Untersuchungen zur Kryokonservierung geschlechtssortierter und unsortierter Schafbockspermien

Tierärztliche Hochschule Hannover

Untersuchungen zur Kryokonservierung geschlechtssortierter und unsortierter Schafbockspermien

INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-

(Dr.med.vet.)

Vorgelegt von Franziska Karola Kaiser

Sundern

Hannover 2019

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. habil. Detlef Rath

Friedrich-Loeffler-Institut Mariensee

Institut für Nutztiergenetik (ING) Neustadt am Rübenberge

und

Prof. Dr. med. vet. habil. Martin Ganter Klinik für kleine Klauentiere

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Hannover

1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. habil. Martin Ganter 2. Gutachter: Prof. Dr. Árpád Csaba Bajcsy

Tag der mündlichen Prüfung: 09. Mai 2019

Angefertigt in der: Klinik für Kleine Klauentiere

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Hannover und dem

Friedrich-Loeffler-Institut

Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Institut für Nutztiergenetik (ING)

Neustadt am Rübenberge

Meinen Eltern Patrick und Karola Kaiser

Inhalt

1 Einleitung ... 1

2 Literaturübersicht ... 3

2.1 Instrumentelle Samenübertragung beim Schaf ... 3

2.2 Grundlagen der Kryokonservierung ... 5

2.2.1 Kryobiologie der Abkühlung ... 5

2.2.2 Kryobiologie des Gefriervorganges ... 7

2.2.3 Ausgewählte Kryoprotektiva und Verdünnerbestandteile ... 9

2.2.4 Die besondere Rolle des Glycerins ... 11

2.3 Kryokonservierung von Schafspermien ... 14

2.3.1 Kryokonservierung von Schafbockspermien in Pellets ... 14

2.3.2 Kryokonservierung von Schafbockspermien in PVC-Straws ... 16

2.4 Geschlechtsdifferenzierung ... 18

2.4.1 Prinzip der durchflusszytometrischen Spermiensortierung ... 18

2.4.2 Einsatz geschlechtssortierter Spermien beim Schaf ... 21

3 Material und Methoden ... 24

3.1 Eingesetzte Ejakulate ... 25

3.1.1 Ejakulatgewinnung ... 25

3.1.2 Untersuchung der frisch gewonnenen Ejakulate ... 26

3.2 Analyse der Spermien ... 27

3.2.1 Motilitätsmessung durch Computer-assisted sperm analysis ... 27

3.2.2 Messung der Membranintegrität ... 28

3.2.3 Erfassung morphologischer Veränderungen ... 29

3.3 Untersuchung der aufgetauten Proben mittels Thermoresistenztest ... 31

3.4 Geschlechtsspezifisches Sortieren ... 32

3.4.1 Vorbereitung des Samens ... 32

3.4.2 Durchflusszytometrisches Sortieren ... 32

3.4.3 Nachbereitung des Samens ... 33

3.5 Kryokonservierung... 34

3.5.1 Kryokonservierung in Straws ... 34

3.5.1.1 Beschaffenheit der Straws... 34

3.5.1.2 Einfrierverfahren mit Straws ... 34

3.5.1.3 Auftauverfahren der Straws ... 35

3.5.2 Kryokonservierung in Pelletform ... 36

3.5.2.1 Einfrierverfahren der Pellets ... 36

3.5.2.2 Auftauverfahren der Pellets ... 36

3.6 Versuch 1: Vergleich zweier computergestützter Einfrierkurven zur Kryokonservierung in Straws mit der Pelletmethode ... 37

3.6.1 Gewinnung und Vorbereitung der Proben ... 37

3.6.2 Konfektionierung und Kryokonservierung ... 37

3.6.3 Thermoresistenztest ... 38

3.7 Versuch 2: Vergleich des Einflusses unterschiedlicher Glycerinkon- zentrationen im Sexcess®-Verdünner auf geschlechtssortierte und unsortierte Spermien ... 40

3.7.1 Untersuchungen zur Gewinnung und Vorbereitung der Proben... 40

3.7.2 Einstellen der drei verschiedenen Glycerinkonzentrationen ... 40

3.7.3 Kryokonservierung und Evaluation ... 41

3.8 Statistische Auswertung ... 43

4 Ergebnisse ... 45

4.1 Ergebnisse Versuch 1: Vergleich zweier computergestützter Einfrierkurven zur Kryokonservierung in Straws mit der Pelletmethode ... 45

4.1.1 Motilität ... 45

4.1.2 Membranintegrität ... 46

4.1.3 Morphologie ... 47

4.1.4 Einfluss der Einfrierverfahren ... 49

4.1.5 Einfluss der Böcke ... 49

4.2 Versuch 2: Vergleich des Einflusses unterschiedlicher Glycerin- konzentrationen im Sexcess®-Verdünner auf geschlechtssortierte und unsortierte Spermien ... 52

4.2.1 Motilität ... 52

4.2.2 Membranintegrität ... 54

4.2.3 Morphologie ... 55

4.2.4 Einfluss der Glycerinkonzentration ... 56

4.2.5 Einfluss der Geschlechtssortierung und Glycerinkonzentration ... 57

4.2.6 Ausgangsqualität der Spermienproben vor der Kryokonservierung ... 59

5 Diskussion ... 61

5.1 Diskussion zu Versuch 1 ... 62

5.2 Diskussion zu Versuch 2 ... 65

5.3 Übergreifende Beurteilung ... 69

6 Zusammenfassung ... 72

7 Summary ... 74

8 Literaturverzeichnis ... 76

9 Anhang ... 95

9.1 Eingesetzte Medien ... 95

9.2 Beurteilungen der Spermien ... 96

9.2.1 Definition der Bewegungsparameter ... 96

9.2.2 Beurteilungsschema der morphologischen Veränderungen ... 97

9.3 Einstellungen der Analysegeräte ... 98

9.3.1 Einstellungen der computerassistierte Motilitätsanalyse ... 98

9.3.2 Parameter Einstellungen des Durchflusszytometer ... 100

10 Ergebnistabellen ... 102

10.1 Weitere Ergebnistabellen Versuch 1 ... 102

10.2 Weitere Ergebnistabellen Versuch 2 ... 109

11 Abbildungsverzeichnis ... 117

12 Tabellenverzeichnis ... 118

Abkürzungsverzeichnis

° C Grad Celsius

ALH Amplitude of lateral head displacement

AO Antioxidantien

BCF Beat cross frequency

Ca²⁺ Kalziumionen

CASA Computer-assisted sperm analysis

DMSO Dimethylsulfoxid

Hz Hertz

ICSI Intrazytoplasmatische Spermieninjektion

LDL Low density lipoprotein

LIN Linearity

LN2 Liquid nitrogen

LSM Least squares mean

n Anzahl, Gruppengröße

PI Propidiumiodid

PBS Phosphate buffered saline

PMT Photomultiplier

psi Pounds per square inch

PVC Polyvinylchlorid

ROS Reaktive Sauerstoffspezies

SEM Standard error of mean

STR Straightness

TRIS Tris-hydroxymethyl-aminomethan

VAP Velocity average path

VCL Velocity curve line

VG Versuchsgruppe

VSC Velocity straight line

W Watt

x g Erdbeschleunigung

Einleitung

1 1 Einleitung

Die instrumentelle Samenübertragung wird weltweit seit Jahrzehnten bei verschiedenen Nutz- und Haustieren erfolgreich eingesetzt, so auch in der Schafzucht.

Vorzüge ergeben sich hierbei nicht nur durch die Reduzierung venerischer Infektionen, sondern insbesondere auch durch gesteigerten Zuchterfolg aufgrund des Einsatzes genetisch wertvoller Böcke und dem internationalen Transfer von Genmaterial, ohne Tiere aufwendig zu transportieren oder sie Quarantänemaßnahmen aussetzen zu müssen (CURRY, 2000). Weiterhin ermöglicht die instrumentelle Samenübertragung Zuchtprogramme für den Erhalt seltener Schafrassen sowie das Anlegen von Genreserven, um die genetische Vielfalt langfristig zu erhalten. Da frisches oder gekühltes Sperma jedoch nur eine begrenzte Lebensdauer aufweist, ist die Ausschöpfung des Potenzials der instrumentellen Samenübertragung nur unter Verwendung kryokonservierter Spermien möglich.

