Untersuchung der frisch gewonnenen Ejakulate

Für die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit kamen nur Ejakulate zum Einsatz, die die klinikeigenen spermatologischen Qualitätsparameter erfüllten. Dabei wurde ein modifiziertes Schema nach WEITZE (2001) angewendet.

Unmittelbar nach der Ejakulatgewinnung erfolgte eine makroskopische Beurteilung des Volumens (ml), der Farbe (grau-weiß bis gelb), der Konsistenz (wässrig bis rahmig), des Geruchs, der Massenbewegung ( - bis +++) und auf mögliche Bei-mengungen. Es wurden nur Ejakulate für die Versuche verwendet, die bei der makroskopischen Untersuchung in der Besamungsstation und bei der anschließenden computerassistierten mikroskopischen Beurteilung (Kapitel 3.2.1) im Labor die in nachfolgender Tabelle aufgeführten Eigenschaften erfüllten:

Tabelle 2: Spermatologische Qualitätsparameter modifiziert nach WEITZE (2001)

Parameter Anforderung

Volumen ≥ 0,5 ml

Farbe Elfenbeinfarben

Konsistenz Rahmig

Geruch Neutral

Massenbewegung +++

Beimengungen Nicht vorhanden

Motilität ≥ 80 %

Material und Methoden

27 3.2 Analyse der Spermien

3.2.1 Motilitätsmessung durch Computer-assisted sperm analysis

Die Motilität der Proben wurde mit Hilfe eines Computer Assisted Sperm Analyser (CASA) IVOS Version 12.0 von Hamilton Thorne Biosciences (Beverly, Ma, USA) bestimmt. Hierbei wurden neben der Gesamt- und Vorwärtsmotilität weitere, das Bewegungsverhalten näher charakterisierende, Parameter erhoben. Letztere umfassen die Parameter Velocity Curve Line (VCL), Velocity Average Path (VAP), Velocity Straight Line (VSL), Amplitude of Lateral Head Displacement (ALH), Beat Cross Frequency (BCF), Straightness (STR) und Linearity (LIN). Die Beschreibung der ergänzenden Parameter erfolgt in Tabelle 20 im Anhang dieser Arbeit.

Um die Messung durchzuführen, wurden die zu analysierenden Spermiensuspensionen zunächst mit Sexcess®-Sample (Masterrind, Verden), der unter gleichen Temperaturbedingungen gelagert wurde, auf eine Dichte von 10 x 10⁶/ml verdünnt und für 10 Minuten auf einem Heizblock (Eigenanfertigung FLI, kombiniert mit Heizplatte HT 200, Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) bei 37° C unter Lichtabschirmung inkubiert.

Um eine aussagekräftige Messung trotz Eidotterpartikel im Sexcess®

Tiefgefriermedium zu gewährleisten, wurde den verdünnten Proben vor der Inkubation 30 µl/ml Fluoreszenzfarbstoff Hoechst 33342 (BisBenzimide H33342, Trihydrochloride, Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Deutschland) von der Hoechst 33342 Stammlösung (5mg Hoechst 33342 in 1 ml Aqua bidest. gelöst, Konzentration:

8,9 mM/ml) zugegeben. Die Spermien für die geschlechtsspezifische Differenzierung wurden bereits mit Hoechst 33342 angefärbt und bedurften daher keiner weiteren Inkubation. Durch den Fluoreszenzfarbstoff, der die DNA in den Spermienköpfen anfärbt, können diese durch die Anregung einer Halogenlichtquelle im CASA System mittels Fluoreszenzmessung dargestellt werden. Durch diesen Vorgang ist es möglich, die angefärbten Spermienköpfe von den Eidotterpartikeln zu unterscheiden und zu analysieren.

28

Nach der zehnminütigen Inkubationsphase wurden 10 µl der Probe in eine Maklerkammer (SEFI Medical Instruments, Haifa, Israel) mit einer Tiefe von 10 µm, die im CASA Gerät zusammen mit dem dazugehörigen Objekttisch bereits auf 37° C vorgeheizt wurde, pipettiert. Um eine repräsentative Beurteilung der Probe zu erhalten wurden jeweils zehn Gesichtsfelder und jeweils 60 Bilder mit insgesamt 200 bis 1000 Zellen ausgewertet. Nach Fokussierung des Objektivs wurde kontrolliert, ob die Zellen in einem geeigneten Maß angefärbt waren. Außerdem wurde nach Aufnahme der zehn Felder sichergestellt, dass alle Spermien erkannt wurden. Zu jeder Probe wurde eine Doppelmessung durchgeführt und diese gemäß laborinterner Richtlinien bei Abweichungen > 10 % wiederholt. Die für die vorliegende Arbeit eingestellten Geräteparameter des CASA-Geräts sind im Anhang (Kapitel 9.3.1) aufgeführt.

