Seitdem die kryoprotektive Eigenschaft des Glycerins von POLGE et al. (1949) zufällig entdeckt wurde, ist es eine nicht mehr wegzudenkende Verdünnerkomponente in der Tiefgefrierung der meisten Säugetierspermien (PEGG, 2002). Aus früheren Untersuchungen gehen unterschiedliche Empfehlungen bezüglich der Glycerinkonzentrationen für Schafbockspermien hervor. Beispielsweise kommen SALAMON UND MAXWELL (1995a) nach intensiver Literaturauswertung zu dem Schluss, dass eine Konzentration zwischen 6 - 8 % als Optimum für die konventionelle
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Konservierung in Pellets anzusehen ist. Dies widerspricht jedoch anderen Arbeiten, die Konzentrationen von ungefähr 4 - 5 % bevorzugen (EVANS UND MAXWELL, 1987;
FISER UND FAIRFULL, 1989).
Um zu klären, welche Glycerinkonzentration für das verwendete Verdünnersystem in Straws optimale Überlebenschancen für geschlechtssortierte und nicht sortierte Schafbockspermien bereithält, wurde in dieser Arbeit die 6,4 %ige-Verdünnung des Sexcess®-Tiefgefrierverdünners gegen eine 5 %ige und eine 4,5 %ige-Verdünnung getestet.
Im Ergebnis konnte eine klare Überlegenheit der 6,4 %igen-Glycerinkonzentration für die Kryokonservierung von Schafbockspermien in Straws nachgewiesen werden.
Sowohl die Gesamt- als auch die Vorwärtsmotilität der „6,4 %“-Versuchsgruppe wiesen signifikant (p < 0,05) bessere Ergebnisse auf, wenn man sortierte und unsortierte Spermien zusammengefasst betrachtet (Tabelle 17). Auch die Werte der Membranintegrität und der Anteil der morphologisch unveränderten Spermien unterschieden sich erheblich zwischen den Glycerinkonzentrationen zugunsten der 6,4 %igen-Verdünnung. Aufgrund der Einzeltierbewertung lässt die tagesabhängige Schwankung der Ejakulatqualität aber eine statistische Absicherung der Unterschiede bei diesen Parametern nicht zu. Betrachtet man die Ergebnisse einzeln für sortierte und nicht sortierte Spermien konnte ebenfalls ein signifikant höherer Anteil motiler Zellen in der 6,4 %igen-Verdünnung gegenüber der geringeren Konzentration dargestellt werden.
Dieses Fazit deckt sich zwar mit den Untersuchungen von SALAMON UND MAXWELL
(1995a) sowie AHANGARI (1992), widerspricht jedoch allen Studien, die 4 - 5 % Glycerin empfehlen (COLAS, 1975; EVANS UND MAXWELL, 1987; FISER UND FAIRFULL, 1989; DE
GRAAF et al., 2007b; BEILBY et al., 2010). Die Autoren erklären die unterschiedlichen Ergebnisse für den optimalen Glycerinlevel mit dem Zusammenwirken der unterschiedlichen Verdünnerkomponenten, wie dem Gehalt an Eidotter (SAROFF UND
MIXNER, 1955), Citrat (CRAGLE et al., 1955), TRIS-Puffer (SALAMON UND VISSER, 1972) und Zuckermolekülen (UNAL et al., 1978). Daneben konnten FISER UND FAIRFULL (1986)
Diskussion
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zeigen, dass unterschiedliche Einfriergeschwindigkeiten im Gefriervorgang unterschiedliche Glycerinoptima begünstigen. Dabei führte eine flachere Einfrierkurve mit langsamerer Geschwindigkeit zu einem höheren Glycerinbedarf. Ähnliche Beobachtungen zur Interaktion zwischen Glycerin und dem Verlauf der Einfrierkurve konnten auch für Bullenspermien gemacht werden (RODRIGUEZ et al., 1975; MORTIMER et al., 1976).
Ein anderer Faktor, der als Einfluss auf die optimale Glycerinkonzentration diskutiert wird, ist die Spermienkonzentration. Einige Untersuchungen kamen zu dem Ergebnis, dass eine niedrigere Spermienanzahl pro Volumeneinheit auch einen niedrigeren Glyceringehalt benötigt (COLAS, 1975; BEILBY et al., 2010). HARRISON et al. (1982) konnten als mögliche Ursache, des sogenannten „Verdünnungseffektes“ das Entfernen von Schutzfaktoren des Seminalplasmas identifizieren. COLAS (1975) argumentierten, dass eine höhere Anzahl an Glycerinmolekülen pro Spermatozoon für den toxischen Effekt verantwortlich sein könnte.