Eine weitere Reproduktionstechnik, die zukünftig ihren Einzug in die Schafzucht halten könnte, ist die Möglichkeit der durchflusszytometrischen Selektion der X- und Y- Chromosom-tragenden Spermien, um so das Geschlecht der Lämmer zu beeinflussen. Eine auf diese Art durchgeführte Selektion zugunsten der weiblichen Nachkommen ist beispielsweise erstrebenswert, falls eine schnelle Remontierung oder die Milchproduktion im Vordergrund steht. Für eine effektive Woll- oder Fleischproduktion würden männliche Nachkommen den Vorzug erhalten. Die begrenzte Verfügbarkeit der Technologie zur Geschlechtssortierung erfordert es, die Besamungsportionen tiefzugefrieren, bevor sie zum Einsatz kommen (E^VANS et al., 2004).

Auch heute noch stellt die Tiefgefrierung in Form von Pellets nach EVANS UND MAXWELL

(1987), die Methode der Wahl für die Konfektionierung dar. Jedoch sind ihrer Anwendung kritische Punkte entgegenzusetzen. Grund dafür ist einerseits der Mangel an platzsparenden Verpackungsbehältnissen und die Gefahr einer mikrobiellen Kontamination. Andererseits besteht auch das Risiko einer potenziellen

2

Spermienübertragung zwischen verschiedenen Pellets auf der Trockeneisplatte und das Problem einer fehlenden Möglichkeit permanenter Kennzeichnung gemäß EU- Samenverordnung (SAMENV, 2008). Eine denkbare Alternative, die bei anderen Spezies bereits überaus erfolgreich eingesetzt wird, ist die Verwendung von Kunststoffhalmen (Straws). So lassen sich letztere serienmäßig befüllen, platzsparend lagern sowie permanent und dauerhaft durch automatisiertes Bedrucken kennzeichnen. Um die steigende Nachfrage nach kryokonservierten Schafbockspermien (MORRELL, 2011; SATHE, 2018) zu bedienen, wäre es notwendig ein effektives Einfrierprotokoll zum Tiefgefrieren in Straws zu etablieren.

Ziel dieser Arbeit war daher die Entwicklung und Optimierung eines Protokolls zur erfolgreichen Kryokonservierung von geschlechtssortierten und unsortierten Schafbockspermien in Straws als Alternative zur Pelletmethode.

Literaturübersicht

3 2 Literaturübersicht

2.1 Instrumentelle Samenübertragung beim Schaf

Frisch verdünntes Flüssigsperma ist für die Besamungspraxis logistisch nur bedingt einsetzbar und seine Verwendung hängt unter anderem vom Ort und Zeitpunkt der Samenentnahme ab, insbesondere wenn männliche und weibliche Schafe nicht ortsnah gehalten werden. Dieses gilt umso mehr für geschlechtssortiertes Sperma, dessen Befruchtungskapazität im Vergleich zu nichtsortierten Spermien eingeschränkt sein kann (HOLLINSHEAD et al., 2003).

Um diese Einschränkungen zu umgehen, ist es notwendig Spermien zu konservieren.

Im Gegensatz zur Flüssigkonservierung mit einer Abkühlung der Spermien auf 0 - 5° C (MAXWELL UND SALAMON, 1993), bietet die Kryokonservierung in flüssigem Stickstoff (-196° C) die Möglichkeit zur zeitlich unbegrenzten Lagerung (MAZUR, 1980), wodurch auch ein internationaler Transport realisierbar wird. Selbst eine Aufbewahrung von Schafspermien über 27 Jahre hat keinen negativen Effekt auf die Fruchtbarkeit (SALAMON UND M^AXWELL, 2000).

Die enormen Temperaturschwankungen, denen die Spermien während des Einfrier- und Auftauvorgangs ausgesetzt sind, führen jedoch unweigerlich zu einer herabgesetzten Motilität durch ultrastrukturelle, biochemische und funktionelle Schädigungen (Q^UINN et al., 1969; N^ATH, 1972). Da die Cervixpassage mit den notwendigen Besamungsinstrumenten nur unzuverlässig und mit größerem Aufwand durchquert werden kann, brachten transzervikale Besamungen nur unzureichende Resultate in Bezug auf die Ablammrate (W^INDSOR et al., 1994; S^ANCHEZ-P^ARTIDA et al., 1999; CURRY, 2000). Zufriedenstellende und verlässliche Ablammergebnisse durch kryokonservierte Spermien lassen sich nur mit laparoskopischer, intrauteriner Besamung erzielen (LIGHTFOOT UND SALAMON, 1970; SALAMON UND MAXWELL, 1995b;

MASOUDI et al., 2016).

WATSON (2000) berichtet davon, dass nur ein Bruchteil der Spermien, die in den unteren weiblichen Genitaltrakt gegeben werden, den Eileiter und das Spermienreservoir im kaudalen Isthmus erreicht. Der Großteil wird aus der Vulva

4

wieder ausgeschieden oder im Genitaltrakt phagozytiert. Wird die Spermiensuspension jedoch tiefer im Genitaltrakt platziert, können auch geringere Spermienanzahlen, wie sie in kryokonservierten Spermaportionen benutzt werden, zu einer nahezu unveränderten Trächtigkeitsrate führen (WATSON, 2000).

Um die geringere Viabilität der aufgetauten Spermien auszugleichen, ist neben einer termingenauen, hormonellen Synchronisation der zu besamenden Schafe auch die exakte Positionierung der Besamungsportion in den Uterushörnern entscheidend, um das Befruchtungspotential der kryokonservierten und geschlechtssortierten Spermien voll auszuschöpfen (MAXWELL, 1986a; MAXWELL, 1986b; BEILBY et al., 2009). Dabei hat sich eine deutliche Überlegenheit der Injektion der Spermien in beide Uterushörner gegenüber der Gabe in nur ein Horn gezeigt. Bei der Verwendung von Besamungsportionen deren Spermienzahl deutlich unter der kommerziell eingesetzten liegt, konnte eine signifikante Steigerung der Trächtigkeitsrate durch eine Eileiter- statt durch intrauterine Injektion erreicht werden (MAXWELL et al., 1993).

Neben der Kryokonservierung stellt auch der Einsatz geschlechtsdifferenzierter Spermien beim Schaf eine Indikation zur intrauterinen Samenübertragung dar (E^VANS et al., 2004; BEILBY et al., 2009). Durch die zahlenmäßig geringe Verfügbarkeit von Spermien, die in X- und Y-Chromosom-tragende Spermienpopulationen getrennt wurden, erfordert ihre Verwendung eine effiziente Besamungstechnik (EVANS et al., 2004).

In einer groß angelegten Untersuchung konnten H^ILL et al. (1998) 28.447 kommerziell durchgeführte laparoskopische Besamungen von Merinoschafen in Australien auswerten. Hierbei wurde unter Verwendung von Frischsperma eine durchschnittliche Trächtigkeitsrate von 82,2 % erreicht (n = 2.508 Besamungen). Dem gegenüber führten Besamungen mit kryokonserviertem Sperma zu Trächtigkeitsraten von lediglich 71,6 % im Falle von Straws (n = 7.877 Besamungen) bzw. 69,5 % im Falle von Pellets (n = 18.062 Besamungen). Die beiden kryokonservierten Varianten unterschieden sich hierbei nicht signifikant.

Literaturübersicht

5 2.2 Grundlagen der Kryokonservierung

Während der Kryokonservierung sind die Zellmembranen einer Vielzahl von schädigenden Stressfaktoren ausgesetzt. Dadurch, dass die Spermienzellen nur einen sehr geringen Stoffwechsel, ein sehr kleines endoplasmatisches Retikulum und einen wenig ausgebildeten Golgi-Apparat aufweisen, ist die Fähigkeit, die Membranintegrität zu erneuern, stark eingeschränkt (MEDEIROS et al., 2002).

Als schädigende Stressoren wirken unter anderem der Einfluss der Kryoprotektiva vor dem Gefrieren, die mit Dehnung und Einschrumpfung der Zellen einhergehenden Volumenschwankungen, das hyperosmotische Milieu, die Eiskristallbildung im extrazellulären Medium, sowie die hervorgerufene Dehydration (PARKS UND GRAHAM, 1992; WATSON, 2000). Messbar werden diese beeinträchtigenden Auswirkungen durch eine herabgesetzte Motilität und Veränderungen der Plasmamembran (WATSON, 1995;

HOLT, 2000a; DURU et al., 2001).

2.2.1 Kryobiologie der Abkühlung

Ziel der Abkühlung der Spermien auf 4° C ist es den Zellstoffwechsel herunterzufahren und somit die Lebensspanne der Spermien zu verlängern (MEDEIROS et al., 2002).

Darüber hinaus wird der Metabolismus der Spermien auf den anstehenden Kryokonservierungsprozess vorbereitet.