3.2.2 Messung der Membranintegrität

Die Bestimmung der Membranintegrität erfolgte durchflusszytometrisch mit einer Fluoreszenzfarbstoffkombination aus dem Cyanin-Farbstoff SYBR® 14 (Mo Bi Tec, Göttingen, Deutschland) und Propidiumiodid (PI) (Mo Bi Tech, Göttingen, Deutschland). Der kombinierte Einsatz beider Farbstoff basiert auf den Arbeiten von GARNER et al. (1994) und CHRISTENSEN et al. (2004). Außerdem wurde die Eignung zur Evaluation der Viabilität von Schafbockspermien von YANIZ et al. (2013) ausführlich beschrieben.

Der SYBR® 14 Farbstoff kann Zellmembranen penetrieren und interkaliert somit in die DNA aller Spermien, unabhängig ihres Membranstatus. Wird die so gefärbte Zelle optisch angeregt, emittiert der Kern Licht mit grünem Bereich.

Propidiumiodid ist hingegen für gesunde Zellen wegen seiner Größe nicht membranpermeabel und gelangt nur in die Zellen, deren Plasmamembran bereits geschädigt ist (KRISHAN, 1975; GARNER et al., 1994). Die Kerne dieser Zellen emittieren bei optischer Anregung Licht im roten Bereich. Bei der kombinierten Anwendung beider Fluoreszenzfarbstoffe wird in Spermien mit geschädigter Membran SYBR® 14 durch PI verdrängt (GARNER et al., 1994).

Material und Methoden

29

Durch diesen Vorgang ist es möglich die Zellen nach ihrem Membranstatus in verschiedene Populationen zu differenzieren (GARNER UND JOHNSON, 1995).

Ausschließlich Spermienzellen mit unbeschädigter Plasmamembran emittieren in der durchflusszytometrischen Untersuchung grünes Licht und werden als intakt gewertet.

Die Spermien, die eine Rotfluoreszenz zeigen, werden als tote Spermien gezählt. Die Population, die sowohl grünes, als auch rotes Licht emittiert wird der Gruppe der moribunden Spermien zugeordnet. Dabei wurden nicht gefärbte Teilchen und Fragmente, die nur eine geringe Autofluoreszenz zeigten, wie beispielsweise die Eidotterpartikel aus den Verdünnern von der Evaluation ausgeschlossen.

Bei dem eingesetzten Durchflusszytometer handelt es sich um ein Gallios 10/3™

(Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland), an dem die Datenauswertung mit der inbegriffenen Software (Gallios™ Cytometer 1.2, Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland) durchgeführt wurde.

In Vorbereitung auf die Messung wurden je 480 µl TRIS-Lösung, 5 µl SYBR® 14 in Verdünnung 1:100 (1 mM SYBR®14 in Dimethylsulfoxid: Ca²⁺-freier Phosphat gepufferte (PBS) Salzlösung), 3 µl PI in Verdünnung 1:10 mit Ca²⁺-freier PBS Lösung in ein FACS-Röhrchen (PP-Röhrchen, Natur, 5 ml, GREINER BIO-ONE, Frickenhausen, Deutschland) gegeben. Die Lösungen im Probenröhrchen wurden gemischt (Vortex Mixer, Merck Eurolab, Darmstadt) und anschließend das Probenmaterial mit einem absoluten Zellgehalt von 500.000 Spermien hinzugegeben.

Die Probe wurde daraufhin für 15 min bei 37° C in einem Wärmeschrank (Brutschrank Incubat, MELAG Medizintechnik, Berlin, Deutschland) unter Lichtausschluss inkubiert.

Zu jeder Probe wurde eine Doppelmessung mit je mindestens 10.000 Zellen durchgeführt, aus der später der Mittelwert bestimmt wurde. Bei Abweichungen > 5 % wurde die Messung wiederholt.

