Universität Bonn
Eingereicht über das Physiologische Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Entwicklung einer In situ-Hybridisierung für den Nachweis der mRNA der αα
1A-, αα
2B- und ββ
2-adrenergen Rezeptoren beim Rind
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von CLAUDIA HAKEMANN
aus Twistringen Hannover 2002
gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft
Wissenschaftliche Betreuung: Frau Prof. Dr. Dr. Helga Sauerwein
1. Gutachter: Herr Prof. Dr. Breves 2. Gutachter: Herr Prof. Dr. Dr. Brenig
Tag der mündlichen Prüfung: 19.11.2002
Meiner Omi und meinen Eltern
A Adenosin
Abb. Abbildung
Ac Acetat
Ampi Ampicillin
AP alkalische Phosphatase
as antisense
ATP Adenosintriphosphat
BCIP 5-Bromo, 4-Chloro, 3-Indolylphosphat
bp Basenpaar/e
BSA Bovines Serum Albumin
C Cytosin
cλ restriktionsenzymspezifische Konstante
°C Grad Celsius
cDNA copy desoxyribonucleic acid = komplementäre DNA cpm counts per minute = Zählungen pro Minute
CTP Cytidintriphosphat
DAB 3,3 Diaminobezidin
DEPC Diethylpyrocarbonat
Dig Digoxigenin
DNA desoxyribonucleic acid = Desoxyribonukleinsäure
DNase Desoxyribonuklease
dNTP Desoxynukleosid-5‘-triphosphat
dT desoxy Thymidin
DTT Dithiothreitol
E Extinktion
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamin-Tetraazetat Fab antigenbindendes Fragment FISH Fluoreszenz In situ-Hybridisierung
G Guanosin
g Erdbeschleunigung
GTP Guanosintriphosphat
h Stunde
IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalaktopyranosid
ISH In situ-Hybridisierung
kb Kilobase/n
LB-Medium Luria Bertani Medium
M Molar
MA- Puffer maleic acid = Maleinsäurepuffer
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
min Minute/n
ml Milliliter
mM Millimolar
MOPS 3-(N-Morpholin)-propansulfonsäure
mRNA messenger ribonucleic acid = Boten-Ribonukleinsäure NBT Nitro-blau Tetrazolium
Nco I Restriktionsendonuklease I von Rhodococcus sp.
ng Nanogramm
NTP/NTPs Nukleosidtriphosphat/e
p.a. pro analysi
PBS phosphat buffered saline = Phosphat gepufferte Saline PBT Phosphat gepufferte Saline mit Tween
PCR polymerase chain reaction = Polymerase Kettenreaktion
pmol Pikomol
PO/POD Peroxidase
Poly (A) Poly Adenylat
Pst I Restriktionsendonuklease I aus Providencia stuartii
PVA Polyvinylalkohol
RE Menge Restriktionsenzym
RISH Radioaktive In situ-Hybridisierung RNA ribonucleic acid = Ribonukleinsäure RNase Ribonuklease, RNA abbauendes Enzym
rRNA ribosomale RNA
RT Reverse Transkription
s sense
sec Sekunde (diese Abkürzung wurde entgegen dem SI- Standard gewählt, um eine Unterscheidung von „s“ für
„sense“ zu gewährleisten)
SA Streptavidin
Sal I Restriktionsendonuklease I von Streptomyces albus SDS sodium dodecylsulfat = Natriumdodecylsulfat
Sph I Restriktionsendonuklease I von Streptomyces
phaeochromogenes
SSC Standard-Saline-Citrat
T Thymidin
Tab. Tabelle
TAE- Puffer Tris-Acetat-Puffer
Taq Thermus aquaticus
TBE- Puffer Tris-Borat-Puffer
TSA Tyramide signal amplification = Tyramid Signalverstärkung
tRNA transfer RNA
TRIS Tris-Hydroxymethyl-Aminomethan
U unit = aktive Einheit
UTP Uridintriphosphat
UV ultraviolett
V Volt
X- Gal 5 Bromo-4 Chloro-3 Indolyl-β-D-Galaktopyranosid
1 Einleitung...9
2 Methodischer Teil...16
2.1 Vorarbeiten für die Entwicklung einer In situ- Hybridisierung ...16
2.1.1 Gewinnung von Gewebeproben und RNA-Extraktion...16
2.1.2 Herstellung und nicht-radioaktive Markierung von RNA- Sonden ...18
2.1.2.1 RNA-Sondenherstellung von Plasmiden...20
2.1.2.2 RNA-Sondenherstellung von PCR-Produkten ...35
2.1.3 Herstellung und radioaktive Markierung von RNA-Sonden...38
2.1.4 Anfertigung histologischer Präparate...40
2.1.5 mRNA-Nachweis in Paraffinschnitten mittels RT-PCR ...42
2.1.6 Northern Blot Hybridisierung...44
2.2 Entwicklung einer In situ-Hybridisierung mit nicht- radioaktiv markierten Sonden ...48
2.2.1 Gewebevorbereitung ...49
2.2.2 Hybridisierung...51
2.2.3 Posthybridisierungswaschen und RNase-Behandlung ...52
2.2.4 Nachweis mit dem Biotin-Streptavidin-System bzw. immunhistochemischer Nachweis ...52
2.3 Entwicklung einer In situ-Hybridisierung mit radioaktiv markierten Sonden ...56
2.3.1 Gewebevorbereitung ...56
2.3.2 Hybridisierung...57
2.3.3 Posthybridisierungswaschen und RNase-Behandlung ...57
2.3.4 Autoradiographie ...58
2.3.5 Gegenfärbung...60
2.3.6 Photodokumentation...60
3 Ergebnisse zur Entwicklung der In situ-Hybridisierung...61
3.1 Nicht-radioaktive In situ-Hybridisierung...61
3.2 Radioaktive In situ-Hybridisierung...64
4 Diskussion...77
5 Zusammenfassung ...98
6 Summary...100
7 Literaturverzeichnis ...101
8.1 Chemikalien und Biochemika...109
8.2 Geräte ...111
8.3 Verbrauchsmaterialien ...112
8.4 Puffer und Lösungen...112
8.5 mRNA-Sequenzen der αα1A-, αα2B- und ββ2-adrenergen Rezeptoren des Rindes...122
8.6 Tabellen...125
1 Einleitung
Adrenerge Rezeptoren
Adrenerge Rezeptoren sind Membranproteine, die auf Noradrenalin und Adrenalin als Transmitter aus den Varikositäten des sympathischen Nervensystems bzw.
systemisch wirkende Katecholamine aus dem Nebennierenmark ansprechen. Sie werden in die zwei Haupttypen α- und β-Rezeptoren unterteilt. Durch unterschiedliche Affinität zu adrenergen Rezeptoragonisten und -antagonisten und durch physiologische Wirkungen sind beide Rezeptortypen weiter in α1-, α2-, β1-, β2- und β3-Rezeptoren, und die α-Rezeptoren weiter in Subtypen (α1A-, α1B-, α1D- bzw.