Während des Abkühlvorganges auf Temperaturen knapp über dem Gefrierpunkt wirken verschiedene Faktoren auf die Spermien ein, die Einfluss auf das Überleben der Zellen nehmen. Ein schnelles, initiales Abkühlen von 30° C auf 15° C hat hierbei keine negativen Auswirkungen auf die Motilität der Spermien vor und nach dem Einfriervorgang. Im Gegensatz dazu führt jedoch ein rapides Abkühlen von 30° C auf 4° C zu massiven Schädigungen der Samenzellen (FISER et al., 1986; FISER et al., 1987). Entscheidender für den Erfolg der Kryokonservierung ist jedoch das sich anschließende Temperaturfenster bis -25° C (SALAMON UND MAXWELL, 1995a).

Die schädigende Wirkung eines raschen Temperaturabfalls auf die Spermien wird als Kälteschock bezeichnet (DROBNIS et al., 1993). Schafbockspermien reagieren

6

empfindlich gegenüber rapider Abkühlung auf Temperaturen knapp über dem Gefrierpunkt als bei einer langsameren, über zwei Stunden dauernden Abkühlung (WATSON, 1981; WATSON UND MORRIS, 1987).

Verschiedene Studien kommen zu dem Schluss, dass die irreversiblen Schäden der Spermien im Zuge des Kälteschocks auf eine Lipidphasentransformation in der Spermienmembran zurückzuführen ist (HOLT UND NORTH, 1984; DROBNIS et al., 1993).

Dabei gehen Lipide durch die rapide Abkühlung von der flüssigen in eine Gel-Phase über. Folgen sind eine instabilere Membran, der Verlust flagellarer Aktivität, Schäden an intrazellulären Organellen und gesteigerter Permeabilität für verschiedene Ionen.

Insbesondere der Verlust an Kaliumionen, sowie die Aufnahme von Kalziumionen sind charakteristisch für die temperaturabhängige Phasentransformation der Membranlipide (WATSON UND MORRIS, 1987; DROBNIS et al., 1993; MEDEIROS et al., 2002). Ultrastrukturell zeigt sich der Kälteschock am deutlichsten in Veränderungen der akrosomalen Membran (MEDEIROS et al., 2002).

Die Spermatozoa unterschiedlicher Säugetiere unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Sensibilität in Bezug auf den Abkühlvorgang. D^ARIN-BENNETT UND W^HITE (1977), beschrieben in ihrer Arbeit, dass die Empfindlichkeit der Spermien gegenüber dem Kälteschock abhängig von dem Cholesterol/Phospolipidverhältnis (CH/PL) in der Membran ist. Für Schafböcke wurde nachgewiesen, dass besonders die apikale Region der Akrosomenmembran von Kälteschockauswirkungen betroffen ist, was durch eine Schwellung der Membran elektronenmikroskopisch sichtbar wird (QUINN et al., 1969). Diese Lipidzusammensetzung der Spermienmembranoberfläche ist für die Fruchtbarkeit von besonderer Bedeutung, da diese Lipide direkten Einfluss auf die Interaktion und Fusion mit der Eizelle haben (PARKS UND GRAHAM, 1992).

Die erste Volumenveränderung, die von den Spermien während eines Gefrierzyklus durchlaufen wird, erfolgt in der Abkühlungsphase. Durch Zugabe der Kryoprotektiva in das Medium steigt das osmotische Potential und es kommt mit der Diffusion von Wasser aus dem Intrazellularraum zu einer Volumenverminderung. Sobald die penetrierenden Kryoprotektiva in die Spermienzellen eingedrungen sind, wird dieser

Literaturübersicht

7

Effekt aufgehoben und das Zellvolumen erreicht bei optimal abgestimmten Gefrierverdünnern seinen Ausgangswert (H^AMMERSTEDT et al., 1990).

Zum weitgehenden Erhalt der Fruchtbarkeit der Spermien kann das Auftreten von Kälteschockerscheinungen reduziert werden, indem das Abkühlen in einer reduzierten Geschwindigkeit von wenigen Grad Celsius pro Minute erfolgt (WATSON, 1981; KUMAR

et al., 2003) und die Spermienmembranen durch die Zugabe von kryoprotektiven Substanzen zusätzlich geschützt werden (QUINN et al., 1980; QUINN, 1985; GRAHAM UND FOOTE, 1987; QUINN, 1989).

2.2.2 Kryobiologie des Gefriervorganges

Wie andere Zelltypen können auch Spermien eine Lagerung bei -196° C überdauern, wenn sie nach dem Abkühlen und Einfrieren das Auftauen ohne Schäden überstehen (HAMMERSTEDT et al., 1990). Dazu müssen sie jedoch zuerst einer Reihe verschiedener Einflüsse standhalten.

Im Temperaturbereich um -5° C ist das Wasser im extra- und im intrazellulären Bereich noch nicht gefroren, sondern liegt in einem unterkühlten Zustand vor. Kurz bevor -10° C erreicht werden, beginnt das Wasser im extrazellulären Medium zu gefrieren, während es in den Zellen noch unterkühlt bleibt (MEDEIROS et al., 2002).

Dadurch, dass Wasser durch extrazelluläre Eiskristalle im umgebenden Medium gebunden wird, steigt die Konzentration von Ionen und anderen osmotisch wirksamen Lösungsbestandteilen in der verbleibenden Flüssigkeit, in der sich die Zellen bewegen (MAZUR UND COLE, 1989; PEGG UND DIAPER, 1989). Durch die hohe Elektrolytkonzentration der verbleibenden Flüssigkeit wird den Zellen intrazelluläres Wasser entzogen (M^{AZUR UND} C^OLE, 1989; P^{EGG UND} D^IAPER, 1989; H^AMMERSTEDT et al., 1990). Folglich kommt es zu einem starken Schrumpfen der Zelle und somit zu einer zweiten Volumenveränderung.

LOVELOCK (1953) zeigte in seinen Arbeiten an humanen Erythrozyten, dass ein entscheidender Teil der Gefrierschäden auf den Einfluss der hohen

8

Elektrolytkonzentrationen während des Gefrierens zurückzuführen ist. Die verbleibende, hyperosmotische Flüssigkeit stellt sicher, dass die notwendige, zelluläre Dehydration stattfinden kann. Zu starke Dehydration führt hingegen zur irreversiblen Degeneration von Makromolekülen, extremer Schrumpfung der Zelle und fatalem Membrankollaps (G^AO et al., 1997). Daher darf die Zeitspanne in der die Zelle dem starken hyperosmotischen Zustand ausgesetzt ist, nicht zu groß werden.

Ein anderer schädigender Effekt geht von den Eiskristallen aus, die sich extrazellulär um die Zellmembran bilden (QUINN, 1985). Die Phase, in welcher das Innere der Zellen gefriert bildet den Bereich der kritischen Temperatur im Gefrierprozess und befindet sich zwischen -15° C und -60° C (SALAMON UND MAXWELL, 1995a). In diesem Temperaturbereich entstehen die schwerwiegendsten Membranschäden besonders dann, wenn die beschriebene Dehydration zuvor nicht ausreichend stattgefunden hat.

Während des Auftauprozesses durchlaufen die Spermien die beschriebenen Beobachtungen erneut in umgekehrter Reihenfolge (MAZUR, 1984). Dabei ist das Ausmaß der Einflüsse von der Auftaugeschwindigkeit und damit von der Wirkungszeit abhängig (FISER et al., 1986). Für eine bestmögliche Überlebenswahrscheinlichkeit der Spermien ist es daher essentiell die Geschwindigkeit des Auftauprozesses, an die des Abkühlvorganges anzupassen (RUGG et al., 1977).

Aufgetaute Spermien zeigen häufig Membranveränderungen, die beim Einsatz von Chlortetracyclin Färbungsmuster aufweisen, die charakteristisch für Kapazitation sind (WATSON, 1995; GILLAN et al., 1997). Kapazitierte Spermien binden nicht oder nur für eine verkürzte Dauer an das Ovidukt-Epithel und zeigen dadurch nur eine begrenzte Überlebensdauer von 1 bis 8 Stunden (GILLAN UND M^AXWELL, 1999; G^ILLAN et al., 2000). Außerdem wird durch die Kapazitation die Membranpermeabilität erhöht und die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) verstärkt (A^MIDI et al., 2016).

Die optimale Gefrierrate zeichnet sich dadurch aus, dass sie einerseits eine langsame Abkühlung gewährleistet, um letale Effekte durch intrazelluläre Eiskristallbildung zu verhindern und die Dehydration der Zelle ermöglichen. Andererseits muss der Einfriervorgang schnell genug stattfinden, um die osmotische Schäden durch ein zu

Literaturübersicht

9

langes Verweilen in der hypertonen extrazellulären Salzlösung zu verhindern (H^OLT, 2000b). Eine genau auf Schafspermien und das Verdünnersystem abgestimmte Gefrier- und Auftaurate ist somit entscheidend für die fertilitätserhaltende Kryokonservierung.

