4.1 Ergebnisse Versuch 1: Vergleich zweier computergestützter Einfrierkurven
4.1.3 Morphologie
Nachfolgend wird der prozentuale Anteil morphologisch unveränderter Spermien (Tabelle 6) und der Anteil kopfkappenveränderter Spermien (Tabelle 7) an der Gesamtpopulation während der drei Messzeitpunkte im Thermoresistenztests dargestellt.
Die Mittelwerte der VG 3 (optimierte Einfrierkurve) zeigten zu allen drei Messpunkten einen signifikant höheren Anteil morphologisch unveränderter Spermien gegenüber der VG 2 (Pelletverfahren) (p < 0,05). Die Messwerte von VG 1 lagen in allen Fällen zwischen denen von VG 2 und VG 3 und unterschieden sich nicht signifikant von diesen. Im zeitlichen Verlauf des Temperaturbelastungstests konnte eine signifikante Abnahme der morphologisch unveränderten Spermien für das Pelletverfahren (VG 2) von Stunde 6 gegenüber Stunde 0 nachgewiesen werden (p < 0,05). In VG 1 und VG 3
48
war die Abnahme des Anteils morphologisch intakter Spermien hingegen weniger deutlich ausgeprägt als in VG 2 und bewegte sich in einem nicht signifikanten Bereich.
Die Ergebnisse der kopfkappenveränderten Spermien unterschieden sich nicht signifikant zwischen den Versuchsgruppen. Jedoch war eine signifikante Zunahme der Kopfkappenveränderungen von Stunde 0 bis 6 unabhängig vom Einfrierverfahren ersichtlich (p < 0,05).
Tabelle 6: Einfluss des Einfrierverfahrens und des Untersuchungszeitpunktes auf den Anteil morphologisch unveränderter Spermien [%] im
Thermo-resistenztest (LSM ± SEM)
Einfrierverfahren 0 h 3 h 6 h
VG 1
-20° C/min 78,1 ± 1,8 ab 72,2 ± 1,8 bc 70,2 ± 1,8 bcd VG 2
Pellet 72,8 ± 1,8 bc 68,2 ± 1,8 cd 63,7 ± 1,8 d VG 3
Optimiert 81,1 ± 1,8 a 77,7 ± 1,8 ab 73,3 ± 1,8 abc
a, b, c, d: LS-Means mit unterschiedlichen Indizes sind signifikant verschieden (Tukey-Kramer-Test, p < 0,05; n = 30)
Tabelle 7: Einfluss des Einfrierverfahrens und des Untersuchungszeitpunktes auf den Anteil der kopfkappenveränderter Spermien [%] im Thermoresistenz-test (LSM ± SEM)
Einfrierverfahren 0 h 3 h 6 h
VG 1
-20° C/min 18,5 ± 1,7 ab 24,0 ± 1,7 bcd 26,5 ± 1,7 cd VG 2
Pellet 22,1 ± 1,7 abc 26,4 ± 1,7 cd 30,7 ± 1,7 d VG 3
Optimiert 15,6 ± 1,7 a 19,4 ± 1,7 abc 23,6 ± 1,7 bcd
a, b, c, d: LS-Means mit unterschiedlichen Indizes sind signifikant verschieden (Tukey-Kramer-Test, p < 0,05; n = 30)
Ergebnisse
49 4.1.4 Einfluss der Einfrierverfahren
Tabelle 8 zeigt die Motilität, Vorwärtsmotilität, Membranintegrität und morphologische Integrität über alle Untersuchungszeitpunkte in Abhängigkeit zum Einfrierverfahren.
Die mit der optimierten Einfrierkurve kryokonservierten Spermien (VG 3) zeigten eine signifikant höhere Gesamt- und Vorwärtsmotilität sowie mehr intakte Membranen und einen größeren Anteil morphologisch unveränderter Spermien (p < 0,05). Hinsichtlich der morphologisch unveränderten Spermien unterschieden sich alle drei Einfrierverfahren signifikant (p < 0,05). Die meisten unveränderten Spermien konnten in VG 3 (optimierte Kurve) nachgewiesen werden, gefolgt von VG 1 (-20 °C/min). Der geringste Anteil wurde in VG 2 (Pelletverfahren) beobachtet (p < 0,05).