α2A/D-, α2B- und α2C-Rezeptoren) unterteilt. Unter Zuhilfenahme von molekularbiologischen Methoden wurde die Nomenklatur der Subtypen der α- adrenergen Rezeptoren in neueren Publikationen im Vergleich zu älteren modifiziert (Tab. 1).
alte Bezeichnung neue Bezeichnung
α1a/d-Rezeptor α1D-Rezeptor
α1b-Rezeptor α1B-Rezeptor
α1c-Rezeptor α1A-Rezeptor
α2a-Rezeptor α2AD-Rezeptor
α2b-Rezeptor α2B-Rezeptor
α2c-Rezeptor α2C-Rezeptor
α2d-Rezeptor α2AD-Rezeptor
Tab. 1: Alte und neue Nomenklatur der αα-adrenergen Rezeptoren (zusammengestellt nach NICHOLAS et al., 1996 und CIVANTOS CALZADA und ALEIXANDRE DE ARTINANO, 2001)
In der folgenden Arbeit wird die neue Nomenklatur verwendet.
Die Rezeptortypen werden in verschiedenen Organen in unterschiedlichen Mengen exprimiert und vermitteln daher auch ihre Wirkung in unterschiedlichem Maße. α1- Rezeptoren herrschen an den Speicheldrüsen und der glatten Muskulatur vor. Ihre Stimulierung bewirkt die Förderung der K+- und Wassersekretion der Speicheldrüsen, Kontraktion von Arteriolen, Uterus, Bronchiolen, Sphinkter der Harnblase und des
Magen-Darm-Traktes, Vas efferens, M. dilatator pupillae und anderen. Dagegen sind α2-Rezeptoren unter anderem in Zentralem Nervensystem, Niere, Uterus, Parotis, Pankreas, Mastzellen und an Thrombozyten vorhanden. Man findet sie an präsynaptischen Membranen der cholinergen Neurone des Magen-Darm-Traktes, wo ihre Stimulierung eine Hemmung der Azetylcholinfreisetzung bewirkt. Die Stimulierung von präsynaptischen α2-Rezeptoren an den Varikositäten des Sympathikus, z.B. im Magen-Darm-Trakt und im Herzvorhof, bewirkt als negative Rückkopplung die verminderte Ausschüttung von Noradrenalin. Über β1-Rezeptoren wird die intrazelluläre Ca2+-Konzentration erhöht, was am Herzen positiv chrono-, dromo- und inotrop wirkt. In der Niere wird über β1-Rezeptoren die Reninfreisetzung erhöht. Durch die Bindung spezifischer Agonisten lassen sich die β2-Rezeptoren abgrenzen, die allgemein eine intrazelluläre Erniedrigung der Ca2+-Konzentration bewirken. Dadurch werden Blutgefäße und Bronchiolen dilatiert, die Magen-Darm- Muskulatur entspannt, die Insulinfreisetzung stimuliert sowie die Lipolyse und die Glykogenolyse gesteigert. Die β3-Rezeptoren befinden sich hauptsächlich auf Fettzellen, wo ihre Stimulierung eine Lipolyse bewirkt (zusammengefasst nach GRAHAM, 1990).
Besonders die Subtypen vaskulärer adrenerger Rezeptoren spielen eine große Rolle in der Medizin. Sie sind pharmakologisch wichtig für die Regulation des Blutdrucks und die Feineinstellung der Blutbereitstellung für die unterschiedlichen Organe. Um eine gezielte pharmakologische Behandlung auf Rezeptor-Subtyp-Ebene zu ermöglichen, ist die genaue Kenntnis der Verteilung der Rezeptor-Subtypen und eine Entwicklung subtypspezifischer Agonisten und Antagonisten nötig (zusammengefasst nach GUIMARAES und MOURA, 2001). In der Veterinärmedizin spielen die Subtypen der α1- und α2-adrenergen Rezeptoren bislang im therapeutischen Bereich keine explizite Berücksichtigung, obwohl viele ihrer Funktionen bekannt sind.
Bei den adrenergen Rezeptoren handelt es sich um G-Protein gekoppelte Zellmembranrezeptoren. Alle G-Protein gekoppelten Rezeptoren durchlaufen die Plasmamembran siebenmal. Das Protein besitzt einen extrazellulären Amino- Terminus und einen intrazellulären Carboxyl-Terminus. Durch die sieben α-helikal angeordneten transmembranen Domänen werden drei intrazelluläre und drei extrazelluläre Schleifen gebildet (Übersicht bei STRYER, 1995) (Abb. 1). Dabei ist
die Aminosäuresequenz der transmembranen Domänen zwischen den einzelnen adrenergen Rezeptoren am stärksten konserviert, während die dritte cytoplasmatische Schleife beim Rind die größten Unterschiede in der Sequenz zwischen den einzelnen Rezeptorsubtypen aufweist (VENKATARAMAN et al., 1997).
Die adrenergen Rezeptoren werden auch in der Milchdrüse des Rindes exprimiert (WELLNITZ et al., 2001).
Abb. 1: G-Protein gekoppelter Rezeptor (aus STRYER, Biochemie, 1995)
Adrenerge Rezeptoren in der Milchdrüse des Rindes
Bei der Milchabgabe spielt die Milchejektion eine entscheidende Rolle. Bis zu 80 % der produzierten Milch werden in den Alveolen der Milchdrüse gespeichert, wo sie durch kapillare Kräfte gehalten werden. Es sind maximal 21,0 % (PFEILSTICKER et al., 1996) der Milch direkt durch Absaugen aus der Drüsenzisterne zu ermelken. Die Milch aus den Alveolen muss aktiv ejiziert werden, um über das Milchgangsystem in die Drüsenzisterne abfließen zu können und von dort aus für das Jungtier bzw. die Melkmaschine verfügbar zu werden. Dies geschieht durch die Kontraktion der Myoepithelzellen, die die Alveolen korbartig und die kleinen Milchgänge in longitudinaler Richtung umspannen. Bei der taktilen Zitzenreizung kommt es über
COO- NH3+
extrazelluläre Seite
cytosolische Seite
Oligo- saccharid- einheit
einen neuro-endokrinen Reflexbogen zur Freisetzung von Oxytocin aus dem Hypophysenhinterlappen in die periphere Zirkulation. Oxytocin verursacht die Kontraktion der Myoepithelzellen und damit die Ejektion der Milch. Die Milchejektion hält bis zum Ende der Euterentleerung an und verlangsamt sich mit fortschreitender Entleerung (BRUCKMAIER et al., 1994). Zu Beginn des Melkens wird die Zisternenfraktion der Milch schnell abgesaugt und die Geschwindigkeit des Milchentzuges im weiteren Verlauf von der Geschwindigkeit der Milchejektion bestimmt (PFEILSTICKER et al., 1995).
