Diagnostika für die Paratuberkulose –

Die Suche nach alternativen

Diagnostika für die Paratuberkulose – Analyse flüchtiger organischer

Substanzen (VOC)

Heike Köhler, Anne Küntzel, Michael Weber, Sina Fischer,

Elisa Kasbohm, Peter Gierschner, Andreas Bergmann,

Phillip Trefz, Andreas Fröhlich, Volkmar Liebscher,

Wolfram Miekisch, Jochen Schubert, Petra Reinhold

Paratuberkulose – diagnostisches Dilemma

Im Labor

Aufwand vs. Sensitivität Direkt-PCR

Kulturelle

Anzüchtung

Suche nach alternativen diagnostischen Konzepten Beim Tier

„Diagnostische Lücken“

Exposition

Duft = flüchtige organische Substanzen/

V

O

C

( VOC )

Krankheiten mit charakteristischen „Düften“

- Diabetes

- Nierenerkrankungen - Lebererkrankungen - Tuberkulose

Nutzung von „Duft“ als Biomarker

Hippokrates

500 AC analysierte den Duft von Atem, Schweiß oder Urin von kranken Personen

Vorteile

- Nichtinvasiv

- Echtzeitmessung möglich

gezieltes Targeting positiver Proben - Hohe analytische Sensitivität

Nachweis im ppbV – pptV-Bereich

Aktuelle Entwicklungen

- Atemtests für die Krebsdiagnostik

- Tests für menschliche TB und pulmonale Aspergillose - Analyse des headspace über bakteriellen Kulturen

– Beschleunigung der Diagnostik (Sepsis, MRSA)

Nutzung von „Duft“ als Biomarker

Lassen sich in der Atemluft und im headspace über Kotproben von Im Tiermodell MAP-infizierten Ziegen spezifische VOC-Profile detektieren?

Welche Faktoren beeinflussen diese VOC-Profile?

Gibt es ein Paratuberkulose-spezifisches Volatom?

Generieren MAP in vitro ein spezifisches VOC-Profil?

An Kulturen Welche Faktoren beeinflussen das VOC-Profil von MAP-Kulturen?

Welche Substanzen bilden das MAP Core-Volatom?

Flüchtige organische Substanzen von Erreger und Wirt

als Biomarker bakterieller Infektionen (Paratuberkulose)

Workflow der VOC-Analyse

Sampling/

Pre-concentration

Sampling/

Pre-concentration

Chemical analysis

& identification

Workflow der VOC-Analyse

Sampling/

Pre-concentration

Workflow der VOC-Analyse

Chemical analysis

& identification

Bioinformatics/

statistical

analysis

d119 ff

Rauhfutter/ Wiederkäuer Tränk-

lamm Futter- Umstellung

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 LW MAP-

Inokulation Atemgas/Kotproben-Sammlung

Versuch I II

Kontrolltiere 10 10

MAP- infizierte

Tiere

14 11

Studiendesign – Tiermodell

Miekisch et al. 2004

A – Atemmaske B – CO₂ -Sensor

C – Needle Trap Device (NTD) D – CO₂-getriggertes Ventil

E – mobiles Probenahmegerät, verbunden mit B und D

Ausatemluft

Needle Trap Microextraction (NTME)

Needle Trap Device (gepackt mit Polymeren) Mobiles Probenahmegerät („gelber Koffer“) Probenahme:

automatisiert, Volumen- und CO₂-kontrolliert Volumen: 60 ml, Flußrate: 20 ml/min,

CO₂-Schwellenwert : 25–30 mmHg

VOC-Probenahme in vivo

Endogene VOCs

physiologische Prozesse, z.B. Metabolismus

Individuelle VOC-Profile

Exogene VOCs - Kontaminationen

Inhalation Ingestion

Absorption

VOC-Profile der Erreger-Wirt-Interaktion

Konstitution,

Alter, Fütterung… Umweltfaktoren,

Medikation,…

MAP infiziert

Gesunde Kontrolltiere

AusatemluftKotproben

Krankheits-assoziierte VOC-Profile (MAP-Infektion)

Hauptkomponentenanalyse basierend auf VOC-Analysen über Fäzes

PC-01 trennt MAP-infizierte ( ) von

a) b)

a) Effektstärke

b) Mittlere ROC-Kurven mit 3σ-Intervallen für Ziegenlämmer (≤ 20 Lebenswoche [wol]), AUC = 0.770;

und für adulte Ziegen (> 20 wol),

Krankheits-assoziierte VOC-Profile (MAP-Infektion)

Endogene VOCs

physiologische Prozesse, z.B. Metabolismus

Pathologische Prozesse

Individuelle VOC-Profile

Exogene VOCs - Kontaminationen

Inhalation Ingestion

Absorption

VOC-Profile der Erreger-Wirt-Interaktion

Konstitution,

Alter, Fütterung… Umweltfaktoren,

Medikation,…

Krankheits-assoziierte VOC-Profile

Study Design – Kulturen

Study 1 Study 2 Study 3

Mycobacteria species 1 (MAP) 1 (MAP) 13

Strains 5 3 17 (2 MAP)

Bacterial counts 4 4 -

Media 1 5 1

Sampling time points 1 3 1

Methodische Faktoren

Medienzusammensetzung Keimzahl im Inokulum Inkubationsdauer

Variabilität des VOC-Profils von MAP

Biologische Faktoren

Stammdiversität Wachstumsrate Metabolismus

Einflussfaktoren – in vitro-Kulturen

28 VOCs - VOC Core-Profil von MAP in vitro

Zusammenfassung

Schlussfolgerungen

Pathogen- und krankheitsspezifische VOC-Profile existieren und können in vitro, ex vivo und in vivo gemessen werden.

Methodische und biologische/physiologische Variabilität muss bei der Etablierung diagnostischer Applikationen bedacht werden.

Ausblick

Verifizierung des Core Volatome von MAP über diagnostischen Kulturen Weiterentwicklung in Richtung diagnostischer Applikation

Identifizierung des „Core Volatome“ der MAP-Infektion

Evaluierung eines On-line VOC-Messsystems (PTR)

Department of Anaesthesia and Intensive Care, University Medicine Rostock

Jochen K. Schubert Wolfram Miekisch Phillip Trefz

Peter Gierschner Andreas Bergmann Klaus Klepik

FLI (IMP)

Petra Reinhold Sina Fischer Anne Küntzel Michael Weber

Mitarbeiter des Tierhauses

Institute of Mathematics and Informatics, Ernst Moritz Arndt University Greifswald Volkmar Liebscher

Elisa Kasbohm

PAS Technology, Magdala Dietmar Hein

Thüringer Tierseuchenkasse

Karsten Donat, Wolfram Siebert, Katja Hruschka und Kollegen,

Thüringer Rinder- und Ziegenhalter

Zusammenarbeit und Förderung

Vielen Dank für Ihre

Aufmerksamkeit!