2.2.3 Ausgewählte Kryoprotektiva und Verdünnerbestandteile

Deutliche Verbesserungen bei der Kryokonservierung von Bullenspermien konnten PHILLIPS UND LARDY (1940) durch den Einsatz von Eidotter im Gefriermedium erreichen. Grundlegend für die Entwicklung neuer Verdünnersysteme war außerdem die Entdeckung der kryoprotektiven Eigenschaft von Glycerin, welche zuerst an Geflügelspermien festgestellt wurde (POLGE et al., 1949). Ein großer Schritt in der weiteren Entwicklung der Tiefgefriermedien war die aussichtsreiche Kombination der beiden zuvor untersuchten Zusätze Eidotter und Glycerin, was zu einer deutlich verbesserten Motilität der Spermien nach dem Auftauen führte (STEINBACH UND FOOTE, 1964).

Auch wenn die genaue Schutzwirkung des Eidotters nicht vollständig geklärt ist, wurde nachgewiesen, dass die Hauptwirkung auf die low density lipoprotein fraction (LDL) zurückgeht (P^{ACE UND} G^RAHAM, 1974; W^ATSON, 1976). Die Vermutung liegt nahe, dass der schützende Effekt auf eine Bindung der Eibestandteile an die äußere Membran der Spermatozoen zurückzuführen ist. Diese Bindung des Eidotters an die Zellmembran konnte W^ATSON (1975) durch einen Fluoreszenzmarker sichtbar machen. Dabei wurde festgestellt, dass sich die Partikel an die Membran anlagern und diese ummanteln. Ebenso konnten radioaktivmarkierte Eidotterpartikel auch nach intensiven Waschvorgängen noch an den Membranen von Bullenspermien nachgewiesen werden (FOULKES, 1977). Die Ergebnisse von WATSON (1976) legen außerdem die Schlussfolgerung nahe, dass Spermien von Schafböcken weniger stark von den positiven Auswirkungen der LDL profitieren als die von Bullen.

Die größte Schutzwirkung für die Spermien während des Abkühlvorganges nahe des Gefrierpunkts von Wasser wird dem Verdünnerbestandteil Eidotter zugesprochen

10

(MAXWELL UND S^ALAMON, 1993). Außerdem erhält es die Überlebensfähigkeit der Spermien bei Verdünnung, sowie dem Einfrier- und Auftauprozess, wobei es die Motilität und die Integrität der akrosomalen und mitochondrialen Membranen erhält (SALAMON UND MAXWELL, 1995a).

Um Alternativen zu Glycerin in Gefriermedien zu finden, welche die in Kapitel 2.2.4 toxischen Eigenschaften nicht aufweisen, wurde an alternativen Zusätzen geforscht.

SALAMON (1968) gelangte zu dem Ergebnis, dass Ethylenglykol für Schafbockspermien weniger Schutz bietet als das Glycerin. Auch DMSO war Glycerin unterlegen (SALAMON, 1968; MOLINIA et al., 1994).

Eine wesentliche Funktion zum Erhalt der spermatologischen Qualitätsmerkmale nimmt die Homöostase aus reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und Antioxidantien (AO) ein (SIKKA et al., 1995; BANSAL UND BILASPURI, 2010). Die physiologisch im Seminalplasma vorliegenden antioxidativ wirksamen Enzyme bilden für die Spermien einen wirksamen Schutz vor oxidativem Stress und damit assoziierten Folgephänomenen wie die Fragmentierung des Erbguts oder der Lipidoxidation der Membransysteme (POTTS et al., 2000; MUINO-BLANCO et al., 2008). Verschiedene Autoren berichten von einer Verschiebung dieses Gleichgewichtszustandes zu Gunsten der ROS durch eine Vielzahl von Einflüssen während des Kryokonservierungsprozesses, wie starke Verdünnung des Seminalplasmas, Kälteschock oder Veränderungen im Zellvolumen (MAXWELL UND J^OHNSON, 1999;

LOPEZ-FERNANDEZ et al., 2008; LOPEZ-FERNANDEZ et al., 2010; AMIDI et al., 2016). Somit lassen sich auch die Kälteschockschäden, die während der Abkühlung von verdünnten Schafbockspermien auftreten, durch Antioxidantien mildern (H^AMMERSTEDT et al., 1978; P^ERIS et al., 2007). Aus diesem Grund sind Substanzen mit antioxidativem Charakter essentielle Bestandteile in den gängigen Verdünnersystemen zur Kryokonservierung von Schafbockspermien (MATA-CAMPUZANO et al., 2015; ALLAI et al., 2018).

Literaturübersicht

11 2.2.4 Die besondere Rolle des Glycerins

Seitdem P^OLGE et al. (1949) zum ersten Mal die Vorteile des Einsatzes von Glycerin als Schutz beim Gefrieren von Spermien entdeckt und beschrieben haben, ist Glycerin die wohl meist eingesetzte kryoprotektive Substanz (B^AILEY et al., 2000; SALAMON UND

MAXWELL, 2000). Die Etablierung von Glycerin als wichtiger Baustein der Reproduktionstechnik wurde weiterhin durch die Eignung zur Konservierung in Flüssigstickstoff (LN2) begünstigt (STEINBACH UND FOOTE, 1964). Seither hat Glycerin Einzug in die Kryokonservierungsprotokolle für die verschiedensten Zelltypen gehalten und ist besonders für die zeitlich unbegrenzte Lagerung von Spermien im gefrorenen Zustand unverzichtbar (MOLINIA et al., 1994).

Glycerin ist der Trivialname des dreiwertigen Alkohols Propan-1,2,3-triol. Die bei Raumtemperatur farblose, klare, hygroskopische und geruchslose Flüssigkeit weist einen, seinem Namen entsprechenden süßlichen Geschmack auf. Seine Viskosität nimmt mit abfallender Temperatur kontinuierlich zu, bis bei -43°C ein Gefrieren mit einer Kristallisationsrate von unter 10^-4 mm pro Minute einsetzt. (BAUST, 1973;

H^OFFMANN, 2007).

Glycerin verändert die kolligativen Eigenschaften von Wasser, was den Gefriervorgang besonders in Bezug auf den osmotischen Druck und die Gefrierpunktserniedrigung positiv beeinflusst (LOVELOCK UND P^OLGE, 1954; M^AZUR, 1984). Dadurch kommt es zu einem Salzpuffer-Effekt, der die Dissoziation der Salze und damit einen Anstieg der Salzkonzentration auf ein schädigendes Level unterbindet (LOVELOCK UND P^OLGE, 1954; ROWE, 1966; HOFFMANN, 2007). Weiterhin wird von ROWE (1966) die These vertreten, dass durch die Einflussnahme auf die Ionenkonzentrationen Membrandenaturierung und intrazelluläre Eiskristallbildung verhindert werden können.

Ein anderer Schutzmechanismus des Glycerins besteht in seiner Fähigkeit ein Wassergitter zu bilden, wodurch ein Zustand erreicht wird, der dem gefrorenen ähnelt und so die Zelle vor dem eigentlichen Gefriervorgang stabilisiert (KAROW UND WEBB, 1965). Außerdem kann man die erhöhte Überlebensrate in Anwesenheit von Glycerin und anderen Schutzsubstanzen mit ihrer Fähigkeit erklären Wasserstoffbrücken zu

12

bilden (DOEBBLER UND R^INFRET, 1965). Besonders die drei Hydroxyl-Gruppen des Glycerins erweisen sich dabei als hilfreich.

Aufgrund der Beobachtungen kann man Glycerin sowohl Wirkeigenschaften im extra- als auch im intrazellulären Raum zuordnen. Die Versuche von BERNDTSON UND FOOTE

(1972b) weisen eine Schutzwirkung von Glycerin ohne Diffusion in die Zelle nach.

Andere Autoren konnten mit ihren Untersuchungen nahelegen, dass Glycerin auch eine wichtige Funktion beim Schutz der Plasmamembran übernimmt, indem die Stabilität, Permeabilität und die Interaktion der Membranbestandteile geschützt werden (BALLAS, 1981; O'LEARY UND LEVIN, 1984; ALVAREZ UND STOREY, 1993).

Bereits zu Beginn der Arbeiten zur Kryokonservierung mit Glycerin stand auch die Toxizität der Substanz im Fokus (COLAS, 1975; FISER UND FAIRFULL, 1984; FAHY, 1986).

Viele Untersuchungen zielten darauf ab, für die jeweilige Tierart und den jeweiligen Verdünner die optimale Glycerinkonzentration zu ermitteln (SHERMAN UND LIU, 1973).