Wie von BATRA (1986) zusammengefasst, ist eine zügige, schonende und dabei vollständige Euterentleerung beim Melken aus arbeitswirtschaftlichen Gründen und vor allem zur Erhaltung der Eutergesundheit von größter Bedeutung. Unnötige Belastung des Milchdrüsengewebes während des maschinellen Milchentzuges durch mangelnde Ejektion sowie im Euter zurückbleibende Milch führen auch zu einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber Mastitiserregern. Es ergeben sich eine beeinträchtigte Tiergesundheit sowie erhebliche wirtschaftliche Verluste.
Große individuell charakteristische Unterschiede im Verlauf der Milchabgabe bei Kühen lassen eine starke Variation der Milchejektionsgeschwindigkeit vermuten.
Neben der oxytocinabhängigen Kontraktion der Myoepithelzellen kann davon ausgegangen werden, dass der Transport der Milch durch das Milchgangsystem ein wesentliches Regulativ für Geschwindigkeit und Effizienz der Milchejektion darstellt.
Durch die Behandlung von Kühen mit α-adrenergen Agonisten kann die Milchejektion trotz normaler Oxytocinfreisetzung beim Melken blockiert werden (BRUCKMAIER et al., 1991, 1997). Obwohl eine Kontraktion der Zitze in longitudinaler Richtung eindeutig messbar und sichtbar war, wurde der maximale Milchfluss durch die Stimulation der α-adrenergen Rezeptoren nicht beeinflusst, solange Milch in der Zisterne vorhanden war, was bedeutet, dass die Kontraktion der Zitze keinen Einfluss auf den Milchfluss hat. Ein weiteres Nachfließen von Milch in die Drüsenzisterne war aber reduziert bzw. völlig unterbrochen (BRUCKMAIER et al., 1997). α1-, α2- und β2-adrenerge Rezeptoren wurden in Rezeptorbindungsstudien mit radioaktiv markierten Liganden in hoher Konzentration in Gewebehomogenaten aus Zitzenmuskulatur und Gewebe um die Drüsenzisterne, in dem die großen Milchgänge in die Zisterne münden, nachgewiesen. Im proximalen Drüsengewebe
waren eine geringe Konzentration der Rezeptoren nachweisbar (HAMMON et al., 1994).
Damit ergibt sich ein Widerspruch zu der Hypothese, wonach für die Milchabgabe während des Melkens lediglich die Milchejektion im Alveolargewebe sowie der Tonus der Zitzenmuskulatur ausschlaggebend seien. Störungen der Milchabgabe, wie sie etwa unter der Einwirkung von Stress beobachtet werden, wurden bei erfolgter Oxytocinausschüttung als verminderte Oxytocinwirkung interpretiert, die sich aus dem adrenerg reduzierten Blutfluss zu den Alveolen und damit einem verminderten Zustrom von Oxytocin an seine Zielzellen erklären soll (GOREWIT und AROMANDO, 1985). Dass im proximalen Drüsengewebe kaum Liganden für adrenerge Rezeptoren binden, deutet darauf hin, dass die Oxytocinwirkung im Drüsenkörper gegeben ist und nicht durch adrenerge Agonisten blockiert wird (HAMMON et al., 1994). Der Abfluss der Milch wird durch einen Einfluss des adrenergen Systems verhindert.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen lassen vermuten, dass die Transportkapazität der milchabführenden Gänge wesentlich durch das sympathische Nervensystem reguliert wird. Die glatte Muskulatur der Zitze reagiert mit deutlichen Tonusveränderungen auf die Stimulation der α- und β-adrenergen Rezeptoren (LEFCOURT, 1982, BRUCKMAIER et al., 1997). Der Tonus der glatten Muskulatur der Zitze hat allerdings kaum Einfluss auf Verfügbarkeit und Flussrate der Milch, die bereits in der Drüsenzisterne vorhanden ist. Dagegen kann der Übertritt der Alveolarmilch in die Zisternenhohlräume durch Stimulierung der α-adrenergen Rezeptoren reduziert oder sogar völlig unterbrochen werden.
Durch Stimulation mit β-adrenergen Agonisten wurden der Milchfluss in der Anfangsphase des Melkens sowie der maximale Milchfluss erhöht, während die Milchmenge nicht beeinflusst wurde (BRUCKMAIER et al., 1991).
Ungeklärt ist bisher, wo genau die Regulation der Milchejektion über das adrenerge System stattfindet. Alle Ergebnisse, die eine relativ hohe Dichte adrenerger Rezeptoren im Bereich der großen Milchgänge zeigen, beruhen auf deren Nachweis in Homogenaten. Deshalb ist die exakte Lokalisation der adrenergen Rezeptoren auf zellulärer Ebene nicht bekannt und damit auch ihre physiologische Wirkung hypothetisch. Zum besseren Verständnis der Vorgänge während der Milchejektion ist daher ein Rezeptornachweis in Gewebeschnitten nötig.
Möchte man die Lokalisation von Rezeptoren nachweisen, so kann dies auf Proteinebene mittels spezifischer Antikörper (Immunhistochemie) oder Liganden (In situ-Ligandenbindung) oder auf mRNA-Ebene mittels markierter Nukleinsäuresonden (In situ-Hybridisierung) geschehen. In der vorliegenden Arbeit wird ein Nachweis auf Transkriptionsebene, d.h. mit In situ-Hybridisierung, angestrebt.
In situ-Hybridisierung (ISH)
Die In situ-Hybridisierung erlaubt eine direkte Aussage über die Lokalisation und Verteilung von Nukleinsäuren in biologischen Präparaten in situ, d.h. in Geweben, Zellen, Zellkernen und Chromosomen. Mit dieser Methode können die gewebs- und zelltypspezifische Expression der mRNA von Proteinen und auch der zeitliche Verlauf der Expression untersucht werden. Sie eignet sich auch zur Identifizierung und Charakterisierung viraler und bakterieller Sequenzen und zur Geschlechtsbestimmung (WILKINSON, 1998, LEITCH et al., 1994).
Seit der Etablierung nicht-radioaktiver Markierungssysteme (LANGER et al., 1981, BRIGATI et al., 1983) stellt die In situ-Hybridisierung in vielen Laboratorien ein Routineverfahren insbesondere in der Diagnostik viraler Infektionen dar (Übersichten bei WARFORD und LAUDER, 1991). Sie gewinnt zunehmend an Bedeutung bei embryologischen, zellbiologischen, genetischen und pathologischen Fragestellungen (JIN und LLOYD, 1997).