3.2.3 Erfassung morphologischer Veränderungen

Für die morphologische Beurteilung wurde die jeweilige Spermiensuspension in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) mit Fixierlösung nach

30

Hancock auf eine Dichte von 6 x 10⁶ Spermien/ml verdünnt und auf diese Weise fixiert.

Im Rahmen der visuell-mikroskopischen Untersuchung wurden 6 µl der Suspension auf einen Objektträger gegeben und mittels Deckglas verschlossen. Anschließend wurde die Probe mit einem Phasenkontrastmikroskop (Olympus BX60, Fa. Olympus, Tokyo, Japan) mit eingelegtem Grünfilter (IF550, Fa. Olympus, Tokyo, Japan) mit 1000 x Vergrößerung in Ölimmersion (Merck, Darmstadt, Deutschland) betrachtet. Für die Untersuchung wurden 100 Spermien je Probe evaluiert und die festgestellten Schäden unter Verwendung des in Tabelle 21 aufgeführten Schemas protokolliert.

Material und Methoden

31

3.3 Untersuchung der aufgetauten Proben mittels Thermoresistenztest

Die Ermittlung der Überlebensfähigkeit der Spermien nach dem Einfrier- und Auftauprozess erfolgte unter Durchführung eines sechsstündigen Thermoresistenztests.

Dazu wurden die frisch aufgetauten Spermien auf einem vorgeheizten Aluminiumblock bei 37° C in 1,5 ml Reagiergefäßen (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) aufbewahrt und durch eine Aluminiumabdeckung ein Lichtausschluss gewährleistet. Die erste Messung, die eine computerassistierte Motilitätsanalyse (Kapitel 3.2.1), eine durchflusszytometrische Bestimmung der Membranintegrität (Kapitel 3.2.2) und eine morphologische Beurteilung (Kapitel 3.2.3) umfasste, wurde direkt nach dem Auftauen nach einer zehnminütigen Adaptationsphase (Stunde 0) durchgeführt. Eine zweite Messung mit gleichem Umfang wurde nach einer Wartephase von drei Stunden (Stunde 3) durchgeführt. Nach weiteren drei Stunden fand die letzte Messung statt (Stunde 6).

32 3.4 Geschlechtsspezifisches Sortieren 3.4.1 Vorbereitung des Samens

Der Teil des Ejakulats, der zur durchflusszytometrischen Sortierung vorgesehen war, wurde nach der Gewinnung mit auf 27° C vorgewärmtem, eidotterfreiem Sexcess®-Sample in 1 ml-Aliquots (1,5 ml Reagiergefäß, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) auf eine Dichte von 100 x 10⁶/ml verdünnt. Den einzelnen Proben wurde jeweils 7,5 µl Hoechst 33342 Fluoreszenzfarbstoff zugesetzt und während des Transports vom Ort der Samengewinnung in einem transportablen Embryotransportgefäß (Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) bei 34,8° C für eine Stunde inkubiert. Sobald die Inkubation abgeschlossen war, wurden die Proben bei Raumtemperatur unter Lichtausschluss bis zum Sortieren aufbewahrt. Unmittelbar vor dem Sortieren wurden die Proben in ein 5 ml Kunststoffröhrchen umgefüllt und erneut mit Sexcess®-Sample verdünnt, bis eine Spermienkonzentration von 50 x 10⁶/ml erreicht war. Um während des Sortierprozesses membrangeschädigte Spermien zu detektieren, wurde jeder Probe 1 µl des Lebensmittelfarbstoffs FD&C#40 (Warner Jenkinson Company Inc., St. Louis, USA) zugegeben. In unbeschädigte Membranen kann der Farbstoff nicht eindringen.

Beim Vorliegen von Membrandefekten ist es dem Stoff jedoch möglich in die Zellen einzudringen und so die Fluoreszenz durch den Hoechst 33342 Farbstoff zu diskriminieren. Die so gekennzeichneten Spermien wurden während der durchflusszytometrischen Differenzierung nicht mitsortiert.

3.4.2 Durchflusszytometrisches Sortieren

Um die X- und Y-Chromosom-tragenden Spermatozoen zu separieren wurde ein modifiziertes, durchflusszytometrisches Verfahren in Anlehnung an die Beltville Sperm Sexing Technology® (JOHNSON et al., 1999) angewandt.