In ihrem Artikel berichteten BEILBY et al. (2010) davon, wie ein Glyceringehalt von 5 % oder 8 % im Tiefgefrierverdünner bei einer Spermienkonzentration von 80 x 106 Spermien/ml zu einem Unterschied in der Auftaumotilität führte. Sobald die Spermienkonzentration nur 20 x 106 Spermien/ml betrug, war die Motilität jedoch für die höhere Glycerinkonzentration von 8 % um ungefähr das Vierfache geringer als bei 5 % Glyceringehalt im Medium. In der vorliegenden Arbeit wurde eine noch geringere Spermienkonzentration von nur 12 x 106 Spermien/ml verwendet. Jedoch konnte für die geschlechtssortierten als auch für die unsortierten Spermien keine bessere Motilität in einer geringeren Glycerinkonzentration als 6,4 % nachgewiesen werden. Das entspricht auch dem Ergebnis von PONTBRIAND et al. (1989), die keinen Einfluss der Spermienkonzentration auf das Glycerinoptimum feststellen konnten. Eventuell ist in früheren Studien das Fehlen von protektiven Substanzen wie Antioxidantien im Verdünnermedium für den starken Verdünnungseffekt verantwortlich.
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Spermien sind im Verlauf des Sortiervorganges, sowie während dessen Vor- und Nachbereitung multiplen potentiellen Stressfaktoren ausgesetzt. Dazu gehören die große Verdünnung, das Anfärben der DNA, Temperaturveränderungen während des Inkubierens und des Sortierens, sowie die Einwirkung des Lasers und die Zentrifugation (SCHENK et al., 1999). Beispielsweise sind bei Schafbockspermien durch die Passage des Durchflusszytometers kapazitationsähnliche Veränderungen mittels Chlortetracyclinfärbung nachweisbar (HOLLINSHEAD et al., 2003). Im Rahmen jener Studie konnte gezeigt werden, dass sich die sortierten, kapazitationsähnlich veränderten Spermien schneller vom Oviduktepithelzell-Monolayer lösen, als unsortierte Kontrollen. Für andere Tierarten wurde nachgewiesen, dass diese Veränderungen durch die Zugabe von Seminalplasma in gesexten Spermienproben rückgängig gemacht werden können (MAXWELL UND JOHNSON, 1997; MAXWELL UND
JOHNSON, 1999). Daraus ergibt sich eine besondere Bedeutung einer genau abgestimmten Verdünnerzusammensetzung für die Kryokonservierung von geschlechtsdifferenzierten Spermien. In dieser Arbeit konnte kein Unterschied in der optimalen Glycerinkonzentration von geschlechtssortierten und nicht sortierten Spermien festgestellt werden. Dies deckt sich mit den Ergebnisse von PARRILLA et al.
(2012), die ähnliches für Eberspermien feststellen konnten.
Diskussion
69 5.3 Übergreifende Beurteilung
Zur Beurteilung der ermittelten Werte wurden laborinterne Kriterien zur Evaluierung von Besamungsportionen beim Schaf angewandt, die in Anlehnung an RATH et al.
(2009) eine Motilität von ≥ 50 % zum Zeitpunkt Stunde 0 und ≥ 30% nach sechsstündiger Temperaturbelastung bei 37° C voraussetzen. Diese Kriterien konnten in beiden Versuchen von den unsortierten Spermien erfüllt werden. Die geschlechtssortierten Spermien verfehlten die ≥ 50 % Marke zur Stunde 0 Messung mit 49,2 ± 2,9 % knapp. Jedoch zeigten diese nach sechsstündigem Thermoresistenztest mit 42,8 ± 2,7 % einen Wert deutlich über den geforderten 30 % liegenden Wert, was somit eine höhere Langlebigkeit impliziert.
Auch wenn sich exakte Aussagen über das Befruchtungspotential von Spermaproben nur durch Besamungsstudien ermitteln lassen, wurde in zahlreichen Arbeiten gezeigt, dass eine Korrelation zwischen der In-vivo-Fertilität und spermatologischen Qualitätsparametern, die im Labor bestimmt werden können, besteht (NEHRING et al., 2005; CHRISTENSEN et al., 2011). Eine Korrelation konnte beispielsweise für die Gesamtmotilität, Vorwärtsmotilität, Membranintegrität, Morphologie und verschiedene durch CASA-Messung ermittelte Bewegungsparameter wie ALH, LIN, VCL, VSL und VAP nachgewiesen werden (CHRISTENSEN et al., 2011; KATHIRAVAN et al., 2011; JUNG
et al., 2015; ATTIA et al., 2016). Standardisierte In-vitro-Messungen bieten außerdem den Vorteil, Fehlerquellen und anderweitige Einflüsse durch Besamungstechnik und Fertilität der weiblichen Tiere auszuschließen (AMANN UND WABERSKI, 2014).
