Kryokonservierung von Schafbockspermien in PVC-Straws

2.3 Kryokonservierung von Schafspermien

2.3.2 Kryokonservierung von Schafbockspermien in PVC-Straws

Straws lassen sich im Gegensatz zu Spermienpellets problemlos mit kommerziell erhältlichen Druckern permanent kennzeichnen und platz- und kostensparend in LN2

lagern. Um die Konservierung in Straws weiterzuentwickeln und zu optimieren sind viele Untersuchungen vorgenommen worden (FISER et al., 1986; MAXWELL et al., 1995;

POGORZELSKI, 2005; REKHA et al., 2016).

Dabei wurde untersucht, welcher Temperaturverlauf hohe Auftaumotilitäten von Schafbockspermien in Straws garantiert. Dafür hatten FISER UND FAIRFULL (1984) in ihren Experimenten verschiedene lineare Abkühlraten für diverse Glycerinkonzentrationen untersucht. Da der für die vorliegende Arbeit benutzte Sexcess®-Verdünner eine Glycerinkonzentration von 6,4 % aufweist, müsste der obengenannten Literatur zufolge ein linearer Temperaturabfall von ca. -20° C/min die bestmögliche Überlebenschance für Spermien in Straws bieten. Auch in anderen Quellen wurde -20° C/min als Abkühlrate der Wahl für computergesteuerte Einfrierverfahren in PVC-Straws angeführt (P^ONTBRIAND et al., 1989; D^ONOVAN et al., 2001).

Gleichzeitig liegen aber auch Experimente vor, die keine signifikanten Differenzen in der Erfolgsquote von Besamungen mit auf Trockeneis gefrorenen Pellets und Straws, die bei -20° C min^-1 konserviert wurden, nachweisen (FISER et al., 1987; PONTBRIAND

et al., 1989).

Für das Auftauen der Straws empfehlen die meisten Autoren, diese direkt von -196° C im LN2 in ein 38 - 42° C warmes Wasserbad zu überführen (SALAMON UND MAXWELL,

Literaturübersicht

1995a). Nach ca. 30 Sekunden hat die Besamungsportion die Wasserbadtemperatur angenommen und kann versamt bzw. spermatologisch untersucht werden (FISER UND

FAIRFULL, 1984).

18 2.4 Geschlechtsdifferenzierung

Bisher wurden verschiedene Methoden zur präkonzeptionellen Geschlechts-determination getestet. Mit Ausnahme der durchflusszytometrischen Spermiensortierung erzielte jedoch keine der untersuchten Methoden verlässliche Ergebnisse und ließen sich nicht etablieren (R^ATH et al., 2009). Unter anderem erwiesen sich Verfahren, X- und Y-Chromosom-tragende Spermien durch Bestimmung ihres Dichteunterschiedes von 0,0007 g/cm³ mittels Dichtezentrifugation oder durch spezielle Gelelektrophorese zu trennen, als nicht geeignet (JAFAR UND

FLINT, 1996). Auch der Versuch monoklonale Antikörper gegen das Histokompatibilität-Y-Antigen einzusetzen, zeigte sich als zu ungenau (HOPPE UND KOO, 1984).

Das einzige Sortierverfahren, welches als zuverlässig einzustufen ist und bereits kommerziell genutzt wird, ist die durchflusszytometrische Sortierung, dessen Prinzip auf der Bestimmung des relativen Unterschiedes im DNA-Gehalts der X- bzw Y-Chromosomen-tragenden Spermien beruht und durch eine individuelle Bestimmung und Sortierung jedes Spermiums erfolgt (MAXWELL et al., 2004; RATH et al., 2009).