Die geschlechtsspezifische Differenzierung der Spermatozoen wurde mit einem High-Speed-Flowzytometer MoFlo® SX (Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland) und der zugehörigen Software Summit™ (Version 4.3.02, Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland) durchgeführt. Die Anregung der Hoechst 33342 Moleküle erfolgte mit

Material und Methoden

33

einem Yttrium Vandat Feststofflaser (Coherent Laser®, Dieburg, Deutschland) mit einer Gesamtleistung von 2 W, der auf 180 mW eingestellt wurde. Das Probenmaterial wurde mit Hilfe eines Hüllstroms durch das Durchflusszytometer geleitet. Für diesen Hüllstrom diente Sexcess® Sheath Fluid (Masterrind, Verden, Deutschland) als Medium.

3.4.3 Nachbereitung des Samens

Die entsprechend ihrer X- und Y-Chromosomen sortierten Spermien wurden in konischen 10ml Röhrchen (Greiner, Nürtingen, Deutschland) aufgefangen, die 500 µl Auffangmedium enthielten. Das Auffangmedium bestand hierbei aus Sexcess®-I Verdünner und 5 µl Seminalplasma.

Die durchflusszytometrisch sortierten Proben, die sich neben dem ursprünglichen Probenmaterial auch aus der Sheath-Flüssigkeit und dem Auffangmedium mit dem vorgelegten Seminalplasma zusammensetzen, wurden 20 min bei 900 x g (Eppendorf Zentrifuge) zentrifugiert. Unter Schonung des Spermienpellets wurde der Überstand mit einer Vakuumpumpe abgehoben und verworfen. Anschließend wurden die Spermien in Sexcess®-I Verdünner resuspendiert. Die Proben wurden dann dem Kryokonservierungsverfahren zugeführt (Kapitel 3.5.1).

34 3.5 Kryokonservierung

3.5.1 Kryokonservierung in Straws 3.5.1.1 Beschaffenheit der Straws

Bei den hier verwendeten Straws handelt es sich um 250 µl Pailletten des Unternehmens IMV Technologies (L`Aigle, Frankreich). Diese bestehen aus einem Polyvinylchlorid-Kunststoff mit guten Wärmeleiteigenschaften. Ein Ende des Straws beinhaltet einen Stopfen aus Polyvinylalkohol, der durch den Kontakt mit einer Flüssigkeit verhärtet und den Straw auf diese Weise verschließt. Das andere Ende wurde nach Befüllung manuell mittels Ultraschall verschweißt (Ultraseal21™, Minitüb, Tiefenbach, Deutschland).

3.5.1.2 Einfrierverfahren mit Straws

Das eigentliche Tiefgefrieren der nativen oder geschlechtssortierten Proben erfolgte unter Verwendung des zweistufigen Verdünnersystems Sexcess® (Masterrind, Verden, Deutschland), welches die beiden Komponenten Sexcess®-I (glycerinfrei) und Sexcess®-II (glycerinhaltig) beinhaltet.

Im Falle der unsortiert einzufrierenden Proben wurde das Ejakulat direkt nach seiner Gewinnung im Verhältnis 1:10 mit Sexcess®-I verdünnt und dem Abkühlungsprozess zugeführt. Letzterer begann bereits während des Probentransports zum Labor in einer Kühlbox bei 14° C. Im Labor angekommen wurde die Abkühlung für 1 h bei 12° C im Kühlschrank fortgesetzt. Hierbei sicherte die Verwendung eines Wassermantels (modifizierte Plastikflasche für Ebersamen, 100 ml, Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) eine langsame Temperierung des Probenmaterials. Im Anschluss wurden die Proben mit Sexcess®-I auf 24 x 10⁶ Spermien/ml verdünnt.

Der Abkühlprozess wurde daher erst nach Resuspendierung mit Sexcess®-I fortgesetzt. Hierbei wurde die Spermiendichte der Proben ebenfalls auf 24 x 10⁶ Zellen/ml eingestellt.

In einer letzten Abkühlphase wurden die im Wassermantel befindlichen Proben für zwei Stunden in einem Kühlkabinett (AHT Cooling Systems, Rottenmann, Österreich)

Material und Methoden

35

bei 4° C aufbewahrt. Nach dieser Äquilibrierungsphase wurden die Proben mit dem glycerinhaltigen Sexcess®-II im Verhältnis 1:1 versetzt, und auf diese Weise eine Endkonzentration von 12 x 10⁶ Spermien/ml eingestellt. Neben den zu verarbeitenden Proben wurden ebenfalls sämtliche Arbeitsutensilien im Kühlkabinett auf 4° C gekühlt.