Die Methode der radioaktiven In situ-Hybridisierung wurde erstmals 1969 zeitgleich von JOHN et al. und GALL und PARDUE zur Lokalisation von ribosomalen RNA- Sequenzen in Zellpräparationen publiziert. Sie beruht auf dem Prinzip der molekularen Hybridisierung einzelsträngiger Nukleinsäuren (DNA und/oder RNA), wobei die RNA-RNA-Hybridisierung besonders stabil ist. Eine markierte Nukleinsäuresonde hybridisiert in situ mit einem Nukleinsäurestrang, z.B. der mRNA des nachzuweisenden Proteins.
Für den Nachweis von mRNA im Gewebe zur Erforschung der räumlichen Expression werden RNase-frei gewonnene Gewebedünnschnitte benötigt. Dabei kann es sich um Paraffinschnitte, Gefrierschnitte oder auch in Harze eingebettete Gewebeschnitte handeln. Die Sonde kann eine RNA-Sonde, eine DNA-Sonde oder ein Oligonukleotid sein. Sie muss in ihrer Nukleinsäuresequenz komplementär zu der nachzuweisenden Nukleinsäure sein, d.h. eine RNA-Sonde ist der Gegenstrang zu der mRNA im Gewebe bzw. entspricht dem codogenen Strang der DNA. Markierte
RNA-Sonden werden durch in vitro-Transkription mit markierten Nukleotiden hergestellt. Dabei kann die Markierung nicht-radioaktiv oder radioaktiv erfolgen. Die nicht-radioaktive Markierung hat u.a. die Vorteile, dass sie einfacher und sicherer in der Handhabung und auch günstiger ist. Es kann mit Digoxigenin (Dig), Biotin oder Fluorescein markiert werden. Diese Moleküle können immunhistochemisch indirekt mit Hilfe von markierten Antikörpern bzw. Streptavidin-Enzym-Konjugaten nachgewiesen oder im Fall von Fluorescein direkt unter dem Mikroskop beurteilt werden. Die radioaktive Markierung wird mit Autoradiographie sichtbar gemacht und ist sensitiver. Die Auswertung der In situ-Hybridisierung findet mikroskopisch statt (zusammengefasst nach LEITCH et al., 1994 und JIN und LLOYD, 1997).
Ziel dieser Arbeit
Ziel dieser Arbeit ist es, eine In situ-Hybridisierung für den Nachweis der Lokalisation der Expression der adrenergen Rezeptoren auf zellulärer Ebene in der Milchdrüse des Rindes zu entwickeln. Damit soll die Hypothese geprüft werden, ob der ejektionsbedingte Transport der Milch vom Alveolargewebe in die Drüsenzisterne durch die Stimulierung von adrenergen Rezeptoren im Bereich des Milchgangsystems beeinflusst wird. Es wird vermutet, dass sich die adrenergen Rezeptoren in den glatten Muskelzellen, die zirkulär um die großen Milchgänge lokalisiert sind, befinden (WELLNITZ et al., 2001). Sie sind somit an der Verhinderung des Milchflusses beteiligt, indem bei ihrer Stimulierung die großen Milchgänge verengt werden. Dadurch wird ein Abfließen der Milch in die Drüsenzisterne verhindert. Mit dem Nachweis der Lokalisation der adrenergen Rezeptoren in den Zellen des Euters soll der genaue Wirkort der Katecholamine untersucht werden.
2 Methodischer Teil
2.1 Vorarbeiten für die Entwicklung einer In situ-Hybridisierung
Alle Arbeiten wurden unter RNase-freien Bedingungen durchgeführt. Es wurde mit Latexhandschuhen und bei Ethidiumbromidarbeiten mit Nitrilhandschuhen gearbeitet.
Sämtliche Puffer und Lösungen, außer Tris-HCl, wurden mit 0,1 % DEPC gegen RNase-Kontamination behandelt, über Nacht bei 37°C inkubiert und anschließend 30 min autoklaviert. Glas- und Metallwaren wurden vor dem Gebrauch 2 h bei 180°C gebacken und Plastikwaren für 50 min autoklaviert. Die Arbeitsflächen wurden mit 70 %igem Ethanol desinfiziert und anschließend mit 0,1 M Salzsäure abgewischt.
Die Reinigung der Geräte im histologischen Labor erfolgte mit 3 %igem Wasserstoffperoxid und anschließender Spülung mit 100 %igem Isopropanol. Das Gefriermikrotom wurde mit Chloroform gereinigt.
Sämtliche Arbeitsschritte wurden, sofern nicht anders angegeben, auf Eis durchgeführt.
Detaillierte Angaben zu den verwendeten Chemikalien und Puffern sind im Anhang zusammengefasst.
Es wurde im S 1-Labor des Institutes für Physiologie, Biochemie und Hygiene der Tiere der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn (Zulassungsnummer 521- K-1.3/99) gearbeitet.
2.1.1 Gewinnung von Gewebeproben und RNA-Extraktion
Gewebeprobenentnahme aus dem Euter des Rindes
Aus entnommenem Gewebe aus dem Euter des Rindes wurde die RNA-Extraktion und spätere Reverse Transkription-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) durchgeführt, da hierdurch bereits der Nachweis gegeben wurde, dass die zu untersuchenden Rezeptoren in der Milchdrüse exprimiert werden.
Die Probenentnahme aus dem Euter des Rindes fand auf dem Schlachthof in Euskirchen statt und wurde mit Handschuhen, sterilem Skalpell und steriler Pinzette durchgeführt. Vor der Probenentnahme wurde in 2 ml Reaktionsgefäßen je 1 ml TRIzol-Reagenz, das zur Isolierung von Gesamt-RNA verwendet wird, vorgelegt und diese auf Eis gelagert. Die Entnahme der Proben erfolgte direkt nach der Schlachtung, d.h. aus dem frischtoten Tierkörper, wobei gemäß des
Zerlegungsvorganges am Band 10-15 min vergingen, bis das Euter nach dem Entbluten abgetrennt wurde und für die Probenentnahme zur Verfügung stand. Die Zitzen wurden vor der Entnahme der Proben mit sterilem PBS-Puffer gewaschen. Es wurde jeweils eine Gewebeprobe von der Größe eines Würfels mit einer Kantenlänge von 5 mm aus dem Euterparenchym und dem Bereich der Drüsenzisterne bzw. eine 5 mm dicke Scheibe des Querschnittes einer Zitze entnommen. Bei der Zitzenprobe wurde darauf geachtet, dass alle Schichten der Zitzenwand mit erfasst wurden. Die Proben wurden jeweils in ein mit TRIzol- Reagenz vorbereitetes Gefäß überführt und kräftig geschüttelt. Diese Gefäße wurden direkt nach der Probenentnahme in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Gewebeproben wurden bis zum Gebrauch bei -80°C gelagert.