2.4.1 Prinzip der durchflusszytometrischen Spermiensortierung

Die Voraussetzung, welche die durchflusszytometrische Geschlechtsdifferenzierung ermöglicht, ist der unterschiedliche chromosomale DNA-Gehalt durch das X- oder Y-Chromosom. Der DNA-Gehalt der X- bzw. Y-chromosomalen Spermien unterscheidet sich deutlich. Allerdings wird zur Erkennung nicht der absolute, sondern der relative Unterschied gemessen, der sich auf den Gesamt-DNA-Gehalt im Spermienkopf bezieht (J^OHNSON et al., 1989). Die Differenz im DNA-Gehalt ist speziesabhängig und beträgt beim Schafbock 4,2 %. Damit liegt diese Differenz leicht über den Werten der anderer Nutztiersäugern und dem des Menschen (Bulle 3,8 %, Eber 3,6 %, Hengst 3,7 %, Rüde 3,9 %, Mann 2,8 %) (GARNER, 2006).

Anfängliche Versuche fanden mit fixierten Chinchillaspermien statt, da diese durch einen Unterschied von 7,5 % in ihrem DNA-Gehalt gut in zwei Populationen aufzuteilen waren (JOHNSON et al., 1987b). Allerdings wurden die Spermien in diesen ersten

Literaturübersicht

Untersuchungen so stark geschädigt, dass ihre Fertilität verloren ging. Durch weitere Optimierungen konnten 1989 die ersten lebenden Nachkommen durchflusszytometrisch bestimmten Geschlechts von Kaninchen von J^OHNSON et al.

(1989) vermeldet werden. Seitdem fand die Beltsville Sperm Sexing Technologie (BSST) (J^OHNSON et al., 1999) Einzug in das Repertoire der Reproduktionstechnik für eine zunehmende Zahl an Säugetierarten. Die kommerzielle Anwendung konnte sich bisher jedoch nur beim Rind in größerem Umfang etablieren (RATH UND JOHNSON, 2008; RATH et al., 2013).

Eine entscheidende Grundlage für das durchflusszytometrische Trennen der Spermatozoa ist das Kenntlichmachen der DNA mithilfe eines geeigneten Farbstoffs.

Diese Substanz muss die Fähigkeit besitzen die Zellmembran lebender Zellen zu passieren, um die stark kondensierte DNA anfärben zu können. Des Weiteren sollte sie keinen negativen Einfluss auf die Fertilität und Vitalität der Spermien oder die Strömungseigenschaften der Spermiensuspension im Zytometer wie auch im Uterus haben. Die wichtige Entdeckung, dass der membranpermeable Fluoreszenzfarbstoff Bisbenzimide (Hoechst 33342) diesen Eigenschaften gerecht wird, leitete die Sortierung fertiler Spermien ein (JOHNSON et al., 1987a). Bei dem synthetischen Farbstoff Hoechst 33342 handelt es sich um einen nicht-interkalierenden Liganden der DNA, der bevorzugt an die Adenin-Thymin-Regionen helikaler DNA bindet (M^ULLER

UND G^AUTIER, 1975).

Durch die abgeplattete Form der Säugetierspermien unterscheidet sich die Quantität des Lichts, welches von den angefärbten Zellen emittiert wird in Abhängigkeit von der Position, in der die paddelförmigen Spermienköpfe zur Lichtquelle hin ausgerichtet sind. Bereits geringe Rotationen aus der vorgesehenen Achse können die geringe Differenz des DNA-Gehalts von 3 bis ca. 5 % kaschieren. Daher ist es notwendig, die Zellen in einer orthogonalen Position zur Strahlungsquelle auszurichten (DEAN et al., 1978). Dieses wird durch hydrodynamische Fokussierung eines Hüllstroms und Injektion des Probenstroms in einem speziell entwickelten Düsensystem erreicht (JOHNSON UND PINKEL, 1986). Die ausgerichteten Spermien passieren dabei im kontinuierlichen Hüllstrom einen UV-Laser, der den Farbstoff anregt. Das vom