Dabei sollte die verwendete Menge hoch genug sein, um eine bestmögliche Schutzwirkung zu erzielen. Gleichzeitig aber wird die eingesetzte Glycerinmenge nach oben hin durch die toxischen Effekte limitiert (FAHY, 1986; DE LEEUW et al., 1993). Die Toxizität wird maßgeblich durch die Dauer der Exposition, sowie die Temperatur im Mischmoment beeinflusst (BERNDTSON UND F^OOTE, 1972a; W^{ILMUT UND} P^OLGE, 1974).

Für Schafspermien wurde in diesem Zusammenhang nachgewiesen, dass die Zugabe von Glycerin bei +30° C signifikant schlechtere Auftaumotilitäten ergab, als wenn die Schutzsubstanz erst nach dem Abkühlvorgang bei +4° C zugegeben wurde (C^OLAS, 1975; G^IL et al., 2003).

Die jeweilige Optimalkonzentration an Glycerin ist von den Inhaltstoffen der Verdünnermedien, sowie ihrer Zusammensetzung und der Gefrierrate abhängig (SALAMON, 1968; FISER UND FAIRFULL, 1986; SALAMON UND MAXWELL, 1995a). Bezüglich des idealen Glyceringehaltes für die Konservierung von Schafspermien gibt es folglich sehr unterschiedliche Angaben. Einige Autoren sehen eine Konzentration zwischen 6 – 8 % als Optimum an (SALAMON UND MAXWELL, 1995a). Das deckt sich jedoch nicht mit anderen Arbeiten, in denen die besten Ergebnisse mit einem Glyceringehalt von

Literaturübersicht

13

4 % erzielt wurden (C^OLAS, 1975; F^{ISER UND} F^AIRFULL, 1989). C^OLAS (1975) führte als weitere Begründung für diese Diskrepanz in den Ergebnissen an, dass die optimale Glycerinkonzentration neben der jeweiligen Verdünnerzusammensetzung auch von der Spermienkonzentration der Suspension und somit von dem Verhältnis von Glycerinmolekülen pro Spermium abhängt.

In einer neueren Studie zur optimalen Glycerinkonzentration konnten BEILBY et al.

(2010) nachweisen, dass ihre geschlechtssortierten Proben je nach Spermienkonzentration in Hinblick auf ihre Motilität unterschiedlich auf verschiedene Glycerinkonzentrationen im Tiefgefriermedium reagieren. So führte der Einsatz von 5 %, 6 % oder 8 % Glycerin in Proben mit 80 x 10⁶ Spermien/ml zu keinem signifikanten Unterschied. Waren die Spermien jedoch auf 20 x 10⁶ je Milliliter verdünnt, so konnte die beste Motilitätsrate von über 80 % nur mit dem 5 %igem Medium erzielt werden. Die 6 %-Probe lag bei ca. 65 % und die mit 8 % Glycerin bei knapp über 30 %. Mit 6 % und 8 % Glycerin zeigten die Spermien nach 4 Stunden kaum noch Motilität. Auch mit dem 5 % Glyceringehalt nahm diese nach 6 h auf einen einstelligen Wert ab.

14 2.3 Kryokonservierung von Schafspermien

Säugetierspermien sind evolutionär nicht dazu ausgelegt Temperaturschwankungen zu ertragen. Im Hoden sind die Schafbockspermien von ungefähr 34,9° C warmen Gewebe umgeben (C^OULTER et al., 1988). Ihr vorbestimmter Weg führt sie aus den Hoden, in den Nebenhodenschwanz und bei der Ejakulation durch den Samenleiter und Harnröhre direkt in den weiblichen Genitaltrakt, wo eine Temperatur von ca. 39° C herrscht (ABRAMS et al., 1971).

Die Ansprüche der Spermien von verschiedenen Spezies an das für sie optimale Einfrierprotokoll unterscheiden sich außerdem durch ihre Zellformen, -volumen, Organellengröße und deren Zusammensetzung (CURRY et al., 1996; MEDEIROS et al., 2002).

WATSON (2000) berichtete davon, dass 40 - 50 % der Spermien die Kryokonservierung trotz optimierter Verarbeitungsverfahren nicht überleben. Die folglich auftretende, reduzierte Fertilität begründete er einerseits durch verminderte Viabilität und andererseits durch subletale Schädigungen der verbleibenden Spermienpopulation.

Zur verringerten Überlebensfähigkeit von Spermien nach dem Kryokonservierungs- prozess kommt erschwerend hinzu, dass die embryonale Sterblichkeit erhöht ist (SALAMON UND L^IGHTFOOT, 1967). Dieser Effekt wurde von verschiedenen Wissenschaftlern unterschiedlich deutlich festgestellt und basiert wahrscheinlich auf der Invasivität der Besamungsmethode, sowie dem Besamungszeitpunkt (S^ALAMON

UND M^AXWELL, 1995b).

2.3.1 Kryokonservierung von Schafbockspermien in Pellets

Für die Kryokonservierung von Schafbocksperma in Pellets existieren verschiedene Verfahren, die ausführlich in der Literatur beschrieben wurden (DE GRAAF et al., 2007b;

DE GRAAF et al., 2007c; BEILBY et al., 2009).

Zentraler Verfahrensschritt ist das Platzieren der Spermiensuspension auf einer Trockeneisplatte, in die zuvor Mulden eingelassen wurden. Die Besamungsportionen

Literaturübersicht

15

werden bis zum vollständigen Gefrieren auf der Trockeneisplatte belassen und im Anschluss direkt in den LN2 überführt.

In einer umfangreichen Studie konnten M^AXWELL et al. (1995) die Überlegenheit der Pelletmethode hinsichtlich der Spermienmotilität nach dem Auftauen gegenüber der Benutzung von 0,5 ml und 0,25 ml PVC-Straws belegen. Vergleichbare Ergebnisse wie mit dem Gefrieren in Pellets auf Trockeneis ließen sich nur mit 0,25 ml Minitubes erzielen. Auch in vorhergegangenen in vivo Experimenten konnten bessere Trächtigkeitsraten durch Besamungen mit Spermienpellets statt Straws erzielt werden (MAXWELL et al., 1980).

Die Gefriergeschwindigkeit kann dabei durch das Volumen der Pellets und somit durch das Oberflächen-Volumen-Verhältnis reguliert werden (SALAMON UND MAXWELL, 1995a). Für Pelletvolumina von 0,03 bis 0,86 ml wurden keine signifikanten Abweichungen der Motilität nach dem Auftauen festgestellt (LIGHTFOOT UND SALAMON, 1969; VISSER, 1974).

LIGHTFOOT UND SALAMON (1969) maßen hierzu mittels eines Chromel-Alumel- Thermoelements den Temperaturabfall in Pellets von 0,032 bis 0,864 ml während des Gefriervorgangs. Abhängig vom Pelletvolumen zeigt sich ein sigmoider Temperaturverlauf mit einer langsameren initialen Abkühlungsphase von 0 bis ca. - 5° C gefolgt von einem rapiden Temperaturabsinken bis sich die Pellettemperatur der der Trockeneisplatte von ungefähr -78° C annähert.

Für den Erfolg der Kryokonservierung ist das Auftauprozedere genauso entscheidend wie das Einfrieren. Um Pellets aufzutauen, werden zwei unterschiedliche Abläufe beschrieben. Für das wet thawing werden die Pellets in eine vorgewärmte Verdünnerlösung gegeben und so noch weiter verdünnt. Im Gegensatz dazu werden die pelletierten Besamungsportionen zum dry thawing direkt in einem Gefäß mit entsprechender Temperatur gegeben (SALAMON UND MAXWELL, 1995a). Auch wenn einige Autoren jeweils die eine oder andere Methode zum Auftauen der Pellets bevorzugen, so konnten andere keine Abweichungen in den Ergebnissen feststellen (LIGHTFOOT UND SALAMON, 1969; VISSER UND SALAMON, 1973).

16

Trotz der besseren Motilitätsraten mit der Pellet-Methode, gibt es entscheidende Nachteile, die die Nutzung einschränken und für manche Anwendungsbereiche sogar verhindern. Die nicht mögliche „dauerhafte und leicht lesbare“ Kennzeichnung, wie sie gesetzlich durch die Samenverordnung § 6 (SAMENV, 2008) vorgeschrieben ist, verbietet den Handel und genetischen Austausch. Aufgrund des Fehlens passender Aufbewahrungsgefäße ist die Lagerung in LN2 platzintensiv.

2.3.2 Kryokonservierung von Schafbockspermien in PVC-Straws

Straws lassen sich im Gegensatz zu Spermienpellets problemlos mit kommerziell erhältlichen Druckern permanent kennzeichnen und platz- und kostensparend in LN2

lagern. Um die Konservierung in Straws weiterzuentwickeln und zu optimieren sind viele Untersuchungen vorgenommen worden (FISER et al., 1986; MAXWELL et al., 1995;

POGORZELSKI, 2005; REKHA et al., 2016).