Extraktion von Gesamt-RNA aus Eutergewebeproben
Die Extraktion von Gesamt-RNA erfolgte nach dem TRIzol-Reagenz Protokoll für RNA Isolierung. Für die Extraktion von Gesamt-RNA aus den Eutergewebeproben wurden die Proben langsam auf Eis aufgetaut. Die gekühlten Proben wurden mit Hilfe eines Dispergierwerkzeuges (Ultra Turrax T25, IKA LABORTECHNIK, Staufen) im Reaktionsgefäß homogenisiert. Anschließend wurden die Proben 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und jeweils 200 µl Chloroform hinzugefügt. Nach erneuter zwei- bis dreiminütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Gewebeproben 15 min bei 14.000 g und 4°C zentrifugiert. Anschließend wurde die obere farblose Phase in ein frisches 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und 500 µl Isopropanol hinzugefügt. Nach einer Inkubation von 10 min bei Raumtemperatur erfolgte eine Zentrifugation von 10 min bei 10.000 g und 4°C. Nach der Entfernung des Überstandes wurde das entstandene Pellet gewaschen, indem vorsichtig 400 µl 70 %iges Ethanol darauf gegeben wurden. Nach fünfminütiger Zentrifugation bei 10.000 g und 4°C wurde der Alkohol entfernt. Nach Wiederholung des Waschvorganges wurde das Pellet 5 min bei Raumtemperatur getrocknet und in 30 µl DEPC-behandeltem Wasser gelöst. Die Lagerung erfolgte bei -80°C.
Spektrophotometrische Bestimmung der Konzentration der Gesamt-RNA in der Probe
Zur spektrophotometrischen Bestimmung der Konzentration der Gesamt-RNA in der Probe wurde diese 1:10 mit DEPC-behandeltem Wasser verdünnt. Zunächst wurden zwei Quarzküvetten (70 µl), eine Referenzküvette und eine Messküvette, mit DEPC- behandeltem Wasser befüllt und als Nullwert gegeneinander abgeglichen. Die Küvetten wurden für jede Messung auf die Anwesenheit von Luftblasen und Verunreinigungen kontrolliert. Anschließend wurde das Wasser in der Messküvette durch die Probe ersetzt. Die Extinktion (E) wurde bei 280 und 260 nm gemessen.
Wenn die Extinktion bei 260 nm über 1,0 lag, wurde die Probe 1:100 verdünnt und erneut gemessen. Der Quotient aus der E260 nm und der E280 nm sollte dabei im Bereich von 1,6-2,0 liegen. Lag der Quotient unter 1,6, so wurde die Probe als verunreinigt verworfen. Eine E260 nm-Einheit entspricht einer Konzentration von 40 µg RNA/ml. Mit folgender Formel nach SAMBROOK et al. (1989) ließ sich die Konzentration der Gesamt-RNA in der Probe berechnen:
(E260 nm bei einer Probenverdünnung von 1:10) • 40
--- = x [µg/µl];
100
2.1.2 Herstellung und nicht-radioaktive Markierung von RNA-Sonden
Die Herstellung und Markierung von RNA-Sonden erfolgte in einer in-vitro Transkriptionsreaktion. Dabei ist es mit weniger Aufwand und weniger Risiken für den Anwender verbunden, wenn mit nicht-radioaktiven Substanzen markiert wird. Die Markierung erfolgt, indem dem Transkriptionsansatz Nukleotide zugefügt werden, an die Digoxigenin (Dig) oder Biotin gebunden sind. Für die Transkription muss die DNA eine Bindungsstelle für eine RNA-Polymerase, einen sogenannten Promotor, enthalten. Bei einem Promotor handelt es sich um eine bestimmte Basenabfolge, an die sich die RNA-Polymerase zu Beginn der Transkription spezifisch anlagert, und die ca. 10 Nukleotide oberhalb der abzulesenden Region liegt. Die DNA wird als Insert in einen Vektor kloniert. Die multiple Klonierungssequenz, also die Region, in die das Insert eingefügt wird, wird im verwendeten Vektor (pGEM-T, PROMEGA,
Mannheim) von den Promotoren zweier Bakteriophagen-RNA-Polymerasen flankiert.
In diesem Falle liegt dabei „links“ des Inserts der Promotor für die T7-RNA- Polymerase und „rechts“ des Inserts der Promotor für die SP6-RNA-Polymerase. Die Abb. 2 zeigt eine Karte des pGEM-T-Vektors.
Abb. 2: Schematische Übersicht des pGEM-T-Vektors mit Lokalisation des Inserts, der Schnittstellen der verwendeten Restriktionsendonukleasen, Lage der Promotoren der RNA-Polymerasen T7 und SP6, Lage des ββ-Galaktosidase-Gens und Lokalisation der Ampicillin (Ampi)-Resistenz.
Die Verwendung dieses Vektors ermöglicht bei Verwendung der entsprechenden RNA-Polymerase durch in vitro-Transkriptionsreaktionen RNA-Sonden gegen- sätzlicher Orientierung herzustellen. Dabei wird die RNA-Sonde, die komplementär zur mRNA im Gewebe ist und damit die zu testende Sonde darstellt, als „antisense“
(as) und die Sonde, die der mRNA entspricht und daher die Negativkontrolle ist, als
„sense“ (s) bezeichnet. Um zu vermeiden, dass RNA-Sonden erzeugt werden, die Vektorsequenzen enthalten, muss der Vektor dort, wo das künftige 3‘-Ende der RNA sein soll, mit einem Restriktionsenzym linearisiert werden.
Alternativ kann ein Transkriptionstemplate über eine Polymerase Kettenreaktion hergestellt werden. Einer der Primer muss die Sequenz des Promotors einer RNA- Polymerase enthalten.
Sph I
p-GEM-T®
4000 bps 1000
2000 3000
4000 Nco I
Sal I Nsi I Insert
Vektor
SP6-Polymerase Galaktosidase I Ampi-Resistenz
T7-Polymerase
Galaktosidase II
2.1.2.1 RNA-Sondenherstellung von Plasmiden
Reverse Transkription (RT)
Um nachzuweisen, dass in dem Gewebe, aus dem RNA extrahiert wurde, ein bestimmtes Gen abgelesen wird und damit auch ein bestimmtes Protein produziert werden kann, wird die mRNA dieses Gens zunächst in DNA (cDNA) umgeschrieben.
Dieser Vorgang wird RT genannt. Die Reverse Transkriptase, ein Enzym, das aus Retroviren isoliert oder rekombinant hergestellt wird (KOTEWICZ et al., 1985), stellt eine RNA-abhängige DNA-Polymerase dar. Sie synthetisiert entlang einer RNA- Matritze einen cDNA-Strang. Dazu benötigt sie den as-Primer, ein Oligonukleotid, das komplementär zu der mRNA dieses Gens im Gewebe bzw. in der extrahierten Gesamt-RNA ist. Der Primer lagert sich an die entsprechende Ziel-mRNA spezifisch an und wird von der Reversen Transkriptase zu einem cDNA-Strang verlängert.