Gesamt-DNA-Gehalt der Samenzelle abhängige Fluoreszenzsignal wird von der flachen Spermienkopfseite emittiert und vorwärtsgerichtet von einem Photomultiplier (PMT 0°) aufgefangen und in elektrische Signale umgesetzt. Zusätzlich geben die Spermien über die schmale Kante des Kopfes ein weiteres Lichtsignal ab, das DNA unabhängig ist und durch Lichtbrechung der Spermienkopfkante in dem umgebenden Flüssigmedium entsteht. Dieses Signal wird in einem zweiten PMT aufgefangen, die 90° versetzt zum Laserstrahl positioniert ist. Zweck dieses Signals ist es, die Position der Samenzelle relativ zum Laserstrahl zu bestimmen und nur maximal orientierte Spermien in den Sortierprozess aufzunehmen (JOHNSON et al., 1987a). Kurz hinter dem „point of interest“, an dem der Laser auf den Flüssigkeitsstrom trifft, beginnt der Flüssigkeitsstrom von der kontinuierlichen in eine diskontinuierliche Form über zu gehen und Tropfen zu bilden, die sich vom Flüssigkeitsstrom trennen. Dieses wird durch die Schwingungen eines Piezokristalls erreicht, der im Kopf des Düsensystems montiert ist. Jedes sich ablösende Tröpfchen sollte max. eine Samenzelle enthalten, deren DNA-Gehalt zuvor über die PMT Signale bestimmt wurde. Zusätzlich wird in dem Moment, in dem ein Tröpfchen sich vom Flüssigkeitsstrom abschnürt, eine elektrische Ladung auf den Flüssigkeitsstrom gegeben, die der separierte Tropfen dann mitnimmt und die entsprechend des DNA-Gehaltes positiv oder negativ ist. Die geladenen Tropfen passieren dann in freiem Flug ein elektrostatisches Feld und werden entsprechend ihrer Ladung nach rechts oder links abgelenkt (JOHNSON et al., 1987b).

Die Anzahl der auf diese Weise differenzierten Spermien wird von M^AXWELL et al.

(2004) als 15 x 10⁶ pro Stunde angegeben. GARNER (2006) gibt für die Leistung der kommerziell eingesetzten Geräte für das Geschlechtssortieren von Bullenspermien sogar Raten von bis zu 20 x 10⁶ geschlechtssortierten Spermien je X- und Y-Chromosom an.

Literaturübersicht

2.4.2 Einsatz geschlechtssortierter Spermien beim Schaf

Der erste Bericht über die Geburt eines Schaflammes aus durchflusszytometrisch differenzierten Spermien stammt von C^ATT et al. (1996). Aus 251 Eizellen, die mittels intrazytoplasmatischer Spermieninjektion (ICSI) durch geschlechtsdifferenzierte Spermien befruchtet wurden, konnten die Forscher in genannten Versuchen jedoch nur ein Lamm vermelden. Seitdem haben die Bemühungen verschiedener Arbeitsgruppen dazu geführt, dass mit dem Einsatz geschlechtssortierte Spermien über künstliche Besamungen bei Schafen passable Ergebnisse erzielt werden können (MAXWELL et al., 2004; RATH UND JOHNSON, 2008; DE GRAAF et al., 2009). Wie auch für andere Tierspezies wurde für Schafbockspermien festgestellt, dass die Eignung für das Geschlechtssortieren tierindividuell variiert (HOLLINSHEAD et al., 2002; GARNER, 2006).

Für die Entwicklung von Schafembryonen aus geschlechtssortierten und unsortierten Spermien wurden in verschiedenen Experimenten keine signifikanten Unterschiede in der Fertilität festgestellt (MORTON et al., 2005; DE GRAAF et al., 2007a; BEILBY et al., 2010). Einzig eine verzögerte Furchung wird in manchen Studien für die Spermien genannt, die einen Sortierungsprozess durchlaufen haben (MORTON et al., 2006).

MORTON et al. (2006) berichteten in dem Zusammenhang von Furchungsraten 24hpi von 37,4 % für gesexte Spermien und 55,6 % für unsortierte Spermien. Jedoch zeigte die Blastozystenbildung am siebten Tag 56,7 % für die unsortierten und 58,2 % für die geschlechtsdifferenzierten Spermien und somit keinen signifikanten Unterschied.