Tabelle 8: Einfluss des Einfrierverfahrens auf die spermatologischen Qualitäts-parameter [%] aller Messpunkte im Thermoresistenztest (LSM ± SEM)
Verfahren Gesamt-motilität
Vorwärts-motilität
Membran-integrität
Morphologisch unverändert VG 1
-20° C/min 45,6 ± 0,7 b 44,5 ± 0,7 b 60,8 ± 0,6 b 73,5 ± 1,0 c VG 2
Pellet 46,2 ± 0,7 b 45,3 ± 0,7 b 59,2 ± 0,6 b 68,2 ± 1,0 b VG 3
Optimiert 50,8 ± 0,7 a 49,5 ± 0,7 a 63,5 ± 0,6 a 77,4 ± 1,0 a
a, b, c: LS-Means mit unterschiedlichen Indizes sind innerhalb einer Spalte signifikant verschieden (Tukey-Kramer-Test, p < 0,05; n = 90)
4.1.5 Einfluss der Böcke
Die bockbedingten Unterschiede in der Qualität der Spermaproben zeigten sich bereits in den nativen Proben direkt nach der Ejakulatgewinnung. Bereits hier fiel Bock 2 durch eine geringere Ausgangsqualität auf (Tabelle 9), was sich entsprechend auch nach dem Auftauen zeigte. Während der Probenverarbeitung (dreistündige Äquilibrierungs-phase vor der Tiefgefrierung) erfolgten keine signifikanten Veränderungen hinsichtlich spermatologischer Parameter (Tabelle 10).
50
In Tabelle 11 werden die fünf eingesetzten Böcke hinsichtlich ihres individuellen Einflusses auf Gesamtmotilität, Vorwärtsmotilität, Membranintegrität und Morphologie während des Thermoresistenztests verglichen. Auffällig waren auch hierbei die für alle Merkmale der Spermaqualität signifikant geringeren Werte für Bock 2.
Tabelle 9: Spermatologische Qualitätsparameter (LSM±SEM) der eingesetzten Böcke in den nativen Proben [%]
Böcke Motilität
Vorwärts-motilität
Membran-integrität
Morphologisch unverändert Bock 1 85,9 ± 1,4 ab 84,5 ± 1,4 ab 88,8 ± 1,6 a 88,4 ± 1,7 a Bock 2 79,0 ± 1,4 c 77,8 ± 1,4 c 80,0 ± 1,6 c 81,3 ± 1,7 b Bock 3 89,8 ± 1,4 a 88,8 ± 1,4 a 90,2 ± 1,6 a 91,8 ± 1,7 a Bock 4 86,2 ± 1,4 ab 84,7 ± 1,4 ab 87,8 ± 1,6 ab 89,9 ± 1,7 a Bock 5 82,3 ± 1,4 bc 81,0 ± 1,4 bc 81,7 ± 1,6 bc 89,6 ± 1,7 a
a, b, c: LS-Means mit unterschiedlichen Indizes sind innerhalb einer Spalte signifikant verschieden (Tukey-Kramer-Test, p < 0,05; n = 12)
Tabelle 10: Qualitätsparameter (LSM ± SEM) des Probenmaterials nativ und direkt vor dem Einfrieren, unabhängig vom Verarbeitungsverfahren [%]
Messzeit-punkt Motilität Vorwärts-motilität
Membran-integrität
Morpho-logisch unverändert
Kopfkappen veränderung Nativ 84,3 ± 0,8 a 83,1 ± 0,8 a 85,6 ± 1,0 a 89,6 ± 1,1 a 6,1 ± 1,8 a Vor dem
Einfrieren 84,9 ± 0,8 a 83,6 ± 0,8 a 85,6 ± 1,0 a 86,9 ± 1,1 a 9,1 ± 1,8 a
a, b: LS-Means mit unterschiedlichen Indizes sind innerhalb einer Spalte signifikant verschieden (F-Test, p < 0,05; n = 30)
Ergebnisse
51
Tabelle 11: Spermatologische Qualitätsparameter (LSM ± SEM) der
eingesetzten Böcke im Thermoresistenztest für alle Einfrierverfahren [%]
Böcke Motilität
Vorwärts-motilität
Membran-integrität
Morphologisch unverändert Bock 1 45,7 ± 0,9 b 44,9 ± 0,9 b 64,4 ± 0,8 b 74,7 ± 1,3 ab Bock 2 38,1 ± 0,9 c 35,4 ± 0,9 c 50,4 ± 0,8 c 62,4 ± 1,3 c Bock 3 52,2 ± 0,9 a 51,7 ± 0,9 a 67,3 ± 0,8 a 79,2 ± 1,3 a Bock 4 52,4 ± 0,9 a 51,7 ± 0,9 a 64,8 ± 0,8 a 73,9 ± 1,3 b Bock 5 49,3 ± 0,9 a 49,4 ± 0,9 a 58,9 ± 0,8 a 74,9 ± 1,3 ab
a, b, c: LS-Means mit unterschiedlichen Indizes sind innerhalb einer Spalte signifikant verschieden (Tukey-Kramer-Test, p < 0,05; n = 54)
52
4.2 Versuch 2: Vergleich des Einflusses unterschiedlicher
Glycerin-konzentrationen im Sexcess®-Verdünner auf geschlechtssortierte und unsortierte Spermien
In der Varianzanalyse wurde zu allen drei Zeitpunkten ein signifikanter Bockeffekt auf die Parameter Anteil morphologisch unveränderter Spermien und Anteil kopfkappenveränderter Spermien festgestellt (p < 0,001). Der Vorgang der Geschlechtssortierung erwies sich im Falle der Membranintegrität als signifikanter Einflussfaktor (p < 0,001). Ein Effekt der Glycerinkonzentration wurde hingegen nur für die untersuchten Motilitätsparameter gesichert (p < 0,05). Signifikante Interaktionen traten nicht auf.