Dabei wurde untersucht, welcher Temperaturverlauf hohe Auftaumotilitäten von Schafbockspermien in Straws garantiert. Dafür hatten FISER UND FAIRFULL (1984) in ihren Experimenten verschiedene lineare Abkühlraten für diverse Glycerinkonzentrationen untersucht. Da der für die vorliegende Arbeit benutzte Sexcess®-Verdünner eine Glycerinkonzentration von 6,4 % aufweist, müsste der obengenannten Literatur zufolge ein linearer Temperaturabfall von ca. -20° C/min die bestmögliche Überlebenschance für Spermien in Straws bieten. Auch in anderen Quellen wurde -20° C/min als Abkühlrate der Wahl für computergesteuerte Einfrierverfahren in PVC-Straws angeführt (P^ONTBRIAND et al., 1989; D^ONOVAN et al., 2001).

Gleichzeitig liegen aber auch Experimente vor, die keine signifikanten Differenzen in der Erfolgsquote von Besamungen mit auf Trockeneis gefrorenen Pellets und Straws, die bei -20° C min^-1 konserviert wurden, nachweisen (FISER et al., 1987; PONTBRIAND

et al., 1989).

Für das Auftauen der Straws empfehlen die meisten Autoren, diese direkt von -196° C im LN2 in ein 38 - 42° C warmes Wasserbad zu überführen (SALAMON UND MAXWELL,

Literaturübersicht

17

1995a). Nach ca. 30 Sekunden hat die Besamungsportion die Wasserbadtemperatur angenommen und kann versamt bzw. spermatologisch untersucht werden (FISER UND

FAIRFULL, 1984).

18 2.4 Geschlechtsdifferenzierung

Bisher wurden verschiedene Methoden zur präkonzeptionellen Geschlechts- determination getestet. Mit Ausnahme der durchflusszytometrischen Spermiensortierung erzielte jedoch keine der untersuchten Methoden verlässliche Ergebnisse und ließen sich nicht etablieren (R^ATH et al., 2009). Unter anderem erwiesen sich Verfahren, X- und Y-Chromosom-tragende Spermien durch Bestimmung ihres Dichteunterschiedes von 0,0007 g/cm³ mittels Dichtezentrifugation oder durch spezielle Gelelektrophorese zu trennen, als nicht geeignet (JAFAR UND

FLINT, 1996). Auch der Versuch monoklonale Antikörper gegen das Histokompatibilität- Y-Antigen einzusetzen, zeigte sich als zu ungenau (HOPPE UND KOO, 1984).

Das einzige Sortierverfahren, welches als zuverlässig einzustufen ist und bereits kommerziell genutzt wird, ist die durchflusszytometrische Sortierung, dessen Prinzip auf der Bestimmung des relativen Unterschiedes im DNA-Gehalts der X- bzw Y- Chromosomen-tragenden Spermien beruht und durch eine individuelle Bestimmung und Sortierung jedes Spermiums erfolgt (MAXWELL et al., 2004; RATH et al., 2009).

2.4.1 Prinzip der durchflusszytometrischen Spermiensortierung

Die Voraussetzung, welche die durchflusszytometrische Geschlechtsdifferenzierung ermöglicht, ist der unterschiedliche chromosomale DNA-Gehalt durch das X- oder Y- Chromosom. Der DNA-Gehalt der X- bzw. Y-chromosomalen Spermien unterscheidet sich deutlich. Allerdings wird zur Erkennung nicht der absolute, sondern der relative Unterschied gemessen, der sich auf den Gesamt-DNA-Gehalt im Spermienkopf bezieht (J^OHNSON et al., 1989). Die Differenz im DNA-Gehalt ist speziesabhängig und beträgt beim Schafbock 4,2 %. Damit liegt diese Differenz leicht über den Werten der anderer Nutztiersäugern und dem des Menschen (Bulle 3,8 %, Eber 3,6 %, Hengst 3,7 %, Rüde 3,9 %, Mann 2,8 %) (GARNER, 2006).

Anfängliche Versuche fanden mit fixierten Chinchillaspermien statt, da diese durch einen Unterschied von 7,5 % in ihrem DNA-Gehalt gut in zwei Populationen aufzuteilen waren (JOHNSON et al., 1987b). Allerdings wurden die Spermien in diesen ersten

Literaturübersicht

19

Untersuchungen so stark geschädigt, dass ihre Fertilität verloren ging. Durch weitere Optimierungen konnten 1989 die ersten lebenden Nachkommen durchflusszytometrisch bestimmten Geschlechts von Kaninchen von J^OHNSON et al.

(1989) vermeldet werden. Seitdem fand die Beltsville Sperm Sexing Technologie (BSST) (J^OHNSON et al., 1999) Einzug in das Repertoire der Reproduktionstechnik für eine zunehmende Zahl an Säugetierarten. Die kommerzielle Anwendung konnte sich bisher jedoch nur beim Rind in größerem Umfang etablieren (RATH UND JOHNSON, 2008; RATH et al., 2013).

Eine entscheidende Grundlage für das durchflusszytometrische Trennen der Spermatozoa ist das Kenntlichmachen der DNA mithilfe eines geeigneten Farbstoffs.

Diese Substanz muss die Fähigkeit besitzen die Zellmembran lebender Zellen zu passieren, um die stark kondensierte DNA anfärben zu können. Des Weiteren sollte sie keinen negativen Einfluss auf die Fertilität und Vitalität der Spermien oder die Strömungseigenschaften der Spermiensuspension im Zytometer wie auch im Uterus haben. Die wichtige Entdeckung, dass der membranpermeable Fluoreszenzfarbstoff Bisbenzimide (Hoechst 33342) diesen Eigenschaften gerecht wird, leitete die Sortierung fertiler Spermien ein (JOHNSON et al., 1987a). Bei dem synthetischen Farbstoff Hoechst 33342 handelt es sich um einen nicht-interkalierenden Liganden der DNA, der bevorzugt an die Adenin-Thymin-Regionen helikaler DNA bindet (M^ULLER

UND G^AUTIER, 1975).

Durch die abgeplattete Form der Säugetierspermien unterscheidet sich die Quantität des Lichts, welches von den angefärbten Zellen emittiert wird in Abhängigkeit von der Position, in der die paddelförmigen Spermienköpfe zur Lichtquelle hin ausgerichtet sind. Bereits geringe Rotationen aus der vorgesehenen Achse können die geringe Differenz des DNA-Gehalts von 3 bis ca. 5 % kaschieren. Daher ist es notwendig, die Zellen in einer orthogonalen Position zur Strahlungsquelle auszurichten (DEAN et al., 1978). Dieses wird durch hydrodynamische Fokussierung eines Hüllstroms und Injektion des Probenstroms in einem speziell entwickelten Düsensystem erreicht (JOHNSON UND PINKEL, 1986). Die ausgerichteten Spermien passieren dabei im kontinuierlichen Hüllstrom einen UV-Laser, der den Farbstoff anregt. Das vom

20

Gesamt-DNA-Gehalt der Samenzelle abhängige Fluoreszenzsignal wird von der flachen Spermienkopfseite emittiert und vorwärtsgerichtet von einem Photomultiplier (PMT 0°) aufgefangen und in elektrische Signale umgesetzt. Zusätzlich geben die Spermien über die schmale Kante des Kopfes ein weiteres Lichtsignal ab, das DNA unabhängig ist und durch Lichtbrechung der Spermienkopfkante in dem umgebenden Flüssigmedium entsteht. Dieses Signal wird in einem zweiten PMT aufgefangen, die 90° versetzt zum Laserstrahl positioniert ist. Zweck dieses Signals ist es, die Position der Samenzelle relativ zum Laserstrahl zu bestimmen und nur maximal orientierte Spermien in den Sortierprozess aufzunehmen (JOHNSON et al., 1987a). Kurz hinter dem „point of interest“, an dem der Laser auf den Flüssigkeitsstrom trifft, beginnt der Flüssigkeitsstrom von der kontinuierlichen in eine diskontinuierliche Form über zu gehen und Tropfen zu bilden, die sich vom Flüssigkeitsstrom trennen. Dieses wird durch die Schwingungen eines Piezokristalls erreicht, der im Kopf des Düsensystems montiert ist. Jedes sich ablösende Tröpfchen sollte max. eine Samenzelle enthalten, deren DNA-Gehalt zuvor über die PMT Signale bestimmt wurde. Zusätzlich wird in dem Moment, in dem ein Tröpfchen sich vom Flüssigkeitsstrom abschnürt, eine elektrische Ladung auf den Flüssigkeitsstrom gegeben, die der separierte Tropfen dann mitnimmt und die entsprechend des DNA-Gehaltes positiv oder negativ ist. Die geladenen Tropfen passieren dann in freiem Flug ein elektrostatisches Feld und werden entsprechend ihrer Ladung nach rechts oder links abgelenkt (JOHNSON et al., 1987b).