H^OLLINSHEAD et al. (2004) beschäftigten sich in ihren Versuchen mit Schafspermien, die sowohl vor dem Sortiervorgang als auch im Anschluss kryokonserviert wurden. Mit dieser Methode ließen sich eingelagertes Sperma oder solches von weit entfernt gehaltenen Schafböcken in X- und Y-Chromosom-tragende Spermien trennen. Die Autoren zeigten, dass geschlechtsdifferenzierte Spermien auch nach einem zweiten Gefrier- und Auftauzyklus voll funktionsfähig sind, wenn sie für IVF genutzt werden.

Aufbauend auf diese Ergebnisse erzeugten DE GRAAF et al. (2007b) sogar Nachkommen durch künstliche Besamung mit zweimal gefrorenen geschlechtssortierten Spermien. Der Einsatz geschlechtssortierter und wiederholt

gefrorener Schafbockspermien ist nicht nur für die Schafzucht von großem Interesse.

Es dient ebenfalls als Modell zur Erprobung von Reproduktionstechniken für Wildtierspezies (O'B^RIEN et al., 2003; E^VANS et al., 2004).

Mittlerweile gilt es als erwiesen, dass geschlechtsdifferenzierte Spermien den nicht differenzierten nativen Zellen in Hinblick auf ihre Fertilität kaum unterlegen sind.

Neuste Untersuchungen legen sogar den Schluss nahe, dass durch das Aussortieren membrandefekter Spermien im Durchflusszytometer eine Spermiensubpopulation entsteht, die in ihrer Motilität, Fertilität, Mitochondrienaktivität und Membranintegrität den unsortierten überlegen ist (DE GRAAF et al., 2007a; BEILBY et al., 2009; DE GRAAF

et al., 2009). Jedoch nehmen durch den Sortiervorgang die Geschwindigkeit der Spermien und ihre Fähigkeit künstlichen Zervikalmukus zu durchqueren ab (DE GRAAF

et al., 2006). Durch diese Beobachtung heben sich Schafböcke von allen anderen bisher untersuchten Tierarten ab. Ob dieses Phänomen durch tierartspezifische Unterschiede in der Membranzusammensetzung, Interaktion mit Seminalplasma-bestandteilen, der Chromatinstruktur oder andere Umstände bedingt wird, ist noch nicht abschließend geklärt (DE GRAAF et al., 2009).

Für den kommerziellen Einsatz für laparoskopische Besamungen mit kryokonservierten Spermien werden in der australischen Schafindustrie standardmäßig Besamungsportionen mit 25 Millionen motilen Spermien eingesetzt (E^VANS et al., 2004). Für die Besamung mit geschlechtsdifferenzierten Spermien empfehlen einige Quellen eine vergleichbare Anzahl (HOLLINSHEAD et al., 2003; EVANS

et al., 2004). Jedoch zeigen Studien, dass durch angepasste Einfrier- und Besamungsprotokolle auch mit weit geringerer Spermienzahl akzeptable Ablamm-ergebnisse sowohl mit geschlechtssortierten als auch mit unsortierten, kryokonservierten Spermien erzielt werden können (siehe Tabelle 1). So erreichten DE

GRAAF et al. (2007c) mit nur 1 x 10⁶ geschlechtsdifferenzierten Spermien eine Ablammrate von 61,5 %. Es wird gemutmaßt, dass die besseren spermatologischen Qualitätsmerkmale der geschlechtssortierten Spermien unter anderem auf einen verminderten Druck während der Zytometerpassage von 40 psi statt den gebräuchlichen 50 psi zurückzuführen sind (DE GRAAF et al., 2006; BEILBY et al., 2009).