Gegenwärtig wird der kommerzielle Einsatz der künstlichen Besamung beim Schaf oft durch ein schwieriges Besamungsmanagement, fehlende Zulassung von Hormonen zur Brunstsynchronisation, gesetzliche Regelungen, durch fehlendes Knowhow und die Kosten der Technologie in Relation zum Wert des Tieres limitiert (FOOTE, 2002).
Demgegenüber hemmen zunehmend seuchenhygienische Einschränkungen den grenzüberschreitenden Verkehr von Samenproben, selbst innerhalb der Europäischen Union. Großangelegte, retrospektive Untersuchungen aus der kommerziellen Schafzucht in Australien konnten jedoch Bedenken bezüglich einer zu geringen Trächtigkeitsrate bei kryokonservierten Besamungsportionen widerlegen und
70
bewiesen den Erfolg der künstlichen Besamung beim Schaf unter Beachtung des richtigen Managements (HILL et al., 1998). Auch für die Verwendung geschlechts-sortierter Besamungsportionen ist das Überleben der Spermien während des Gefriervorgangs essentiell. Die Anwendung der Differenzierung nach X- und Y-tragenden Spermatozoen wird aktuell durch die geringe Verfügbarkeit der Sortiertechnik sowie großem Zeit- und Materialaufwand erschwert (RATH UND
JOHNSON, 2008). Die Versuche von DE GRAAF et al. (2007c) zeigten aber, dass akzeptable Trächtigkeitsraten beim Schaf auch mit einer geringen Anzahl von 1x106 geschlechtssortierter Spermien pro Besamung erzielt werden und so die Kosten pro einzelner Besamung deutlich gesenkt werden können.
Für die Zukunft zeichnet sich gegenwärtig die Tendenz ab, dass die Nachfrage nach künstlicher Besamung mit kryokonservierten Schafbockspermien international weiter steigt (MORRELL, 2011; SATHE, 2018). Dies gilt nicht nur für die internationale gewerbliche Schafzucht, in der durch die künstliche Besamung eine Vielzahl von Schafen mit besonders leistungsstarken Böcken besamt werden kann. Vielmehr steigt die Nachfrage auch von privaten Rassezüchtern, für die der internationale Austausch im Vordergrund steht. Durch ihre relativ einfache Haltung und hohen Spermienzahlen pro Ejakulat ist die Erforschung der Kryokonservierung und Embryologie von Schafen darüber hinaus ein wichtiges Modell für die Erhaltungszucht seltener oder bedrohter Spezies, beispielsweise aus den Ordnungen der Artiodactyla und Perissodactyla (PONTBRIAND et al., 1989; LEIBO UND SONGSASEN, 2002).
Auch wenn schon einige Fortschritte in Bezug auf die Kryokonservierung von geschlechtssortierten und unsortierten Schafbockspermien erzielt wurden, ist es unabdingbar die Entwicklung in diesem Bereich weiter voranzutreiben. Gerade im Bereich der Kryokonservierung von geschlechtssortierten Spermien in Straws herrscht weiterer Forschungsbedarf. Außerdem wäre es wünschenswert an der Zusammensetzung der Tiefgefrierverdünner weiterzuarbeiten, um in Zukunft auf tierische Produkte, wie Eidotter und dem damit einhergehenden Kontaminationsrisiko sowie der verbundenen Antibiotikagabe verzichten zu können.
Diskussion
71
Mit dieser Arbeit konnte ein Einfrierprotokoll zur erfolgreichen Kryokonservierung von Schafbockspermien in Straws optimiert werden. Es wurde gezeigt, dass die Kryokonservierung in Straws mit dem Sexcess®-Verdünner durch eine speziell entwickelte, sigmoidale Einfrierkurve der Konfektionierung in Pellets nicht nur hinsichtlich der logistischen, hygienischen und rechtlichen Gegebenheiten, sondern auch in Bezug auf die Spermaqualität nach dem Auftauen überlegen ist. Außerdem konnten verschiedene Glycerinkonzentrationen getestet werden, von denen sich 6,4 % als optimaler Glyceringehalt für die gegebenen Bedingungen in den Straws herausgestellt hat.