Die Anzahl der auf diese Weise differenzierten Spermien wird von M^AXWELL et al.

(2004) als 15 x 10⁶ pro Stunde angegeben. GARNER (2006) gibt für die Leistung der kommerziell eingesetzten Geräte für das Geschlechtssortieren von Bullenspermien sogar Raten von bis zu 20 x 10⁶ geschlechtssortierten Spermien je X- und Y- Chromosom an.

Literaturübersicht

21

2.4.2 Einsatz geschlechtssortierter Spermien beim Schaf

Der erste Bericht über die Geburt eines Schaflammes aus durchflusszytometrisch differenzierten Spermien stammt von C^ATT et al. (1996). Aus 251 Eizellen, die mittels intrazytoplasmatischer Spermieninjektion (ICSI) durch geschlechtsdifferenzierte Spermien befruchtet wurden, konnten die Forscher in genannten Versuchen jedoch nur ein Lamm vermelden. Seitdem haben die Bemühungen verschiedener Arbeitsgruppen dazu geführt, dass mit dem Einsatz geschlechtssortierte Spermien über künstliche Besamungen bei Schafen passable Ergebnisse erzielt werden können (MAXWELL et al., 2004; RATH UND JOHNSON, 2008; DE GRAAF et al., 2009). Wie auch für andere Tierspezies wurde für Schafbockspermien festgestellt, dass die Eignung für das Geschlechtssortieren tierindividuell variiert (HOLLINSHEAD et al., 2002; GARNER, 2006).

Für die Entwicklung von Schafembryonen aus geschlechtssortierten und unsortierten Spermien wurden in verschiedenen Experimenten keine signifikanten Unterschiede in der Fertilität festgestellt (MORTON et al., 2005; DE GRAAF et al., 2007a; BEILBY et al., 2010). Einzig eine verzögerte Furchung wird in manchen Studien für die Spermien genannt, die einen Sortierungsprozess durchlaufen haben (MORTON et al., 2006).

MORTON et al. (2006) berichteten in dem Zusammenhang von Furchungsraten 24hpi von 37,4 % für gesexte Spermien und 55,6 % für unsortierte Spermien. Jedoch zeigte die Blastozystenbildung am siebten Tag 56,7 % für die unsortierten und 58,2 % für die geschlechtsdifferenzierten Spermien und somit keinen signifikanten Unterschied.

H^OLLINSHEAD et al. (2004) beschäftigten sich in ihren Versuchen mit Schafspermien, die sowohl vor dem Sortiervorgang als auch im Anschluss kryokonserviert wurden. Mit dieser Methode ließen sich eingelagertes Sperma oder solches von weit entfernt gehaltenen Schafböcken in X- und Y-Chromosom-tragende Spermien trennen. Die Autoren zeigten, dass geschlechtsdifferenzierte Spermien auch nach einem zweiten Gefrier- und Auftauzyklus voll funktionsfähig sind, wenn sie für IVF genutzt werden.

Aufbauend auf diese Ergebnisse erzeugten DE GRAAF et al. (2007b) sogar Nachkommen durch künstliche Besamung mit zweimal gefrorenen geschlechtssortierten Spermien. Der Einsatz geschlechtssortierter und wiederholt

22

gefrorener Schafbockspermien ist nicht nur für die Schafzucht von großem Interesse.

Es dient ebenfalls als Modell zur Erprobung von Reproduktionstechniken für Wildtierspezies (O'B^RIEN et al., 2003; E^VANS et al., 2004).

Mittlerweile gilt es als erwiesen, dass geschlechtsdifferenzierte Spermien den nicht differenzierten nativen Zellen in Hinblick auf ihre Fertilität kaum unterlegen sind.

Neuste Untersuchungen legen sogar den Schluss nahe, dass durch das Aussortieren membrandefekter Spermien im Durchflusszytometer eine Spermiensubpopulation entsteht, die in ihrer Motilität, Fertilität, Mitochondrienaktivität und Membranintegrität den unsortierten überlegen ist (DE GRAAF et al., 2007a; BEILBY et al., 2009; DE GRAAF

et al., 2009). Jedoch nehmen durch den Sortiervorgang die Geschwindigkeit der Spermien und ihre Fähigkeit künstlichen Zervikalmukus zu durchqueren ab (DE GRAAF

et al., 2006). Durch diese Beobachtung heben sich Schafböcke von allen anderen bisher untersuchten Tierarten ab. Ob dieses Phänomen durch tierartspezifische Unterschiede in der Membranzusammensetzung, Interaktion mit Seminalplasma- bestandteilen, der Chromatinstruktur oder andere Umstände bedingt wird, ist noch nicht abschließend geklärt (DE GRAAF et al., 2009).

Für den kommerziellen Einsatz für laparoskopische Besamungen mit kryokonservierten Spermien werden in der australischen Schafindustrie standardmäßig Besamungsportionen mit 25 Millionen motilen Spermien eingesetzt (E^VANS et al., 2004). Für die Besamung mit geschlechtsdifferenzierten Spermien empfehlen einige Quellen eine vergleichbare Anzahl (HOLLINSHEAD et al., 2003; EVANS

et al., 2004). Jedoch zeigen Studien, dass durch angepasste Einfrier- und Besamungsprotokolle auch mit weit geringerer Spermienzahl akzeptable Ablamm- ergebnisse sowohl mit geschlechtssortierten als auch mit unsortierten, kryokonservierten Spermien erzielt werden können (siehe Tabelle 1). So erreichten DE

GRAAF et al. (2007c) mit nur 1 x 10⁶ geschlechtsdifferenzierten Spermien eine Ablammrate von 61,5 %. Es wird gemutmaßt, dass die besseren spermatologischen Qualitätsmerkmale der geschlechtssortierten Spermien unter anderem auf einen verminderten Druck während der Zytometerpassage von 40 psi statt den gebräuchlichen 50 psi zurückzuführen sind (DE GRAAF et al., 2006; BEILBY et al., 2009).

Literaturübersicht

23

Tabelle 1: Ablammraten nach Besamung mit geschlechtssortierten und unsortierten, kryokonservierten Spermien

Spermatyp

Anzahl Spermien

(x10⁶)

Ablammrate [%]

Anzahl

Tiere Quelle

geschlechtssortiert

X 2 –4 25 48 HOLLINSHEAD et al. (2002)

geschlechtssortiert

Y 2 –4 14,6 48

unsortiert

140 54,2 48

geschlechtssortiert 5 20,0 15 HOLLINSHEAD et al. (2003)

geschlechtssortiert 10 42,9 14

geschlechtssortiert 20 31,3 16

geschlechtssortiert 40 72,7 11

unsortiert 5 46,7 15

unsortiert 10 71,4 14

unsortiert 20 38,5 13

unsortiert 40 66,7 12

unsortiert 100 53,8 13

geschlechtssortiert 1 61,5 52 ^DE GRAAF et al. (2007c)

geschlechtssortiert 5 66,1 56

geschlechtssortiert 15 66,7 57

unsortiert 1 34,5 55

unsortiert 5 39,6 48

unsortiert 15 68,5 54

unsortiert 50 63,2 38

geschlechtssortiert 15 46,1 76 ^DE GRAAF et al. (2007b) kryokonserviert-

wiederholt gefroren 15 36,1 72

unsortiert 50 54,3 70

unsortiert

15 48,6 74

geschlechtssortiert 1 46± 9,4% k.A. BEILBY et al. (2009) geschlechtssortiert 15 43± 9,3% k.A.

unsortiert 1 41± 9,2% k.A.

unsortiert 15 49± 9,4% k.A.

24 3 Material und Methoden

Ziel dieser Arbeit war es, ein Verfahren zur verbesserten Kryokonservierung von geschlechtssortierten und unsortierten Schafspermien in Straws zu entwickeln. Wie aus der genannten Literatur zu entnehmen ist, hängt der Erfolg des Gefrierverfahrens maßgeblich vom Zusammenspiel aller Komponenten ab. Besonders entscheidend sind dabei die Gefrierrate und die Glycerinkonzentration, die in dieser Arbeit näher untersucht wurden. Der experimentelle Teil dieser Arbeit gliedert sich in zwei Versuchsabschnitte:

Versuch 1: Vergleich zweier computergestützter Einfrierkurven zur Kryo- konservierung in Straws mit der Pelletmethode.