Anschließend kann die entstandene cDNA mittels PCR (s.u.) amplifiziert werden.
Für jeden der interessierenden Rezeptorsubtypen wurde für die PCR unter Zuhilfenahme der veröffentlichten Sequenzen (siehe Kapitel 8.5) ein geeignetes Primerpaar ausgesucht und für die RT jeweils der as-Primer verwendet. Das Primerpaar umschließt jeweils die Region der DNA-Sequenz, die amplifiziert werden soll, wobei der as-Primer am 3‘-Ende und der s-Primer am 5‘-Ende dieser Sequenz liegt. Der as-Primer ist komplementär zu der nativen mRNA und der s-Primer zu der in der RT entstehenden cDNA. Da das Enzym Reverse Transkriptase am 3‘-Ende des Primers anfängt zu lesen, sollte auch die Passform des Primers am 3‘ Ende besonders gut sein. Es wurde darauf geachtet, dass das 3‘-Ende einen höheren GC- Anteil und das 5‘-Ende einen höheren AT-Anteil aufweist. Insgesamt sollte der Primer ca. 18-30 bp lang sein und der GC-Gehalt sollte zwischen 50 und 60 % liegen. Die optimale Anlagerungstemperatur der Primer sollte zwischen 55 und 80°C liegen. Die Primer dürfen keine Sekundärstrukturen wie z. B. Haarnadelstrukturen bilden und auch nicht miteinander hybridisieren (FLACH et al. 1994). Die Primer umschließen eine für den jeweiligen Rezeptor-Subtyp spezifische DNA-Sequenz, die ein ausgewogenes GC:AT-Verhältnis hat. Die jeweiligen Regionen werden in der Tab. 2 aufgeführt:
Rezeptor-Subtyp Länge PCR-Produkt Lokalisation im Protein bzw.
Auswahlkriterium der Sequenz
α1A 199 3. cytoplasmatische Schleife
α1A 299 1. cytoplasmatische Schleife bis 4.
transmembrane Region α1A 1275 1. cytoplasmatische Schleife bis
cytoplasmatischer Schwanz α2B 296 stark homologe Region der bekannten
bovinen Sequenz mit der der Ratte
β2 351 3. cytoplasmatische Schleife bis
cytoplasmatischer Schwanz
β2 792 3. transmembrane Region bis
cytoplasmatischer Schwanz
Tab. 2: Länge der PCR-Produkte und deren Lokalisation im Protein der ausgewählten adrenergen Rezeptoren (SCHWINN et al., 1990, MATSUI et al. 1989, JOHNSON, 1998).
Die Sequenzen der Rezeptor-Subtypen sind mit Markierung der Primer im Anhang unter 8.5 aufgeführt.
Die Primer (LIFE TECHNOLOGIES, Karlsruhe) wurden in einer Konzentration von 100 pmol/µl in DEPC-behandeltem Wasser gelöst. In der RT und der PCR wurden die Primer in einer Konzentration von 50 pmol/µl eingesetzt. Die as-Primer sind im Folgenden aufgelistet:
Rezeptor Primername Primer α1A a1cas 5‘-GGA GAT GAC CAA AGA GAG C-3‘
aka1c1as 5‘-GCG GGA GAA TTC GAG CAG TCT CAC GG-3‘
aka1c2as 5‘-GAG TGG GTA CCT AAG ATC ACC CTC CCA TC-3‘
α2B a2bas 5‘-TAC CAG GCC TCT TGG TTG AGC T-3‘
β2 b2as 5‘-CCA GGT GAT ATC CAC TCT GTT C-3‘
Bei der RT wurde native mRNA mit Superscript (LIFE TECHNOLOGIES, Karlsruhe), einer Reversen Transkriptase, in cDNA umgeschrieben. In der RT wurde 1 µg Gesamt-RNA in einer Konzentration von 0,1 µg/µl (mit DEPC-behandeltem Wasser
verdünnt) eingesetzt. Zur Linearisierung der mRNA wurde diese Verdünnung 5 min bei 65°C inkubiert und bis zum Einsatz kurzfristig auf Eis gelagert.
Für die RT wurden folgende Reagenzien pipettiert:
10 µl Gesamt-RNA in Wasser (entspricht 1 µg Gesamt-RNA) 5,5 µl DEPC-behandeltes Wasser
0,5 µl 50 U RNase-Inhibitor/µl 5,0 µl 5 x First Strand Buffer 2,5 µl 0,1 M DTT
0,5 µl 50 pmol Primer as/µl 0,5 µl 100 mM dNTPs 0,5 µl 200 U Superscript/µl
Für die Reaktion wurde der Ansatz 1-2 h bei 42°C im Trio-Thermocycler V2.23 (BIOMETRA, Göttingen) inkubiert. Nach Abschluss der Reaktion wurde das Produkt direkt in einer PCR weiterverwendet oder bis zum weiteren Gebrauch bei –20°C gelagert.
Polymerase Kettenreaktion
Die PCR ermöglicht es, einen bestimmten Abschnitt eines DNA-Moleküls, wie z.B.
die cDNA aus einer RT, in vitro enzymatisch zu amplifizieren (MULLIS et al., 1986).
Die dazu verwendeten Enzyme sind thermostabile DNA-Polymerasen wie z.B. die Taq-Polymerase aus dem Bakterium Thermus aquaticus (SAIKI et al., 1988). Die PCR besteht aus sich wiederholenden Zyklen mit den folgenden Reaktionsschritten:
Denaturierung: Die DNA wird auf 94°C erhitzt, wodurch sich der Doppelstrang in Einzelstränge teilt.
Primeranlagerung: Die Primer hybridisieren bei einer für jedes Primerpaar spezifischen Temperatur mit der einzelsträngigen DNA.
Kettenverlängerung: Bei 72°C, der Optimaltemperatur für die Taq Polymerase, werden die Primer am 3‘-Ende verlängert, so dass neue doppelsträngige DNA-Moleküle entstehen.
Für die PCR wurde jeweils das Produkt aus der RT als Ausgangs-cDNA verwendet.