Hierzu gehörten ebenfalls die Straws, die zuvor mit einem Paillettendrucker (EasyCoder 2.0, Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) permanent gekennzeichnet wurden.

Nach Ablauf der Äquilibrierungsphase wurde die Spermiensuspension unter Verwendung eines Handgerätes in die Straws eingebracht und diese anschließend verschweißt. Damit bei der Befüllung der Straws möglichst wenig Material durch den Polyvinylalkoholstopfen verloren geht, wurden zunächst 30 µl eines Sexcess®-Gemischs aufgezogen. Darauf folgte eine Luftblase, die den Kontakt zwischen der nichtspermienhaltigen Vorlage und der Probe verhindert und erst dann folgte die Spermiensuspension selbst.

Nach der Befüllung wurden die Straws unter Verwendung eines Metallgestells (Eigenanfertigung FLI) in eine computergesteuerte Einfrierkammer (Computer Controlled Rate Freezer 14S, Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) überführt.

Anschließend wurden die Proben entsprechend des jeweiligen Versuchsprotokolls, wie in Kapitel 3.6.2 beschrieben eingefroren und für mindestens 24 h in LN2 gelagert.

3.5.1.3 Auftauverfahren der Straws

Das Auftauen der kryokonservierten Straws erfolgte in einem beheizbaren Wasserbad (Eigenanfertigung FLI, kombiniert mit Einhängethermostat MP, Julabo, Seelbach, Deutschland) bei einer Temperatur von 38° C für 20 Sekunden. Dafür wurden die Straws direkt aus dem LN2 in das Wasserbad überführt. Anschließend wurde der Inhalt der Straws in ein vorgeheiztes 1,5 ml Reagiergefäß (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) entleert und dieses in einem beheizbaren Aluminiumblock (Eigenanfertigung FLI, kombiniert mit Heizplatte HAT 200, Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) bei 37° C unter Lichtausschluss gelagert.

36 3.5.2 Kryokonservierung in Pelletform

3.5.2.1 Einfrierverfahren der Pellets

Das Abkühlverfahren, welches für die Kryokonservierung in Pelletform angewendet wurde, stimmt hinsichtlich der Abkühlzeiten und Verdünnermedien exakt mit dem der Kryokonservierung in Straws (Kapitel 3.5.1) überein.

Zur Kryokonservierung in Pelletform wurde zunächst eine flache Platte aus Trockeneis in einer Styroporbox (30 x 20 x 15 cm) bereitgelegt und mittels eines runden Metallstempels an mehreren Stellen bis zu einer Tiefe von ca. 2 mm Vertiefungen eingedrückt. Anschließend wurde in jede dieser Vertiefungen 250 µl der Spermiensuspension pipettiert. Das auf diese Weise hergestellte Pellet wurde für 10 min auf der Trockeneisplatte belassen und anschließend unmittelbar in LN2

überführt. Die Lagerung der Pellets im Stickstoffcontainer erfolgte hierbei in 10 ml Schraubröhrchen (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland). Auch die Pellets wurden bis zum Auftauen mindestens 24 Stunden eingelagert.

3.5.2.2 Auftauverfahren der Pellets

Zum Auftauen der Pellets wurden gläserne Reagenzröhrchen verwendet. Diese wurden zuvor in einem Wärmeschrank (Brutschrank Incubat, MELAG Medizintechnik, Berlin, Deutschland) auf 37° C erwärmt und unmittelbar vor Benutzung in das Wasserbad gehalten. Die Pellets wurden aus dem LN2 direkt in das Reagenzglas überführt und dort für 1,5 min erwärmt. Analog zum Straw-Verfahren wurden auch die geschmolzenen Pellets im Anschluss in ein vorgeheiztes 1,5 ml Reagiergefäß (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) pipettiert und dieses in dem beheizbaren Aluminiumblock (Eigenanfertigung FLI, kombiniert mit Heizplatte HAT 200, Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) bei 37° C gelagert.