Literaturübersicht

Tabelle 1: Ablammraten nach Besamung mit geschlechtssortierten und unsortierten, kryokonservierten Spermien

geschlechtssortiert 10 42,9 14

geschlechtssortiert 20 31,3 16

geschlechtssortiert 40 72,7 11

unsortiert 5 46,7 15

geschlechtssortiert 5 66,1 56

geschlechtssortiert 15 66,7 57

unsortiert 1 34,5 55

24 3 Material und Methoden

Ziel dieser Arbeit war es, ein Verfahren zur verbesserten Kryokonservierung von geschlechtssortierten und unsortierten Schafspermien in Straws zu entwickeln. Wie aus der genannten Literatur zu entnehmen ist, hängt der Erfolg des Gefrierverfahrens maßgeblich vom Zusammenspiel aller Komponenten ab. Besonders entscheidend sind dabei die Gefrierrate und die Glycerinkonzentration, die in dieser Arbeit näher untersucht wurden. Der experimentelle Teil dieser Arbeit gliedert sich in zwei Versuchsabschnitte:

Versuch 1: Vergleich zweier computergestützter Einfrierkurven zur Kryo-konservierung in Straws mit der Pelletmethode.

Versuch 2: Vergleich des Einflusses unterschiedlicher Glycerinkonzentrationen im Sexcess®-Verdünner auf geschlechtssortierte und unsortierte Spermien.

Material und Methoden

25 3.1 Eingesetzte Ejakulate

3.1.1 Ejakulatgewinnung

Die in diesen Versuchen verwendeten Ejakulate wurden routinemäßig an der Besamungsstation der Klinik für Kleine Klauentiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, sowie der Besamungsstation des Instituts für Nutztiergenetik in Mariensee, im Zeitraum von Dezember 2016 bis Januar 2018 gewonnen.

Zum Einsatz kamen sechs verschiedene Schafböcke im reproduktionsfähigen Alter.

Die Böcke gehörten folgenden Rassen an: ein Dorperschafbock, ein Leineschafbock, ein Texelschafbock und drei Schwarzköpfige Fleischschafböcke. Die Haltungsbedingungen, sowie die Fütterung wurden für sämtliche Böcke identisch gestaltet. Alle Tiere wurden in dem Zeitraum der Ejakulatgewinnung regelmäßig tierärztlich untersucht und waren frei von klinischen Erkrankungen sowie serologisch frei von Brucellose, Border disease, Maedi, Paratuberkulose und Pseudotuberkulose.

Die eingesetzten Schafböcke wurden zweimal wöchentlich mit jeweils zwei Tagen Abstand vormittags abgesamt. Die Samenentnahme erfolgte mit Hilfe einer künstlichen Scheide für kleine Wiederkäuer (Minitüb, Tiefenbach Deutschland) unter Verwendung eines weiblichen Schafs als Sprungpartner. Bevor die künstliche Scheide angeboten wurde, wurde sie mit 45° C warmem Wasser gefüllt. Zur zusätzlichen Stimulation der Böcke wurde Luft in die künstlichen Scheiden hineingepumpt, um das innere Lumen zu verengen. In der Zeit bis zur Verwendung wurden die künstlichen Scheiden zusammen mit dem Auffanggefäß (15 ml Schraubröhre, Sarstedt, Nümstedt, Deutschland) in einem Wärmeschrank (Incubat, MELAG Medizintechnik, Berlin, Deutschland) bei 45° C gelagert. Während des Sprunges wurde das Auffanggefäß mit Hilfe eines Thermoüberzugs vor Abkühlung und UV-Licht geschützt.

3.1.2 Untersuchung der frisch gewonnenen Ejakulate

Für die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit kamen nur Ejakulate zum Einsatz, die die klinikeigenen spermatologischen Qualitätsparameter erfüllten. Dabei wurde ein modifiziertes Schema nach WEITZE (2001) angewendet.