Es wurde zusätzlich zum as-Primer der s-Primer benötigt. Die s-Primer sind im Folgenden aufgelistet:
Rezeptor Primername Primer
α1A a1cs 5‘-CGG TCA CAC ACT ACT ACA TCG-3‘
aka1c1s 5‘-CCT GGC CAT GGA CTG CCG GGT CTA CG-3‘
aka1c2s 5‘-GCT CCA GTC AAG AAT TCA AAA AGG CC-3‘
α2B a2bs 5‘-TTG CTG GGC TAC TGG TAC TTC-3‘
β2 b2s 5‘-GAC AAC GCA GGA CCT CCA AG-3‘
b2s2 5‘-ACT TCC ATT GAC GTG TTA TGC G-3‘
Die einzelnen Reagenzien wurden in folgenden Mengen pipettiert:
10 µl DNA-Template 5,0 µl 10 x PCR-Puffer 0,5 µl 100 mM dNTPs 0,5 µl 50 pmol Primer as/µl 0,5 µl 50 pmol Primer s/µl 32,0 µl Wasser
1,5 µl 50 mM MgCl2
0,2 µl 5 U Taq Polymerase/µl
Abschließend wurde der Ansatz mit Mineralöl überschichtet, um die Verdunstung von Flüssigkeit zu verhindern, und das Gefäß in den auf 94°C vorgeheizten Thermo- cycler gesteckt. Dann wurde im Thermocycler das folgende PCR-Programm ge- startet:
94°C = Denaturierung der DNA-Stränge 5 min 94°C = Denaturierung der DNA-Stränge 40 sec
x°C = Anlagerung der Primer bei Optimaltemperatur 40 sec 32 Zyklen 72°C = Kettenverlängerung durch Polymerase 40 sec
72°C = Kettenabschluss 5 min
Die Anlagerungstemperatur der Primer wurde je nach Primerpaar variiert, bis die optimale Temperatur gefunden wurde. Die Temperatur für den Kettenaufbau durch die Polymerase wurde bei den längeren PCR-Produkten, d.h. ab 792 bp, für 60 sec
gehalten. Nach dem Abpipettieren des Mineralöls wurde das entstandene PCR- Produkt direkt in der Elektrophorese (s.u.) getestet oder bei –20°C gelagert.
Für die PCR des 1275 bp langen Fragmentes des α1A-Rezeptors konnte als DNA- Template das Plasmid pBCα1Cbov verwendet werden, in dem die komplette Sequenz des bovinen α1A-Rezeptors kloniert ist. Das Plasmid wurde freundlicherweise von Dr. R. J. Lefkowitz, Duke University Medical Center, Durham, North Carolina, USA zur Verfügung gestellt. Es wurde in einer Verdünnung von 1:50.000 der Plasmidpräparation für die PCR eingesetzt.
Die optimalen Anlagerungstemperaturen der Primer während der PCR und die Längen der PCR-Produkte sind in Tab. 3 zusammengefasst.
Rezeptor α1A α1A α1A α2B β2 β2
Primerkombination a1cs/
a1cas
aka1c1s/
aka1c1as
a1cs/
aka1c2as
a2bs/
a2bas
b2s/
b2as
b2s2/
b2as
Anlagerungstemperatur 58°C 63°C 60°C 65°C 63°C 60°C
Länge der PCR-Produkte
[bp] 299 199 1275 296 351 792
Tab. 3: Optimale Anlagerungstemperaturen der Primer bzw. Primerkombinationen und Länge der entstehenden PCR-Produkte der ausgewählten adrenergen Rezeptoren.
Elektrophoretischer Nachweis des PCR-Produktes
Die PCR-Produkte wurden in einem 2 %igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Bei der Elektrophorese wird die Polarität der Nukleinsäuren genutzt. Da die Phosphatgruppen der Nukleinsäuren als Protonendonatoren dienen, sind DNA und RNA negativ geladen. Im elektrischen Feld wandern sie daher Richtung Anode.
Im Agarosegel werden lineare DNA-Fragmente ihrer Größe nach separiert, da die Poren der Siebstruktur der Agarose kleinen Fragmenten weniger Widerstand leisten.
Das verwendete Agarosegel enthielt 2 µg Ethidiumbromid/ml. Die Agarose wurde in TBE-Puffer gekocht und als Laufpuffer diente ebenfalls TBE-Puffer. Zur Abschätzung der Länge der DNA-Fragmente wurde zusätzlich der DNA-Längenmarker Low DNA Mass Ladder (LIFE TECHNOLOGIES, Karlsruhe) aufgetragen. Das Auftragen des Markers und der Proben erfolgte mit 5 x TBE-Ladepuffer. Die Elektrophorese erfolgte bei 80 V für 2 bis 3 h. Die Abb. 3 zeigt ein Photo einer Elektrophorese am Beispiel der PCR für den Nachweis des Fragmentes der Primerkombination a1cs/aka1c2as
des α1A-Rezeptors, das mit dem Scanner Fluor Imager SI, aufgenommen wurde. Die Anregung im Fluor Imager SI (MOLECULAR DYNAMICS, Braunschweig) erfolgte bei 488 nm.
Abb. 3: Elektrophoretischer Nachweis eines PCR-Produktes am Beispiel der PCR für den Nachweis des Fragmentes der Primerkombination a1cs/aka1c2as des αα1A-Rezeptors.
Ligation des PCR-Produktes in das Plasmid pGEM-T
Für die Ligation des PCR-Produktes in das Plasmid pGEM-T musste das PCR- Produkt in gereinigter Form vorliegen. Dazu wurde nach der Elektrophorese in einem 0,8 %igen Agarosegel die entsprechende Bande, die mit UV-Licht sichtbar gemacht wurde, mit einem sterilen Skalpell ausgeschnitten und die DNA mittels Ultrafree-DA (MILLIPORE, Eschborn) aus dem Gel gelöst. Das Ausschneiden der Bande wurde durch die Anfertigung eines Photos kontrolliert und dokumentiert. In der Abb. 4 ist als Beispiel ein Agarosegel nach dem Ausschneiden der Bande des PCR-Produktes des α1A-Rezeptors dargestellt.
Die so erhaltenen reinen PCR-Produkte dienten direkt als Insert für die Ligation (HOLTON und GRAHAM, 1991, MARCHUK et al., 1991, MEAD et al., 1991). Der Ansatz für die Ligation setzte sich nach der Gebrauchsanweisung für das pGEM-T Vector System II folgendermaßen zusammen:
2000 bp → 1200 bp → 800 bp → 400 bp → 200 bp → 100 bp →
1 2
← 1275 bp
1 = Low DNA Mass Ladder 2 = PCR-Produkt
Primerkombination a1cs/aka1c2as
5 µl 2 x Ligationspuffer 1 µl 50 ng pGEM-T/µl
x µl PCR-Produkt
1 µl T4 DNA Ligase (3 U)
mit DEPC-behandeltem Wasser ad 10 µl
Dabei berechnete sich die Menge an eingesetztem PCR-Produkt nach folgender Formel entsprechend der Gebrauchsanweisung für das pGEM-T Vector System II:
Vektor [ng] • Größe des Inserts [kb]
--- • molares Verhältnis Insert:Vektor = Insert [ng];
Größe des Vektors [kb]
Die Reaktion fand über Nacht bei 4°C statt.