Material und Methoden

37

3.6 Versuch 1: Vergleich zweier computergestützter Einfrierkurven zur Kryokonservierung in Straws mit der Pelletmethode

3.6.1 Gewinnung und Vorbereitung der Proben

Für diesen Versuch wurden jeweils sechs Ejakulate von fünf verschiedenen Schafböcken aus der Besamungsstation der Klinik für Kleine Klauentiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule und der Besamungsstation des Instituts für Nutztiergenetik verwendet. Die Samengewinnung und erste Begutachtung erfolgte wie beschrieben (Kapitel 3.1). Der Versuchsablauf ist in Abbildung 1 schematisch dargestellt.

3.6.2 Konfektionierung und Kryokonservierung

Der zweiphasige Abkühlprozess mit insgesamt dreistündiger Äquilibrierungszeit sowie die darauffolgende Konfektionierung erfolgte wie in den Kapiteln 3.5.1 und 3.5.2 beschrieben. Von jeder Spermaprobe wurde hierbei Zweidrittel in Straws abgefüllt und ein Drittel in 250 µl Aliquots nach erläuterter Methode auf der Trockeneisplatte eingefroren.

Im hier beschriebenen Versuch wurden zwei unterschiedliche Einfrierprotokolle angewendet, Variante 1 zeigte hierbei einen linearen Temperaturabfall von -20° C/min.

Auf diese Weise wurden die Straws innerhalb von 7,2 min auf eine Temperatur von -140° C abgekühlt und anschließend in Flüssigstickstoff überführt.

Bei Variante 2 handelte es sich um ein am FLI modifiziertes Einfrierprogamm, welches für den Sexcess®-Verdünner optimiert wurde. Die Gefrierkurve begann hierbei mit einer initialen Phase, in der die Probe innerhalb von 4,3 min mit einem Temperaturabfall von -3 °C/min auf -8° C abgekühlt wurde. Diese -8° C Plateauphase wurde zunächst für 1 min gehalten. In der anschließenden Abkühlungsphase fiel die Temperatur über einen Zeitraum von 2,3 min mit einer Abkühlungsrate von -50,15° C/min auf -120° C. Um die Endtemperatur von -140° C zu erreichen, wurde die Probe über 2 min mit einer Rate von -10° C/min abgekühlt und ebenfalls in flüssigen Stickstoff eingelagert.

38 3.6.3 Thermoresistenztest

Zur Evaluation des Einflusses des Kryokonservierungsverfahren auf die spermatologischen Qualitätsparameter nach dem Auftauen wurde ein sechsstündiger Thermoresistenztest durchgeführt (Kapitel 3.3). Von jedem Versuchstag wurden jeweils zwei Straws von Variante 1 (-20° C/min) und Variante 2 (modifizierte Gefrierkurve) sowie zwei Pellets aufgetaut (Kapitel 3.5.1 und Kapitel 3.5.2). Die beiden Straws einer Variante wurden nach dem Auftauen gepoolt und auf dem beschriebenen Aluminiumblock unter Lichtausschluss aufbewahrt. Die Analyse der Spermienmotilität mittels CASA-Verfahren, durchflusszytometrischer Bestimmung der Membranintegrität und visuell-mikroskopischen Evaluation der Morphologie erfolgte an den drei Messzeitpunkten (Stunde 0, Stunde 3, Stunde 6).

Material und Methoden

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Abbildung 1: Schematische Darstellung des Versuchsablaufs von Versuch 1 (Vergleich zweier computergestützter Einfrierkurven zur Kryokonservierung in Straws mit der Pelletmethode).

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3.7 Versuch 2: Vergleich des Einflusses unterschiedlicher Glycerinkon-zentrationen im Sexcess®-Verdünner auf geschlechtssortierte und unsortierte Spermien

3.7.1 Untersuchungen zur Gewinnung und Vorbereitung der Proben

Für diesen Versuch wurden jeweils sechs Ejakulate von zwei Schafböcken aus der Besamungsstation der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover verwendet. An jedem Versuchstag wurde ein Teil des Ejakulats zur Verwendung als unsortierte Probe in Sexcess®-I gemäß des beschriebenen Verfahrens (Kapitel 3.5.1) vorverdünnt. Für die Teilprobe die zur Geschlechtssortierung bestimmt war, wurde außerdem ein Anteil des Gesamtejakulats in den eidotterfreien Sexcess®-Sample Verdünner überführt (Kapitel 3.4.1). Beide wurden gemäß des Standardprotokolls (Kapitel 3.5.1.2) mit Sexcess®-I auf die doppelte Endkonzentration verdünnt und das zweistufige Abkühlungsverfahren wurde eingeleitet. Eine schematische Übersicht über den Versuchsablauf zeigt Abbildung 2.