Die nachfolgenden Tabellen 12 bis 16 zeigen die LS-Means (LSM ± SEM) der untersuchten Glycerinkonzentrationen im Sexcess®- Verdünnungsmedium (4,5 %, 5 % und 6,4 % Glycerin) für die Parameter Gesamtmotilität, Vorwärtsmotilität, Anteil membranintakter Spermien und Anteil morphologisch unveränderter Spermien. In diesem Zusammenhang wurde der Einfluss der Glycerinkonzentration auf die Konservierung geschlechtssortierter und unsortierter Spermien untersucht. Ergänzend zeigen die Tabellen 17 und 18 den Einfluss des Glyceringehaltes über alle Messpunkte und Tabelle 19 die Ausgangsqualität des Spermas.
4.2.1 Motilität
Tabelle 12 und Tabelle 13 geben die Gesamt- und Vorwärtsmotilität der unsortierten und geschlechtssortierten Spermien in Abhängigkeit der Glycerinkonzentration während des Thermoresistenztests wieder. Auch wenn die Mittelwerte sowohl für die sortierten als auch die unsortierten Spermien auf eine höhere Motilität der „6,4 %“
Gruppe hindeuten, waren die Unterschiede nicht signifikant.
Ergebnisse
53
Tabelle 12: Einfluss der Glycerinkonzentration und der Sortierung auf den Anteil gesamtmotiler Spermien [%] zu unterschiedlichen Zeitpunkten im Thermoresistenztest (LSM ± SEM)
Glycerin-konzentration
0 h 3 h 6 h
Nicht
sortiert Sortiert Nicht
sortiert sortiert Nicht
sortiert Sortiert
a: LS-Means mit unterschiedlichen Indizes sind innerhalb eines Messpunktes signifikant verschieden (Tukey-Kramer-Test, p < 0,05; n = 12)
Tabelle 13: Einfluss der Glycerinkonzentration und der Sortierung auf den Anteil vorwärtsmotiler Spermien [%] zu unterschiedlichen Zeitpunkten im Thermoresistenztest (LSM ± SEM)
Glycerin-konzentration
0 h 3 h 6 h
Nicht
sortiert Sortiert Nicht
sortiert sortiert Nicht
sortiert sortiert
a: LS-Means mit unterschiedlichen Indizes sind innerhalb eines Messpunktes signifikant verschieden (Tukey-Kramer-Test, p < 0,05; n = 12)
54 4.2.2 Membranintegrität
Tabelle 14 zeigt die Membranintegrität der unsortierten und geschlechtssortierten Spermien in Abhängigkeit der Glycerinkonzentration zu unterschiedlichen Messzeitpunkten. Für die Zeitpunkte Stunde 0 und Stunde 3 ließen sich in jeder der drei Glycerinkonzentration signifikante Unterschiede (p < 0,05) zugunsten der unsortierten Spermien erkennen. Nach Stunde 6 war lediglich bei Zusatz von 4,5 % Glycerin eine signifikante Differenz (p < 0,05) zwischen den sortierten und unsortierten Samenzellen zu erkennen. Zwischen den verschiedenen Glycerinkonzentrationen ließ sich hingegen kein signifikanter Unterschied feststellen.
Tabelle 14: Einfluss der Glycerinkonzentration und der Sortierung auf den Anteil membranintakter Spermien [%] zu unterschiedlichen Zeitpunkten im Thermoresistenztest (LSM ± SEM)
Glycerin-konzentration
0 h 3 h 6 h
Nicht
sortiert Sortiert Nicht
sortiert sortiert Nicht
sortiert Sortiert
a, b, c: LS-Means mit unterschiedlichen Indizes sind innerhalb eines Messpunktes signifikant verschieden (Tukey-Kramer-Test, p < 0,05; n = 12)
Ergebnisse
55 4.2.3 Morphologie
Die Tabellen 15 und 16 zeigen zu drei Messzeitpunkten den Anteil morphologisch unveränderter Spermien sowie den Anteil an Kopfkappenveränderungen geschlechtssortierter bzw. unsortierter Samenzellen in Hinblick auf die differierende Glycerinkonzentration. Sowohl zwischen den verschiedenen Glyceringehalten als auch zwischen den beiden Verfahrensweisen sortiert und nicht sortiert ließen sich keine signifikanten Unterschiede feststellen.
