Matrix

gelöst werden. Trotz dieser DNA-Aufreinigungsmethode wurde in einer weiteren Untersu-chung zum Nachweis von M. tuberculosis demonstriert, daß einige Proben noch PCR-Inhibitoren enthielten (NOORDHOEK et al. 1995).

Zunehmend werden auch DNA-Extraktionskits auf der Basis von Chloroform-Extraktion oder DNA-bindenden Matrices angeboten und eingesetzt. Die DNA-Extraktionskits sind oft zeit-sparend und bieten aufgrund des standardisierten Verfahrens eine gute Reproduzierbarkeit.

DNA-bindende Matrices sind darüber hinaus mit einer geringeren anfallenden Menge an toxi-schem Sondermüll verbunden. Es werden DNA-Extraktionskits für nahezu alle DNA-haltigen Medien angeboten.

2.5.3.3 Aufreinigung von Milchproben für die PCR

Um aus dem komplexen, die PCR vollständig hemmenden Medium Milch (POWELL et al. 1994) Erreger-DNA zu isolieren, werden mehrere Möglichkeiten genutzt.

Zum Nachweis von Coxiella burnettii aus Milch wurde nach Proteinase K-Abbau der Protein-strukturen die DNA mittels Chloroform-Phenolextraktion gewonnen (WILLEMS et al. 1994).

Die Autoren erreichen mit dieser Methode eine Nachweisgrenze von einem Erreger pro ml Milch. Ebenfalls zum Nachweis von Coxiella burnettii aus Milch wurde von einem anderen Autor nach Beschallung, Entrahmung, Auslabung und Ultrazentrifugation der Molke zur DNA-Extraktion ein kommerziell erhältliches DNA-Extraktionskit (Qiamp^® Tissue Kit, Qia-gen, Hamburg) eingesetzt (EDINGLOH et al. 1999; EDINGLOH 1999). Die Nachweisgrenze lag bei 4 Erregern pro ml Milch.

Dasselbe DNA-Extraktionskit wurde in einer Arbeit zum Nachweis von Mycobacterium tu-berculosis in Milch, Lymphknoten und Nasenabstrichen eingesetzt (VITALE et al. 1998). Die Milchproben wurden enzymatisch vorverdaut und die DNA laut Anleitung extrahiert.

Erstmals im Jahr 1996 wurde der Nachweis von M. paratuberculosis in Milchproben be-schrieben (MILLAR et al. 1996). In dieser Untersuchung wurden die Milchproben durch Zentrifugation in Pellet, Fett und Milchserum fraktioniert. Die Mykobakterien wurden durch 20 minütiges Kochen der unterschiedlichen Milchfraktionen aufgeschlossen und der Über-stand nach Zentrifugation direkt in der PCR eingesetzt. Andere Autoren beschrieben den Nachweis von M. paratuberculosis in Milchproben, die enzymatisch vorbehandelt wurden (HERMAN et al. 1999).

2.5.3.4 Ausschluß falscher Ergebnisse in der PCR

Häufig auftretende Probleme beim Einsatz der PCR sind falsch negative Ergebnisse infolge einer Hemmung der Polymerase und falsch positive Ergebnisse durch Kontamination der PCR-Ansätze mit der gesuchten DNA.

Eine zentrale Rolle bei der Hemmung der Polymerase spielt dabei die Verfügbarkeit des Co-faktors Magnesium (ROLFS et al. 1992). Hemmstoffe binden häufig freies Magnesium. Zu den Hemmstoffen, die aus der Probe bei der Aufbereitung nicht ausreichend eliminiert wur-den, gehören EDTA, Proteine, Heparin u.v.a.. Auch können Reste der Lösungen, die zur DNA-Isolierung eingesetzt wurden, wie SDS und Proteinase K, die PCR empfindlich stören.

Zwar kann die Konzentration der Hemmstoffe durch Verdünnung der DNA-Lösung gesenkt werden, aber somit sinkt auch die Sensitivität der PCR. Empfehlenswert ist die erneute Auf-reinigung der Probe. Als Maßnahmen zur Kontrolle der PCR-Ansätze sollte zu jedem Ansatz ein Vergleichsansatz mit einem Gemisch aus Proben-DNA und zugesetzter amplifizierbarer DNA erstellt werden.