3.7.2 Einstellen der drei verschiedenen Glycerinkonzentrationen

Sowohl die unsortierten als auch die sortierten Proben wurden nach der zweistündigen 4° C-Äquilibrierungsphase in jeweils drei Aliquots aufgeteilt. Jede dieser Teilproben wurde im Verhältnis 1:1 mit einer von drei verschiedenen Sexcess®-II Verdünnern versetzt, die sich in ihrer Glycerinkonzentration unterschieden. Durch die Vermischug der bis dahin glycerinfreien Proben mit Sexcess®-II, welches die doppelte Menge der gewünschten Glycerinkonzentrationen enthielt, ergaben sich die drei Endkonzentrationen 4,5 %, 5 % und 6,4 %. Auf diese Weise ergaben sich die nachfolgend genannten sechs Teilproben:

unsortiert mit 4,5 % Glycerin (U4,5) unsortiert mit 5 % Glycerin (U5) unsortiert mit 6,4 % Glycerin (U6,4)

Material und Methoden

41 sortiert mit 4,5 % Glycerin (S4,5)

sortiert mit 5 % Glycerin (S5) sortiert mit 6,4 % Glycerin (S6,4)

3.7.3 Kryokonservierung und Evaluation

Die vorbereiteten Proben wurden in Straws abgefüllt, allesamt der für das Sexcess®-Verdünnersystem optimierten Gefrierkurve (Kapitel 3.6.2) eingefroren und in Flüssigstickstoff eingelagert. Zur Beurteilung der spermatologischen Qualität nach dem Auftauen (Kapitel 3.5.1.3) wurde ein sechsstündiger Thermoresistenztest (Kapitel 3.3) durchgeführt.

42

Abbildung 2: Schamtische Darstellung von Versuch 2 (Vergleich des Einflusses unterschiedlicher Glycerinkonzentrationen im Sexcess®-Verdünner auf geschlechts-sortierte und ungeschlechts-sortierte Spermien).

Material und Methoden

43 3.8 Statistische Auswertung

Grundlage für die statistische Auswertung waren die Mittelwerte der durchgeführten Doppelmessungen für die Motilitätsparameter und die Membranintegrität sowie die Ergebnisse der morphologischen Untersuchung. Die statistische Auswertung erfolgte mittels des Softwarepaketes JMP® (JMP Version 12, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Da die Residuen in den meisten Fällen annähernd normalverteilt waren, konnten parametrische Tests angewendet werden. Die Ergebnisse werden als Kleinste-Quadrat-Mittelwerte (LS-Means) ± gepoolter Standardfehler (SEM) wiedergegeben. Effekte und Mittelwertsunterschiede wurden als signifikant angesehen, wenn p < 0,05.

Im Thermoresistenztest des 1. Versuches wurden mit Hilfe von multifaktoriellen Varianzanalysen die fixen Effekte Bock, Einfrierverfahren und Zeit sowie deren Zweifachinteraktionen betrachtet. Bei Effekten mit mehr als zwei Faktorstufen schloss sich ein paarweiser multipler Mittelwertsvergleich (Tukey-Kramer-Test) an.

Folgendes Modell kam zur Anwendung:

𝑦_{𝑖𝑗𝑘𝑙} = 𝜇 + 𝐵_𝑖 + 𝑉_𝑗+ 𝑍_𝑘+ (𝐵_𝑖 ∗ 𝑉_𝑗) + (𝐵_𝑖 ∗ 𝑍_𝑘) + (𝑉_𝑗∗ 𝑍_𝑘) + 𝑒_{𝑖𝑗𝑘𝑙}

𝑦𝑖𝑗𝑘𝑙 = beobachteter Merkmalswert 𝜇 = allgemeiner Mittelwert

𝐵𝑖 = fixer Einfluss des Bocks (𝑖 = 1, 2, 3, 4, 5)

𝑉𝑗 = fixer Einfluss des Einfrierverfahrens (𝑗 = 1, 2, 3) 𝑍𝑘 = fixer Einfluss der Zeit (𝑘 = 1, 2, 3)

𝐵𝑖∗𝑉𝑗 = Interaktion zwischen Bock und Einfrierverfahren 𝐵𝑖∗𝑍𝑘 = Interaktion zwischen Bock und Zeit

𝑉𝐽∗𝑍𝑘 = Interaktion zwischen Einfrierverfahren und Zeit 𝑒𝑖𝑗𝑘𝑙 = Restfehler

In die Analyse der vor dem Einfrieren erfassten Daten gingen die Effekte Bock, Status (nativ, direkt vor dem Einfrieren) und die Interaktion Bock x Status ein.