Tabelle 15: Einfluss der Glycerinkonzentration und der Sortierung auf den Anteil morphologisch unveränderter Spermien [%] zu unterschiedlichen Zeitpunkten im Thermoresistenztest (LSM ± SEM)
Glycerin-konzentration
0 h 3 h 6 h
Nicht
sortiert Sortiert Nicht
sortiert sortiert Nicht
sortiert Sortiert
a: LS-Means mit unterschiedlichen Indizes sind innerhalb eines Messpunktes signifikant verschieden (Tukey-Kramer-Test, p < 0,05; n = 12)
56
Tabelle 16: Einfluss der Glycerinkonzentration und der Sortierung auf den Anteil Spermien mit Kopfkappenveränderungen [%] zu unterschiedlichen Zeitpunkten im Thermoresistenztest (LSM ± SEM)
Glycerin-konzentration
0 h 3 h 6 h
Nicht
sortiert Sortiert Nicht
sortiert sortiert Nicht
sortiert Sortiert
a: LS-Means mit unterschiedlichen Indizes sind innerhalb eines Messpunktes signifikant verschieden (Tukey-Kramer-Test, p < 0,05; n = 12)
4.2.4 Einfluss der Glycerinkonzentration
In Tabelle 17 werden die Mittelwerte der untersuchten spermatologischen Parameter unabhängig vom Messzeitpunkt im Thermoresistenztest und unabhängig vom Verfahren der Geschlechtssortierung dargestellt.
Eine Glycerinkonzentration von 6,4 % führte im Vergleich zu 4,5 % und 5 % zu einer signifikant erhöhten Gesamtmotilität und Vorwärtsmotilität (p < 0,05). Auch der Anteil membranintakter Spermien war im 6,4 % Glycerin enthaltenden Medium signifikant höher als bei einem Glyceringehalt von 4,5 % (p < 0,05). Bezüglich der Rate morphologisch intakter Spermien sowie des Anteils an kopfkappenveränderter Zellen unterschieden sich die Glycerinkonzentrationen hingegen nicht signifikant.
Ergebnisse
57
Tabelle 17: Einfluss der Glycerinkonzentration auf die spermatologischen Qualitätsparameter [%] aller Messzeitpunkte im Thermoresistenztest (LSM±SEM)
Glycerin-gehalt
Gesamt-motilität
Vorwärts-motilität
Membran-integrität
Morpho-logisch unverändert
Kopfkappen-veränderung
4,5 % 38,8 ± 1,1 b 38,1 ± 1,1 b 49,5 ± 1,2 b 76,0 ± 1,3 a 21,5 ± 1,3 a 5 % 40,8 ± 1,1 b 40,2 ± 1,1 b 51,2 ± 1,2 ab 76,8 ± 1,3 a 21,1 ± 1,3 a 6,4 % 46,7 ± 1,1 a 45,9 ± 1,1 a 53,7 ± 1,2 a 78,7 ± 1,3 a 19,4 ± 1,3 a
a, b: LS-Means mit unterschiedlichen Indizes sind innerhalb einer Spalte signifikant verschieden (Tukey-Kramer-Test, p < 0,05; n = 72)
4.2.5 Einfluss der Geschlechtssortierung und Glycerinkonzentration
In Tabelle 18 wird der Einfluss der Glycerinkonzentration und der Geschlechts-sortierung auf die gemessenen Werte des Thermoresistenztests über alle Zeitpunkte betrachtet. In diesem Zusammenhang unterschied sich die Gesamtmotilität der nicht sortierten Spermien in der Versuchsgruppe mit 6,4 % Glyceringehalt von den Gruppen mit 4,5 % und 5 % Glycerin. Bei den sortierten Samenzellen gab es einen signifikanten Unterschied zwischen 4,5 % und 6,4 % (p < 0,05). Dieser Unterschied wurde auch für die Vorwärtsmotilität abgesichert. Bezüglich der Membranintegrität und der Kopfkappenveränderung konnte hingegen unabhängig vom Verfahren der Geschlechtssortierung kein signifikanter Einfluss der Glycerinkonzentration festgestellt werden (Tabelle 19).