Unmittelbar nach der Ejakulatgewinnung erfolgte eine makroskopische Beurteilung des Volumens (ml), der Farbe (grau-weiß bis gelb), der Konsistenz (wässrig bis rahmig), des Geruchs, der Massenbewegung ( - bis +++) und auf mögliche Bei-mengungen. Es wurden nur Ejakulate für die Versuche verwendet, die bei der makroskopischen Untersuchung in der Besamungsstation und bei der anschließenden computerassistierten mikroskopischen Beurteilung (Kapitel 3.2.1) im Labor die in nachfolgender Tabelle aufgeführten Eigenschaften erfüllten:

Tabelle 2: Spermatologische Qualitätsparameter modifiziert nach WEITZE (2001)

Parameter Anforderung

Volumen ≥ 0,5 ml

Farbe Elfenbeinfarben

Konsistenz Rahmig

Geruch Neutral

Massenbewegung +++

Beimengungen Nicht vorhanden

Motilität ≥ 80 %

Material und Methoden

27 3.2 Analyse der Spermien

3.2.1 Motilitätsmessung durch Computer-assisted sperm analysis

Die Motilität der Proben wurde mit Hilfe eines Computer Assisted Sperm Analyser (CASA) IVOS Version 12.0 von Hamilton Thorne Biosciences (Beverly, Ma, USA) bestimmt. Hierbei wurden neben der Gesamt- und Vorwärtsmotilität weitere, das Bewegungsverhalten näher charakterisierende, Parameter erhoben. Letztere umfassen die Parameter Velocity Curve Line (VCL), Velocity Average Path (VAP), Velocity Straight Line (VSL), Amplitude of Lateral Head Displacement (ALH), Beat Cross Frequency (BCF), Straightness (STR) und Linearity (LIN). Die Beschreibung der ergänzenden Parameter erfolgt in Tabelle 20 im Anhang dieser Arbeit.

Um die Messung durchzuführen, wurden die zu analysierenden Spermiensuspensionen zunächst mit Sexcess®-Sample (Masterrind, Verden), der unter gleichen Temperaturbedingungen gelagert wurde, auf eine Dichte von 10 x 10⁶/ml verdünnt und für 10 Minuten auf einem Heizblock (Eigenanfertigung FLI, kombiniert mit Heizplatte HT 200, Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) bei 37° C unter Lichtabschirmung inkubiert.

Um eine aussagekräftige Messung trotz Eidotterpartikel im Sexcess®

Tiefgefriermedium zu gewährleisten, wurde den verdünnten Proben vor der Inkubation 30 µl/ml Fluoreszenzfarbstoff Hoechst 33342 (BisBenzimide H33342, Trihydrochloride, Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Deutschland) von der Hoechst 33342 Stammlösung (5mg Hoechst 33342 in 1 ml Aqua bidest. gelöst, Konzentration:

8,9 mM/ml) zugegeben. Die Spermien für die geschlechtsspezifische Differenzierung wurden bereits mit Hoechst 33342 angefärbt und bedurften daher keiner weiteren Inkubation. Durch den Fluoreszenzfarbstoff, der die DNA in den Spermienköpfen anfärbt, können diese durch die Anregung einer Halogenlichtquelle im CASA System mittels Fluoreszenzmessung dargestellt werden. Durch diesen Vorgang ist es möglich, die angefärbten Spermienköpfe von den Eidotterpartikeln zu unterscheiden und zu analysieren.

Nach der zehnminütigen Inkubationsphase wurden 10 µl der Probe in eine Maklerkammer (SEFI Medical Instruments, Haifa, Israel) mit einer Tiefe von 10 µm, die im CASA Gerät zusammen mit dem dazugehörigen Objekttisch bereits auf 37° C vorgeheizt wurde, pipettiert. Um eine repräsentative Beurteilung der Probe zu erhalten wurden jeweils zehn Gesichtsfelder und jeweils 60 Bilder mit insgesamt 200 bis 1000 Zellen ausgewertet. Nach Fokussierung des Objektivs wurde kontrolliert, ob die Zellen in einem geeigneten Maß angefärbt waren. Außerdem wurde nach Aufnahme der zehn Felder sichergestellt, dass alle Spermien erkannt wurden. Zu jeder Probe wurde eine Doppelmessung durchgeführt und diese gemäß laborinterner Richtlinien bei Abweichungen > 10 % wiederholt. Die für die vorliegende Arbeit eingestellten Geräteparameter des CASA-Geräts sind im Anhang (Kapitel 9.3.1) aufgeführt.