Versuch 2: Vergleich des Einflusses unterschiedlicher Glycerinkonzentrationen im Sexcess®-Verdünner auf geschlechtssortierte und unsortierte Spermien.

Material und Methoden

25 3.1 Eingesetzte Ejakulate

3.1.1 Ejakulatgewinnung

Die in diesen Versuchen verwendeten Ejakulate wurden routinemäßig an der Besamungsstation der Klinik für Kleine Klauentiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, sowie der Besamungsstation des Instituts für Nutztiergenetik in Mariensee, im Zeitraum von Dezember 2016 bis Januar 2018 gewonnen.

Zum Einsatz kamen sechs verschiedene Schafböcke im reproduktionsfähigen Alter.

Die Böcke gehörten folgenden Rassen an: ein Dorperschafbock, ein Leineschafbock, ein Texelschafbock und drei Schwarzköpfige Fleischschafböcke. Die Haltungsbedingungen, sowie die Fütterung wurden für sämtliche Böcke identisch gestaltet. Alle Tiere wurden in dem Zeitraum der Ejakulatgewinnung regelmäßig tierärztlich untersucht und waren frei von klinischen Erkrankungen sowie serologisch frei von Brucellose, Border disease, Maedi, Paratuberkulose und Pseudotuberkulose.

Die eingesetzten Schafböcke wurden zweimal wöchentlich mit jeweils zwei Tagen Abstand vormittags abgesamt. Die Samenentnahme erfolgte mit Hilfe einer künstlichen Scheide für kleine Wiederkäuer (Minitüb, Tiefenbach Deutschland) unter Verwendung eines weiblichen Schafs als Sprungpartner. Bevor die künstliche Scheide angeboten wurde, wurde sie mit 45° C warmem Wasser gefüllt. Zur zusätzlichen Stimulation der Böcke wurde Luft in die künstlichen Scheiden hineingepumpt, um das innere Lumen zu verengen. In der Zeit bis zur Verwendung wurden die künstlichen Scheiden zusammen mit dem Auffanggefäß (15 ml Schraubröhre, Sarstedt, Nümstedt, Deutschland) in einem Wärmeschrank (Incubat, MELAG Medizintechnik, Berlin, Deutschland) bei 45° C gelagert. Während des Sprunges wurde das Auffanggefäß mit Hilfe eines Thermoüberzugs vor Abkühlung und UV-Licht geschützt.

26

3.1.2 Untersuchung der frisch gewonnenen Ejakulate

Für die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit kamen nur Ejakulate zum Einsatz, die die klinikeigenen spermatologischen Qualitätsparameter erfüllten. Dabei wurde ein modifiziertes Schema nach WEITZE (2001) angewendet.

Unmittelbar nach der Ejakulatgewinnung erfolgte eine makroskopische Beurteilung des Volumens (ml), der Farbe (grau-weiß bis gelb), der Konsistenz (wässrig bis rahmig), des Geruchs, der Massenbewegung ( - bis +++) und auf mögliche Bei- mengungen. Es wurden nur Ejakulate für die Versuche verwendet, die bei der makroskopischen Untersuchung in der Besamungsstation und bei der anschließenden computerassistierten mikroskopischen Beurteilung (Kapitel 3.2.1) im Labor die in nachfolgender Tabelle aufgeführten Eigenschaften erfüllten:

Tabelle 2: Spermatologische Qualitätsparameter modifiziert nach WEITZE (2001)

Parameter Anforderung

Volumen ≥ 0,5 ml

Farbe Elfenbeinfarben

Konsistenz Rahmig

Geruch Neutral

Massenbewegung +++

Beimengungen Nicht vorhanden

Motilität ≥ 80 %

Material und Methoden

27 3.2 Analyse der Spermien

3.2.1 Motilitätsmessung durch Computer-assisted sperm analysis

Die Motilität der Proben wurde mit Hilfe eines Computer Assisted Sperm Analyser (CASA) IVOS Version 12.0 von Hamilton Thorne Biosciences (Beverly, Ma, USA) bestimmt. Hierbei wurden neben der Gesamt- und Vorwärtsmotilität weitere, das Bewegungsverhalten näher charakterisierende, Parameter erhoben. Letztere umfassen die Parameter Velocity Curve Line (VCL), Velocity Average Path (VAP), Velocity Straight Line (VSL), Amplitude of Lateral Head Displacement (ALH), Beat Cross Frequency (BCF), Straightness (STR) und Linearity (LIN). Die Beschreibung der ergänzenden Parameter erfolgt in Tabelle 20 im Anhang dieser Arbeit.

Um die Messung durchzuführen, wurden die zu analysierenden Spermiensuspensionen zunächst mit Sexcess®-Sample (Masterrind, Verden), der unter gleichen Temperaturbedingungen gelagert wurde, auf eine Dichte von 10 x 10⁶/ml verdünnt und für 10 Minuten auf einem Heizblock (Eigenanfertigung FLI, kombiniert mit Heizplatte HT 200, Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) bei 37° C unter Lichtabschirmung inkubiert.

Um eine aussagekräftige Messung trotz Eidotterpartikel im Sexcess®

Tiefgefriermedium zu gewährleisten, wurde den verdünnten Proben vor der Inkubation 30 µl/ml Fluoreszenzfarbstoff Hoechst 33342 (BisBenzimide H33342, Trihydrochloride, Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Deutschland) von der Hoechst 33342 Stammlösung (5mg Hoechst 33342 in 1 ml Aqua bidest. gelöst, Konzentration:

8,9 mM/ml) zugegeben. Die Spermien für die geschlechtsspezifische Differenzierung wurden bereits mit Hoechst 33342 angefärbt und bedurften daher keiner weiteren Inkubation. Durch den Fluoreszenzfarbstoff, der die DNA in den Spermienköpfen anfärbt, können diese durch die Anregung einer Halogenlichtquelle im CASA System mittels Fluoreszenzmessung dargestellt werden. Durch diesen Vorgang ist es möglich, die angefärbten Spermienköpfe von den Eidotterpartikeln zu unterscheiden und zu analysieren.

28

Nach der zehnminütigen Inkubationsphase wurden 10 µl der Probe in eine Maklerkammer (SEFI Medical Instruments, Haifa, Israel) mit einer Tiefe von 10 µm, die im CASA Gerät zusammen mit dem dazugehörigen Objekttisch bereits auf 37° C vorgeheizt wurde, pipettiert. Um eine repräsentative Beurteilung der Probe zu erhalten wurden jeweils zehn Gesichtsfelder und jeweils 60 Bilder mit insgesamt 200 bis 1000 Zellen ausgewertet. Nach Fokussierung des Objektivs wurde kontrolliert, ob die Zellen in einem geeigneten Maß angefärbt waren. Außerdem wurde nach Aufnahme der zehn Felder sichergestellt, dass alle Spermien erkannt wurden. Zu jeder Probe wurde eine Doppelmessung durchgeführt und diese gemäß laborinterner Richtlinien bei Abweichungen > 10 % wiederholt. Die für die vorliegende Arbeit eingestellten Geräteparameter des CASA-Geräts sind im Anhang (Kapitel 9.3.1) aufgeführt.

3.2.2 Messung der Membranintegrität

Die Bestimmung der Membranintegrität erfolgte durchflusszytometrisch mit einer Fluoreszenzfarbstoffkombination aus dem Cyanin-Farbstoff SYBR® 14 (Mo Bi Tec, Göttingen, Deutschland) und Propidiumiodid (PI) (Mo Bi Tech, Göttingen, Deutschland). Der kombinierte Einsatz beider Farbstoff basiert auf den Arbeiten von GARNER et al. (1994) und CHRISTENSEN et al. (2004). Außerdem wurde die Eignung zur Evaluation der Viabilität von Schafbockspermien von YANIZ et al. (2013) ausführlich beschrieben.

Der SYBR® 14 Farbstoff kann Zellmembranen penetrieren und interkaliert somit in die DNA aller Spermien, unabhängig ihres Membranstatus. Wird die so gefärbte Zelle optisch angeregt, emittiert der Kern Licht mit grünem Bereich.

Propidiumiodid ist hingegen für gesunde Zellen wegen seiner Größe nicht membranpermeabel und gelangt nur in die Zellen, deren Plasmamembran bereits geschädigt ist (KRISHAN, 1975; GARNER et al., 1994). Die Kerne dieser Zellen emittieren bei optischer Anregung Licht im roten Bereich. Bei der kombinierten Anwendung beider Fluoreszenzfarbstoffe wird in Spermien mit geschädigter Membran SYBR® 14 durch PI verdrängt (GARNER et al., 1994).