58
parameter [%] aller Messpunkte im Thermoresistenztest (LSM ± SEM)
Sortierung Glyceringehalt Gesamtmotilität Vorwärts-motilität
Membran-integrität
Morphologisch unverändert
Kopfkappen-veränderung
Sortiert
4,5 % 37,8 ± 1,6 c 37,4 ± 1,5 c 41,8 ± 1,7 b 77,6 ± 1,8 a 20,6 ± 1,8 a 5 % 40,3 ± 1,6 bc 39,9 ± 1,5 bc 44,4 ± 1,7 b 77,6 ± 1,8 a 20,9 ± 1,8 a 6,4 % 45,7 ± 1,6 ab 45,3 ± 1,5 ab 46,9 ± 1,7 b 79,4 ± 1,8 a 19,2 ± 1,8 a
Nicht sortiert
4,5 % 39,7 ± 1,6 bc 38,8 ± 1,5 c 57,3 ± 1,7 a 74,4 ± 1,8 a 22,4 ± 1,8 a 5 % 41,3 ± 1,6 b c 40,5 ± 1,5 abc 57,9 ± 1,7 a 75,9 ± 1,8 a 21,3 ± 1,8 a 6,4 % 47,6 ± 1,6 a 46,6 ± 1,5 a 60,6 ± 1,7 a 78,1 ± 1,8 a 19,7 ± 1,8 a
a, b, c: LS-Means mit unterschiedlichen Indizes sind innerhalb einer Spalte signifikant verschieden (Tukey-Kramer-Test, p < 0,05, n = 36)
Ergebnisse
59
4.2.6 Ausgangsqualität der Spermienproben vor der Kryokonservierung
Tabelle 19 charakterisiert die Spermaqualität zu verschiedenen Messzeitpunkten im Vorfeld der Kryokonservierung. Die deskriptive Analyse lässt hierbei auf eine vorübergehende Motilitätszunahme nach der Sortierung hindeuten. In Folge der dreistündigen Äquilibrierungsphase gleichen sich die Motilitätsparameter jedoch ihrem Ausgangswert an. Dieselben Tendenzen zeichnen sich auch im Falle der übrigen Parameter ab. Darüber hinaus ergeben sich Hinweise auf eine Zunahme kopfkappenveränderter Spermien während des Sortierprozesses. Wie bereits in Kapitel 4.1.5 beschrieben, zeigten die unsortierten Proben keine relevanten spermatologischen Veränderungen während der Probenverarbeitung (dreistündige Äquilibrierung).
60 konservierung (x̅ ± SEM)
Messzeitpunkt Gesamtmotilität Vorwärtsmotilität Membran-integrität
Morphologisch unverändert
Kopfkappen-veränderungen
Nativ 80,0 ± 1,9 78,6 ± 1,9 83,6 ± 1,2 93,8 ± 0,8 3,2 ± 0,6
Nach Inkubation 83,3 ± 2,5 81,8 ± 2,3 77,0 ± 2,4 92,4 ± 1,1 3,5 ± 1,1 Nach Sortierung 86,1 ± 2,8 85,0 ± 2,7 86,0 ± 2,6 93,5 ± 1,4 4,3 ± 1,3
Sortiert nach
Abkühlung 79,1 ± 4,6 78,2 ± 4,5 78,6 ± 3,4 87,4 ± 3,4 11,1 ± 3,4
Nicht sortiert
nach Abkühlung 80,3 ± 2,1 78,9 ± 2,0 82,8 ± 2,1 90,6 ± 1,4 6,9 ± 1,5
Means ± SEM, n = 12
Diskussion
61 5 Diskussion
Die erfolgreiche Kryokonservierung von Schafbockspermien in Straws ist Grundlage für eine leistungsorientierte Schafzucht. Durch sie wird ein weiträumiger Austausch und rechtskonformer Handel mit genetischem Material ermöglicht. Ebenso wird das Risiko von venerischen Infektionen minimiert und durch Zuchtprogramme seltene Rassen erhalten und Inzucht vorgebeugt (THIBIER UND GUERIN, 2000). Das Tiefgefrieren von Spermien ist außerdem Voraussetzung für das Anlegen einer Genreserve zum Erhalt einer breiten genetischen Vielfalt.
Um dies alles zu gewährleisten ist es essentiell, eine Alternative zu den bisher hauptsächlich eingesetzten Pellets zu finden, denn selbst in aktuellen Untersuchungen wird noch immer auf die Kryokonservierung in Pellets, wie sie von EVANS UND MAXWELL
(1987) beschrieben wurde, zurückgegriffen (DE GRAAF et al., 2007b; DE GRAAF et al., 2007c; BEILBY et al., 2009). Dabei wird eine platzintensive Lagerung, potentielle mikrobiologische Kontamination und potentielles Abschwämmen von Spermien auf der Trockeneisplatte bzw. im flüssigen Stickstoff auf andere Pellets in Kauf genommen. Wichtiges Argument gegen die Konfektionierung als Pellets ist die nicht umsetzbare permanente Kennzeichnung der einzelnen Besamungsportionen, wie sie gemäß § 6 SAMENV (2008) für die Verwendung innerhalb der Europäischen Union verpflichtend vorgeschrieben ist. Weiterhin ist die Kryokonservierung von Besamungsportionen Voraussetzung, um den Einsatz geschlechtssortierter Spermien zu ermöglichen. Die technischen Einrichtungen zur Geschlechtsdifferenzierung der Spermien sind meistens fern der späteren Einsatzorte lokalisiert und müssen für Transport und zeitlich genau terminierte Besamung tiefgefroren werden. Die Kryokonservierung geschlechtssortierter Spermien stellt eine besondere Herausforderung dar, da der durchflusszytometrisch durchgeführte Sortierungsvorgang ein zusätzlicher Stressor für die Spermien darstellt (SUAREZ, 2007;
RATH UND JOHNSON, 2008).