3.2.2 Messung der Membranintegrität

Die Bestimmung der Membranintegrität erfolgte durchflusszytometrisch mit einer Fluoreszenzfarbstoffkombination aus dem Cyanin-Farbstoff SYBR® 14 (Mo Bi Tec, Göttingen, Deutschland) und Propidiumiodid (PI) (Mo Bi Tech, Göttingen, Deutschland). Der kombinierte Einsatz beider Farbstoff basiert auf den Arbeiten von GARNER et al. (1994) und CHRISTENSEN et al. (2004). Außerdem wurde die Eignung zur Evaluation der Viabilität von Schafbockspermien von YANIZ et al. (2013) ausführlich beschrieben.

Der SYBR® 14 Farbstoff kann Zellmembranen penetrieren und interkaliert somit in die DNA aller Spermien, unabhängig ihres Membranstatus. Wird die so gefärbte Zelle optisch angeregt, emittiert der Kern Licht mit grünem Bereich.

Propidiumiodid ist hingegen für gesunde Zellen wegen seiner Größe nicht membranpermeabel und gelangt nur in die Zellen, deren Plasmamembran bereits geschädigt ist (KRISHAN, 1975; GARNER et al., 1994). Die Kerne dieser Zellen emittieren bei optischer Anregung Licht im roten Bereich. Bei der kombinierten Anwendung beider Fluoreszenzfarbstoffe wird in Spermien mit geschädigter Membran SYBR® 14 durch PI verdrängt (GARNER et al., 1994).

Material und Methoden

Durch diesen Vorgang ist es möglich die Zellen nach ihrem Membranstatus in verschiedene Populationen zu differenzieren (GARNER UND JOHNSON, 1995).

Ausschließlich Spermienzellen mit unbeschädigter Plasmamembran emittieren in der durchflusszytometrischen Untersuchung grünes Licht und werden als intakt gewertet.

Die Spermien, die eine Rotfluoreszenz zeigen, werden als tote Spermien gezählt. Die Population, die sowohl grünes, als auch rotes Licht emittiert wird der Gruppe der moribunden Spermien zugeordnet. Dabei wurden nicht gefärbte Teilchen und Fragmente, die nur eine geringe Autofluoreszenz zeigten, wie beispielsweise die Eidotterpartikel aus den Verdünnern von der Evaluation ausgeschlossen.

Bei dem eingesetzten Durchflusszytometer handelt es sich um ein Gallios 10/3™

(Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland), an dem die Datenauswertung mit der inbegriffenen Software (Gallios™ Cytometer 1.2, Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland) durchgeführt wurde.

In Vorbereitung auf die Messung wurden je 480 µl TRIS-Lösung, 5 µl SYBR® 14 in Verdünnung 1:100 (1 mM SYBR®14 in Dimethylsulfoxid: Ca²⁺-freier Phosphat gepufferte (PBS) Salzlösung), 3 µl PI in Verdünnung 1:10 mit Ca²⁺-freier PBS Lösung in ein FACS-Röhrchen (PP-Röhrchen, Natur, 5 ml, GREINER BIO-ONE, Frickenhausen, Deutschland) gegeben. Die Lösungen im Probenröhrchen wurden gemischt (Vortex Mixer, Merck Eurolab, Darmstadt) und anschließend das Probenmaterial mit einem absoluten Zellgehalt von 500.000 Spermien hinzugegeben.

Die Probe wurde daraufhin für 15 min bei 37° C in einem Wärmeschrank (Brutschrank Incubat, MELAG Medizintechnik, Berlin, Deutschland) unter Lichtausschluss inkubiert.