72 6 Zusammenfassung
Franziska Karola Kaiser (2019)
Untersuchungen zur Kryokonservierung geschlechtssortierter und unsortierter Schafbockspermien
Die Kryokonservierung von Schafbockspermien gewinnt zunehmend an Bedeutung in der internationalen Schafzucht. Die etablierte Tiefgefriermethodik in Form von Pellets stellt jedoch gemäß geltender europäischer Vorschrift keine für Handel und Transfer zulässige Konfektionierung dar. Eine rechtskonforme Alternative hingegen ist die Verwendung von PVC-Straws. Neben der vorgeschriebenen dauerhaften Kennzeichnung bringen Straws dem Anwender Vorteile durch platzsparende Lagerung, serienmäßige Befüllung und hygienischere Bedingungen.
Um einen vielversprechenden Erfolg der Kryokonservierung von geschlechtssortierten und unsortierten Schafbockspermien in Straws sicherzustellen, wurden in dieser Arbeit zwei Versuchsreihen zur Optimierung eines Tiefgefrierprotokolls mit dem auf TRIS-Puffer basierendem Sexcess®-Verdünnersystems durchgeführt.
In einem ersten Schritt wurden zwei computergesteuerte Einfrierkurven gegen das herkömmliche Gefrieren als Pellet auf einer Trockeneisplatte (-78° C) getestet. Hierbei verzeichnete die erste Einfrierkurve einen linearen Temperaturabfall von -20° C/min.
In Anlehnung an die im Pellet beobachteten Temperaturveränderungen, induzierte das zweite Einfrierprogramm einen sigmoidalen Temperaturverlauf. Letzteres erwies sich eindeutig als vorteilhaft, da für die Qualitätsparameter Gesamtmotilität, Vorwärtsmotilität, Membranintegrität und Anteil morphologisch unveränderter Spermien signifikant (p < 0,05) höhere Werte als mit der linearen Einfrierkurve und der Pelletmethode erzielt werden konnten.
Im zweiten Versuchsteil wurde der Einfluss von drei verschiedenen Glycerinkonzentrationen im Tiefgefrierverdünner auf die spermatologischen Qualitätsparameter während des sechsstündigen Temperaturbelastungstests auf
Zusammenfassung
73
geschlechtssortierte und unsortierte Spermien untersucht. Die niedrigeren Glyceringehalte von 4,5 % und 5 % erzielten in dem Versuch signifikant (p < 0,05) geringere Motilitätswerte im Vergleich zu dem Verdünner mit 6,4 % Glycerin.
Durch die Ergebnisse dieser Arbeit kann man insgesamt darauf schließen, dass die Kryokonservierung von geschlechtssortierten und unsortierten Schafbockspermien in Straws eine mindestens gleichwertige Alternative zur Konfektionierung in Pellets darstellt, die für den internationalen Austausch den gesetzlichen Vorgaben entspricht.
74 7 Summary
Franziska Kaiser (2019)
Investigations on the cryopreservation of sex-sorted and non-sorted ram semen
Cryopreservation of ram semen is gaining in importance for the international sheep breeding community. The well-established method of freezing semen pellets on dry ice does not comply with the European regulations on intra-Community trade and imports of semen of domestic animals. An alternative which is in conformity with the law is the freezing and storage in straws. In this context the ability of permanent marking of individual insemination doses is one of many advantages. Furthermore straws can be stored space-savingly, automatically filled and offer hygienic conditions for the processing of semen.
To achieve successful cryopreservation of sex-sorted and non-sorted ram semen in straws, two experiments were performed to develop and optimize a freezing protocol based on the commercially available Sexcess® dilution medium.
At first two computer controlled freezing rates were tested in contrast to freezing pellets on dry ice (-78° C). The first freezing curve showed a linear decrease of -20° C/min.
Based on the temperature fall that is seen in pellets, the second programmed freezing curve induced a sigmoidal decline of temperature. The latter proved to be significantly (p < 0.05) superior in regards to total motility, progressive motility, membrane integrity and percentage of morphologically intact sperms in comparison to the linear freezing rate and pellet freezing.
In the second experimental setting the influence of three different glycerol concentrations in the freezing extender on the post-thaw quality of sex-sorted and non-sorted semen were investigated during a six hours lasting incubation period. A lower glycerol content of 4.5 % and 5 % achieved significantly (p < 0.05) lower motility values than 6.4 % glycerol in the freezing extender.
Summary
75
Due to the results of this work it can be concluded that cryopreservation of sex-sorted and non-sorted ram semen in straws is at least equivalent to freezing in pellets and is in conformity with the European regulations on trade and import of semen.
76 8 Literaturverzeichnis
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