62
Zielsetzung dieser Arbeit war daher die Optimierung eines Kryokonservierungsverfahrens für Schafbockspermien, welches speziell auf die Konfektionierung in Straws abgestimmt ist und sowohl für geschlechtssortierte als auch unsortierte Spermien den Erfolg der Besamung sichert.
Um diese Zielsetzung zu verfolgen wurden zwei Versuchsreihen zur Adaption eines Kryokonservierungsprotokolls mit Schafbockspermien durchgeführt. Für diese Versuche wurde das kommerziell erhältliche und auf TRIS-Puffer basierende Sexcess®-Verdünnersystem angewandt. Dieser Verdünner hat sich bereits für den Einsatz mit Bullenspermien bewährt (KLINC, 2005; MÖNCH-TEGEDER, 2011). Die Modifikation des Einfrierprotokolls erfolgte in der ersten Versuchsreihe durch die Verwendung von drei verschiedenen Einfrierverfahren nachdem die dreistündige Äquilibrierungsphase abgeschlossen war. Dazu wurde ein Teil der Probe mittels Pelletmethode (Kapitel 3.5.2) und zwei Teile durch unterschiedliche Temperaturverläufe in 0,25 ml PVC-Straws kryokonserviert (Kapitel 3.5.1.1).
Nachdem im ersten Versuchsteil eine optimierte Einfrierkurve getestet wurde, konnten im zweiten Teil der Fokus auf unterschiedliche Glycerinkonzentrationen gelegt werden.
Dazu wurden sortierte und unsortierte Spermaproben mit einem Tiefgefrierverdünner versetzt, der jeweils eine von drei verschiedenen Glycerinkonzentrationen aufwies. Als Untersuchungsparameter dienten dabei die Motilität, die Membranintegrität und die Morphologie der Spermien. Die Spermien wurden nach dem Auftauen in einem sechsstündigen Thermoresistenztest evaluiert.
5.1 Diskussion zu Versuch 1
In zahlreichen Studien wurde die Kryokonservierung von Schafspermien durch die Pelletmethode genau beschrieben und etabliert (MAXWELL et al., 1980; HILL et al., 1998; AWAD UND GRAHAM, 2004). MAXWELL et al. (1995) fokussierten sich in ihrer Arbeit auf den Einfluss der Konfektionierung auf die Fertilitätsparameter der Spermien und konnten in vitro und in vivo eine deutliche Überlegenheit der pelletierten gegenüber den Besamungsportionen in Pailletten nachweisen. Im Gegensatz dazu konnten
Diskussion
63
PONTBRIAND et al. (1989) ähnlich wie in der vorliegenden Arbeit eine größere Motilität durch die Straw-Konservierung als durch die Pelletkonfektionierung erzielen. Die bisher akzeptablen Ergebnisse in Pellets könnten darauf zurückzuführen sein, dass der von LIGHTFOOT UND SALAMON (1969) beschriebene, sigmoidale Temperaturabfall im sphäroiden Pellet mit einer langsamen initialen Abkühlungsphase bis -5° C und einer anschließenden rapiden Abkühlung, den kryobiologischen Bedürfnissen der Schafspermien am besten angepasst ist und den kryobiologischen Vorgang der Dehydration der Zellen am besten zulässt.
Die hier getestete, optimierte Einfrierkurve zeichnet sich ebenfalls durch eine langsame initiale Abkühlungsphase aus, in der die Probe innerhalb von 4,3 min mit einem Temperaturabfall von -3° C pro min auf -8° C abgekühlt wird. Nach einer einminütigen Plateauphase fällt die Temperatur anschließend mit 50,15° C/min bis -140° C erreicht sind. Durch die Phase der schnellen Abkühlung konnte der kritische Temperaturbereich zwischen -15° C bis -60° C (SALAMON UND MAXWELL, 1995a) rasch durchschritten und Kryoschäden minimiert werden. Diese optimierte Einfrierkurve konnte im Versuch bezüglich Gesamtmotilität, Vorwärtsmotilität, Membranintegrität und dem Anteil morphologisch unveränderter Spermien signifikant (p < 0,05) bessere Werte erzielen als die Proben die mit der Pelletmethode oder der -20° C/min Methode tiefgefroren wurden.