Zu jeder Probe wurde eine Doppelmessung mit je mindestens 10.000 Zellen durchgeführt, aus der später der Mittelwert bestimmt wurde. Bei Abweichungen > 5 % wurde die Messung wiederholt.

3.2.3 Erfassung morphologischer Veränderungen

Für die morphologische Beurteilung wurde die jeweilige Spermiensuspension in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) mit Fixierlösung nach

Hancock auf eine Dichte von 6 x 10⁶ Spermien/ml verdünnt und auf diese Weise fixiert.

Im Rahmen der visuell-mikroskopischen Untersuchung wurden 6 µl der Suspension auf einen Objektträger gegeben und mittels Deckglas verschlossen. Anschließend wurde die Probe mit einem Phasenkontrastmikroskop (Olympus BX60, Fa. Olympus, Tokyo, Japan) mit eingelegtem Grünfilter (IF550, Fa. Olympus, Tokyo, Japan) mit 1000 x Vergrößerung in Ölimmersion (Merck, Darmstadt, Deutschland) betrachtet. Für die Untersuchung wurden 100 Spermien je Probe evaluiert und die festgestellten Schäden unter Verwendung des in Tabelle 21 aufgeführten Schemas protokolliert.

Material und Methoden

3.3 Untersuchung der aufgetauten Proben mittels Thermoresistenztest

Die Ermittlung der Überlebensfähigkeit der Spermien nach dem Einfrier- und Auftauprozess erfolgte unter Durchführung eines sechsstündigen Thermoresistenztests.

Dazu wurden die frisch aufgetauten Spermien auf einem vorgeheizten Aluminiumblock bei 37° C in 1,5 ml Reagiergefäßen (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) aufbewahrt und durch eine Aluminiumabdeckung ein Lichtausschluss gewährleistet. Die erste Messung, die eine computerassistierte Motilitätsanalyse (Kapitel 3.2.1), eine durchflusszytometrische Bestimmung der Membranintegrität (Kapitel 3.2.2) und eine morphologische Beurteilung (Kapitel 3.2.3) umfasste, wurde direkt nach dem Auftauen nach einer zehnminütigen Adaptationsphase (Stunde 0) durchgeführt. Eine zweite Messung mit gleichem Umfang wurde nach einer Wartephase von drei Stunden (Stunde 3) durchgeführt. Nach weiteren drei Stunden fand die letzte Messung statt (Stunde 6).

32 3.4 Geschlechtsspezifisches Sortieren 3.4.1 Vorbereitung des Samens

Der Teil des Ejakulats, der zur durchflusszytometrischen Sortierung vorgesehen war, wurde nach der Gewinnung mit auf 27° C vorgewärmtem, eidotterfreiem Sexcess®-Sample in 1 ml-Aliquots (1,5 ml Reagiergefäß, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) auf eine Dichte von 100 x 10⁶/ml verdünnt. Den einzelnen Proben wurde jeweils 7,5 µl Hoechst 33342 Fluoreszenzfarbstoff zugesetzt und während des Transports vom Ort der Samengewinnung in einem transportablen Embryotransportgefäß (Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) bei 34,8° C für eine Stunde inkubiert. Sobald die Inkubation abgeschlossen war, wurden die Proben bei Raumtemperatur unter Lichtausschluss bis zum Sortieren aufbewahrt. Unmittelbar vor dem Sortieren wurden die Proben in ein 5 ml Kunststoffröhrchen umgefüllt und erneut mit Sexcess®-Sample verdünnt, bis eine Spermienkonzentration von 50 x 10⁶/ml erreicht war. Um während des Sortierprozesses membrangeschädigte Spermien zu detektieren, wurde jeder Probe 1 µl des Lebensmittelfarbstoffs FD&C#40 (Warner Jenkinson Company Inc., St. Louis,

Im Dokument Untersuchungen zur Kryokonservierung geschlechtssortierter und unsortierter Schafbockspermien (Seite 26-0)