Durch Kontaminationen sowie durch unspezifische Reaktionen kann es zu falsch positiven Ergebnissen kommen. Die Kontaminationsgefahr ist besonders hoch in der Diagnostik, da es zu einer Anreicherung von DNA im Labor kommt. Die Kontrolle der PCR-Ansätze kann durch einen Ansatz, dem statt DNA Wasser zugesetzt wurde, gewährleistet werden.

Daraus ergibt sich, daß vor allem für den Erregernachweis aus klinischem Probenmaterial eine genaue Kenntnis über Hemmstoffe und Kontaminationsquellen erforderlich ist (IEVEN und GOOSSENS 1997). Es kommt bei einer möglichst einfach gestalteten Prozedur der DNA-Extraktion auf die sichere Reproduzierbarkeit der Ergebnisse an.

2.5.3.5 PCR zum Nachweis des Erregers aus klinischem Untersuchungsmaterial

Ein spezifischer Nachweis von M. paratuberculosis in Kot mittels PCR stellt zwar ei-ne schei-nelle Alternative für den Nachweis von mittel- bis hochgradig ausscheidenden Kühen dar; er ist jedoch als Nachweis von nur mit wenigen Mykobakterien belastetem Kot ungeeig-net, da mindestens 10⁴ KBE/g Kot zum Nachweis benötigt werden (VARY et al. 1990;

WHIPPLE et al. 1992).

Ein kommerziell erhältliches Kit (DNA-Probe^®-Test, Idexx, Wörrstadt) mit dem ein IS900 Fragment einer Länge von 229 bp aus aufbereiteten Kotproben vervielfältigt und dann mit

einer Gensonde nachgewiesen wird, wurde in einer vergleichenden Untersuchung als der kulturellen Untersuchung unterlegen gewertet, da eine Sensitivität von 55 % gegenüber 89 % und 74 % in zwei verschiedenen kulturellen Verfahren zu verzeichnen war (SOCKETT et al.

1992a). Andere Autoren konnten in Untersuchungen demonstrieren, daß mittels DNA-Probe^®-Test lediglich ein Drittel der kulturell positiven Kotproben identifiziert werden konn-ten (WHIPPLE et al. 1992). Neuere Untersuchungen unterstützen diese Ergebnisse (ZIMMER et al. 1999). In einer anderen Untersuchung konnte in der PCR bei allen Proben mit einem Gehalt von > 1600 KBE/g Kot M. paratuberculosis-spezifische DNA nachgewiesen werden.

Bereits ab einem Gehalt von 480 KBE/g Kot sank die Sensitivität allerdings auf 60 % (COLLINS et al. 1993).

Für einen weiteren PCR-gestützten Nachweis von M. paratuberculosis aus dem Kot ermittel-ten die Autoren eine Sensitivität von 34 % und eine Spezifität von 100 % (SOCKETT et al.

1992a).

Der Nachweis des IS900 von M. paratuberculosis aus Milch wurde erstmals 1996 beschrie-ben (MILLAR et al. 1996). Die Autoren untersuchten 312 pasteurisierte Milchprobeschrie-ben in der Zeit von September 1991 bis März 1993 und darüber hinaus noch Milchproben von sicher nicht infizierten und infizierten Kühen. Die Nachweisgrenze lag bei 200 bis 300 Keimen pro ml Milch. Bei den künstlich mit lebenden Erregern kontaminierten Milchproben konnte nach Zentrifugation der Erreger mittels PCR im Pellet oder im Rahm nachgewiesen werden. Den Autoren war es möglich in 7 % der pasteurisierten Milchproben M. paratuberculosis nachzu-weisen.

Bei Einsatz einer nested-PCR kann die Nachweisgrenze auf 30 KBE/ml Milch gesenkt den (HERMAN et al. 1999). Auch hier konnte der Erreger im Milchfett nachgewiesen wer-den.

Für einen PCR-gestützten Nachweis des IS900 von M. paratuberculosis aus Lymphknoten wurde eine Methode zur Zelllyse auf der Basis der Zerstörung des Erregers mit Zirkonium-beads in einem „Bead beater“ beschrieben (CHALLANS et al. 1994). Es folgt eine Chloro-form-Phenolextraktion. Die Nachweisgrenze lag bei 35-45 Keimen/g Gewebe.

3 Material und Methoden

Rezepte für Lösungen, Puffer und Medien sind jeweils im Anhang aufgeführt.