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In Versuch 2 wurden sowohl die Frisch- als auch die Tiefgefriersperma-Daten mittels multifaktorieller Varianzanalysen die fixen Effekte Bock, Glycerinkonzentration und Sortierung sowie deren Zweifachinteraktionen getrennt nach Zeit untersucht. Bei Effekten mit mehr als zwei Faktorstufen schloss sich wiederum ein paarweiser multipler Mittelwertvergleich (Tukey-Kramer-Test) an.

Hierbei wurde das nachfolgende Modell verwendet:

y_ijkl = μ + B_i + V_j+ S_k+ (B_i∗ V_j) + (B_i∗ S_k) + (V_j∗ S_k) + e_ijkl

𝑦𝑖𝑗𝑘𝑙 = beobachteter Merkmalswert 𝜇 = allgemeiner Mittelwert

𝐵𝑖 = fixer Einfluss des Bocks (𝑖 = 1, 2)

𝑉𝑗 = fixer Einfluss der Glycerinkonzentration (𝑗 = 1, 2, 3) Sk = fixer Einfluss der Sortierung (k = 1, 2)

𝐵𝑖∗𝑉𝑗 = Interaktion zwischen Bock und Glycerinkonzentration 𝐵𝑖∗Sk = Interaktion zwischen Bock und Sortierung

Vj∗Sk = Interaktion zwischen Glycerinkonzentration und Sortierung 𝑒𝑖𝑗𝑘𝑙 = Restfehler

Ergebnisse

45 4 Ergebnisse

4.1 Ergebnisse Versuch 1: Vergleich zweier computergestützter

Einfrierkurven zur Kryokonservierung in Straws mit der Pelletmethode In der Varianzanalyse konnte ein signifikanter Einfluss der Effekte Bock, Einfrierverfahren und Zeitpunkt auf die Parameter Gesamtmotilität, Vorwärtsmotilität, Anteil membranintakter Spermien und Anteil morphologisch unveränderter Spermien nachgewiesen werden (p < 0,01). Signifikante Interaktionen traten indes nur vereinzelt auf, hatten aber keine biologische Relevanz.

Die nachfolgenden Tabellen 3 bis 6 zeigen die ermittelten LS-Means inklusive signifikanter Unterschiede für die genannten Parameter in Abhängigkeit zum Einfrierverfahren. Darüber hinaus wird in Tabelle 7 der Einfluss des Kryokonservierungsverfahrens über alle Zeitpunkte betrachtet und in Tabelle 8 der Einfluss der eingesetzten Böcke auf die Spermaqualität gezeigt.

4.1.1 Motilität

Die mit der optimierten Einfrierkurve konservierten Spermien (VG 3) zeigten zu jedem Zeitpunkt eine höhere Gesamt- und Vorwärtsmotilität als die des Pelletverfahrens (VG 2) oder der -20° C/min-Kurve (VG 1), wobei die Unterschiede lediglich zum Messzeitpunkt Stunde 3 signifikant waren (p < 0,05). Der Abfall der Spermienmotilität über den Zeitraum von sechs Stunden war für alle Kryokonservierungsverfahren

Die mit der optimierten Einfrierkurve konservierten Spermien (VG 3) zeigten zu jedem Zeitpunkt eine höhere Gesamt- und Vorwärtsmotilität als die des Pelletverfahrens (VG 2) oder der -20° C/min-Kurve (VG 1), wobei die Unterschiede lediglich zum Messzeitpunkt Stunde 3 signifikant waren (p < 0,05). Der Abfall der Spermienmotilität über den Zeitraum von sechs Stunden war für alle Kryokonservierungsverfahren

Im Dokument Untersuchungen zur Kryokonservierung geschlechtssortierter und unsortierter Schafbockspermien (Seite 36-0)