Ein linearer Temperaturabfall von -20° C/min wird von den meisten Autoren als ideale Abkühlungsrate vorgeschlagen (FISER UND FAIRFULL, 1984; DONOVAN et al., 2001; BAG
et al., 2002). Jedoch zeigte die optimierte Einfrierkurve sich auch gegenüber der linearen Einfrierrate von -20° C/min und der Kryokonservierung als Pellet auf Trockeneis hinsichtlich Gesamtmotilität, Vorwärtsmotilität, Membranintegrität und dem Anteil morphologisch unveränderter Spermien als signifikant überlegen (p < 0,05).
Als eine mögliche Begründung für eine höhere Motilität von Spermien aus Straws im Gegensatz zu den pelletierten Proben nannten PONTBRIAND et al. (1989) die ungeordneten Einfriervorgänge mit unterschiedlichen Kristallisationsherden im Pellet.
Dagegen gewährleistet das große Verhältnis von Oberfläche zu Volumen in den gut
64
wärmeleitenden 0,25 ml Pailletten eine rasche und gleichmäßige Abkühlung (WATSON
UND MARTIN, 1975) und somit auch eine gute Steuerbarkeit des Einfrierprozesses.
Dass die spermatologischen Messparameter für die Pellet-Versuchsgruppe schlechter als für die anderen beiden Versuchsgruppen ausgefallen ist, kann darauf zurückgeführt werden, dass die gewählte Glycerinkonzentration von 6,4 % im Sexcess®-Medium zwar für die Spermien in Straws einen optimierten Schutz bot, bei Verwendung der Pelletmethode jedoch eine geringere Konzentration des Kryoprotektivums von ca. 4 - 5 % besser geeignet wäre (COLAS, 1975; AHANGARI, 1992; SALAMON UND MAXWELL, 2000).
Ein Teil der immotilen Spermatozoen erliegen wahrscheinlich ultrastrukturellen Schäden und biochemischen Veränderungen (QUINN et al., 1969; NATH UND PATT, 1970; NATH, 1972). Besonders die für die Motilität essentiellen Fibrillen und Mitochondrien erscheinen empfindlich gegenüber Schäden durch den Gefriervorgang, wie NATH (1972) für Schafspermien nachweisen konnte. Mittels elektronenmikroskopischer Untersuchung konnte KUNZE (1976) außerdem eine Schädigung der Akrosomenfeinstruktur nachweisen, die negativ mit der Befruchtungsfähigkeit korreliert.
In dieser Arbeit konnte für einen der fünf Böcke aus Versuch 1 eine signifikant geringere Motilität, Membranintegrität und ein geringerer Anteil morphologisch unveränderter Spermien während des sechsstündigen Temperaturbelastungstest nachgewiesen werden. Diese bockbedingten Unterschiede in der Überlebensrate der Spermien nach dem Einfrier- und Auftauprozess decken sich mit Berichten über andere Tierarten, dass unterschiedliche Individuen innerhalb einer Spezies Spermien mit unterschiedlicher Eignung zur Kryokonservierung aufweisen (LEIBO UND
SONGSASEN, 2002; THURSTON et al., 2002). Dieses Phänomen wurde bisher besonders ausführlich für Pferde beschrieben (JASKO et al., 1991; AURICH et al., 1996; BUSS, 2005). Aber auch über Bullen (BEATTY et al., 1976; THOMAS et al., 1997), Eber (THURSTON et al., 2001; MARQUES et al., 2017), Mäusen (SONGSASEN UND LEIBO, 1997) und weitere Säugetierspezies existieren ähnliche Berichte (LEIBO UND SONGSASEN, 2002).
Diskussion
65
Untersuchungen zur Heritabilität legten eine erbliche Komponente in der Eignung verschiedener männlicher Individuen für die Kryokonservierung der Spermien nahe (SONGSASEN UND LEIBO, 1997; THURSTON et al., 2002). HOLT UND NORTH (1991) vermuteten eine Korrelation zwischen der individuellen Resistenz gegenüber Kryoschäden und der unterschiedlichen Interaktion von Proteinen des Zytoskeletts mit Membranlipiden, wie sie für Schafböcke beschrieben wurde (DE LAS HERAS et al., 1997). Ein genetischer Einfluss auf die Expression von Enzymen innerhalb der Spermienmembran, wie Hexokinase-I und Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, die deren Membranmetabolismus direkt beeinflussen, wurde von KLEENE (2001) nachgewiesen.
Im vorliegenden Fall zeigte der Bock in der Ausgangsqualität des Ejakulats nur eine geringe Beeinträchtigung und wäre vermutlich in der Herde nicht durch verminderte Fertilität aufgefallen. Jedoch zeigte sich eine deutliche Reduktion der Qualität nach dem Auftauen und damit auch der Chancen für einen potentiellen erfolgreichen Einsatz für instrumentelle Samenübertragung. Ein Faktor, der wahrscheinlich die geringere Erfolgsrate der künstlichen Besamung bei Schafen im Kontrast zu Rindern beeinflusst, könnte eine Selektion auf Spermaqualität und Eignung zur Kryokonservierung bei den Rindern sein. Zuchtbullen werden deutlich stärker in Bezug auf ihre Spermaqualität untersucht (SAACKE, 2008) und aus kommerziellem Interesse auch auf diese selektiert (GLIOZZI et al., 2017).
5.2 Diskussion zu Versuch 2
Seitdem die kryoprotektive Eigenschaft des Glycerins von POLGE et al. (1949) zufällig entdeckt wurde, ist es eine nicht mehr wegzudenkende Verdünnerkomponente in der Tiefgefrierung der meisten Säugetierspermien (PEGG, 2002). Aus früheren Untersuchungen gehen unterschiedliche Empfehlungen bezüglich der Glycerinkonzentrationen für Schafbockspermien hervor. Beispielsweise kommen SALAMON UND MAXWELL (1995a) nach intensiver Literaturauswertung zu dem Schluss, dass eine Konzentration zwischen 6 - 8 % als Optimum für die konventionelle
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Konservierung in Pellets anzusehen ist. Dies widerspricht jedoch anderen Arbeiten, die Konzentrationen von ungefähr 4 - 5 % bevorzugen (EVANS UND MAXWELL, 1987;
FISER UND FAIRFULL, 1989).
Um zu klären, welche Glycerinkonzentration für das verwendete Verdünnersystem in Straws optimale Überlebenschancen für geschlechtssortierte und nicht sortierte Schafbockspermien bereithält, wurde in dieser Arbeit die 6,4 %ige-Verdünnung des Sexcess®-Tiefgefrierverdünners gegen eine 5 %ige und eine 4,5 %ige-Verdünnung getestet.
Im Ergebnis konnte eine klare Überlegenheit der 6,4 %igen-Glycerinkonzentration für die Kryokonservierung von Schafbockspermien in Straws nachgewiesen werden.
Sowohl die Gesamt- als auch die Vorwärtsmotilität der „6,4 %“-Versuchsgruppe wiesen signifikant (p < 0,05) bessere Ergebnisse auf, wenn man sortierte und unsortierte Spermien zusammengefasst betrachtet (Tabelle 17). Auch die Werte der Membranintegrität und der Anteil der morphologisch unveränderten Spermien unterschieden sich erheblich zwischen den Glycerinkonzentrationen zugunsten der 6,4 %igen-Verdünnung. Aufgrund der Einzeltierbewertung lässt die tagesabhängige Schwankung der Ejakulatqualität aber eine statistische Absicherung der Unterschiede bei diesen Parametern nicht zu. Betrachtet man die Ergebnisse einzeln für sortierte und nicht sortierte Spermien konnte ebenfalls ein signifikant höherer Anteil motiler Zellen in der 6,4 %igen-Verdünnung gegenüber der geringeren Konzentration dargestellt werden.
Dieses Fazit deckt sich zwar mit den Untersuchungen von SALAMON UND MAXWELL
(1995a) sowie AHANGARI (1992), widerspricht jedoch allen Studien, die 4 - 5 % Glycerin empfehlen (COLAS, 1975; EVANS UND MAXWELL, 1987; FISER UND FAIRFULL, 1989; DE
GRAAF et al., 2007b; BEILBY et al., 2010). Die Autoren erklären die unterschiedlichen Ergebnisse für den optimalen Glycerinlevel mit dem Zusammenwirken der unterschiedlichen Verdünnerkomponenten, wie dem Gehalt an Eidotter (SAROFF UND
MIXNER, 1955), Citrat (CRAGLE et al., 1955), TRIS-Puffer (SALAMON UND VISSER, 1972) und Zuckermolekülen (UNAL et al., 1978). Daneben konnten FISER UND FAIRFULL (1986)
Diskussion
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zeigen, dass unterschiedliche Einfriergeschwindigkeiten im Gefriervorgang unterschiedliche Glycerinoptima begünstigen. Dabei führte eine flachere Einfrierkurve mit langsamerer Geschwindigkeit zu einem höheren Glycerinbedarf. Ähnliche Beobachtungen zur Interaktion zwischen Glycerin und dem Verlauf der Einfrierkurve konnten auch für Bullenspermien gemacht werden (RODRIGUEZ et al., 1975; MORTIMER et al., 1976).
Ein anderer Faktor, der als Einfluss auf die optimale Glycerinkonzentration diskutiert wird, ist die Spermienkonzentration. Einige Untersuchungen kamen zu dem Ergebnis,
Ein anderer Faktor, der als Einfluss auf die optimale Glycerinkonzentration diskutiert wird, ist die Spermienkonzentration. Einige Untersuchungen kamen zu dem Ergebnis,