Abb. 4: Agarosegel nach Ausschneiden der Bande eines PCR-Produktes für eine Ligation am Beispiel der Primerkombination des αα1A-Rezeptors.
Transformation des Plasmides in Bakterien des Stammes E. coli JM109
Zur Transformation des bei der Ligation hergestellten Plasmides (COHEN et al., 1972) in Bakterien des Stammes E. coli JM109 wurden 2 µl des Ligationsproduktes auf den Boden eines sterilen 15 ml-Röhrchens verbracht. Dann wurden die kompetenten Zellen auf Eis aufgetaut und vorsichtig gemischt. 50 µl der Zellen wurden zu dem Ligationsprodukt pipettiert, vorsichtig gemischt und 20 min auf Eis inkubiert. Anschließend folgte eine Inkubation bei 42°C für 45-50 sec und eine auf
1 2
←1275 bp 2000 bp →
1200 bp → 800 bp →
400 bp → 200 bp →
1 = Low DNA Mass Ladder
2 = PCR-Produkt, Primerkombination a1cs/aka1c2as
Eis für 2 min. Danach wurden 950 µl modifiziertes, auf Raumtemperatur gebrachtes LB-Medium (siehe Anhang) zu dem Ansatz gegeben und dieser bei 37°C 90 min auf dem Schüttler inkubiert. Danach wurde das Medium in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß abgegossen und 5 min bei 5.000 g zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand bis auf einen Tropfen abgegossen, das Pellet vorsichtig in diesem Tropfen resuspendiert und die entstandene Suspension unter sterilen Bedingungen auf einer Standard II-Agarplatte, die Ampicillin enthielt, ausgestrichen. Die Agarplatte wurde zuvor für die sogenannte Blau-Weiß-Selektion präpariert, indem 25 µl 100 mM X-Gal, 90 µl Wasser und 10 µl 10 %iges IPTG auf ihr ausgestrichen wurden und eine Inkubation von 30 min bei 37°C folgte. Die präparierten Agarplatten wurden anschließend über Nacht bei 37°C inkubiert.
Erfolgskontrolle von Ligation und Transformation
Der Erfolg von Ligation und Transformation konnte durch die sogenannte Blau-Weiß- Selektion, Plasmidpräparation (Miniprep) mit anschließender Restriktionsanalyse und PCR kontrolliert werden. Auf den Standard II-Agarplatten konnten nur Bakterien wachsen, die bei der Transformation ein Plasmid aufgenommen hatten, da auf dem pGEM-T-Vektor die Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Ampicillin verankert ist und der Standard II-Agar Ampicillin enthielt (SARIS und PAULIN, 1990).
Die sogenannte Blau-Weiß-Selektion (RÜTHER et al., 1981) gab Auskunft, ob die JM109-Zellen bei der Transformation ein Plasmid mit oder ohne Insert aufgenommen hatten. Bei der erfolgreichen Klonierung eines Inserts in den pGEM-T-Vektor wurde dessen codierende Sequenz für die β-Galaktosidase unterbrochen, so dass die Zelle, die diesen Vektor aufgenommen hatte, das Enzym nicht herstellen konnte. Die β- Galaktosidase setzt das Substrat X-Gal mit dem Inducer IPTG zu einem blauen Farbstoff um. Kolonien, die das Insert beinhalteten, wuchsen farblos und Kolonien, die das Insert nicht enthielten, waren blau.
Für die Plasmidpräparation (BIRNBOIM und DOLY, 1979), die eine Reinigung der Plasmide aus den Bakterien darstellt, wurde je eine farblose Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher von der Agarplatte gepickt, 3 ml LB-Medium mit 100 µg Ampicillin/µl mit der Kolonie beimpft und über Nacht bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde je 1 ml Bakterienkultur 1 min bei 13.000 g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das entstandene Pellet wurde vorsichtig in 100 µl Miniprep-Puffer 1, dem
10 µg RNase A zugefügt worden waren, resuspendiert. Danach wurden 100 µl Miniprep-Puffer 2 zugegeben, das Gemisch dreimal geschwenkt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von 100 µl Miniprep-Puffer 3 wurde das Gemisch erneut dreimal geschwenkt und 15 min bei 13.000 g zentrifugiert. Der klare Überstand wurde in ein steriles Reaktionsgefäß überführt und zur Präzipitation mit 600 µl 100 %igem Ethanol gemischt. Nach einer halben Stunde Inkubation bei –20°C wurde 20 min bei 14.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig entfernt und das entstandene Pellet zweimal mit 70 %igem Ethanol gewaschen. Anschließend wurde es bei Raumtemperatur getrocknet und in 20 µl DEPC-behandeltem Wasser aufgelöst.
Als Kontrolle wurde eine Restriktionsanalyse angeschlossen. Dazu wurde eine Restriktionsendonuklease bzw. eine Enzymkombination ausgewählt, die bei einer Restriktionsverdauung mit dem jeweiligen Insert im Vektor charakteristische Banden im Agarosegel ergeben.
Der Ansatz für eine Restriktionsanalyse setzte sich folgendermaßen zusammen:
1 µl Plasmidpräparation
1 µl Enzym ([U] je nach Enzym unterschiedlich)
1 µl 10 x Optimalpuffer zu dem jeweiligen Enzym (siehe Tab. 13, Kapitel 8.6) 7 µl DEPC-behandeltes Wasser
Zur Veranschaulichung des Ergebnisses einer solchen Restriktionsanalyse ist in Abb. 5 beispielhaft die Verdauung der Plasmide der Klone 14-17 dargestellt, in denen sich das Insert der Primerkombination a1cs/aka1c2as befindet. Der Verdau wurde mit Pst I in Puffer H durchgeführt.
Die Ausrichtung des Inserts im Plasmid konnte nach der Elektrophorese folgendermaßen festgestellt werden: Das Restriktionsenzym Pst I schneidet das Insert am Rand, so dass je nach Ausrichtung ein größeres Fragment von 989 bp oder ein kleineres Fragment von 328 bp und der Rest des mit Vektors 3.286 bzw.
3.947 bp entstehen. Das Enzym besitzt jeweils eine singuläre Schnittstelle im Insert sowie im Vektor. Die Abb. 6 veranschaulicht dies.
Abb. 5: Elektrophoretische Kontrolle einer Restriktionsanalyse am Beispiel des Verdaus der Plasmide der Klone 14-17, in denen sich als Insert das PCR-Produkt der Primerkombination a1cs/aka1c2as befindet, Verdau mit Pst I.
A B
Abb. 6: Bild A und Bild B, Möglichkeiten der Ausrichtung eines Inserts im pGEM-T-Vektor am Beispiel des PCR-Produktes der Primerkombination a1cs/aka1c2as mit Angabe des Produktes einer Restriktionsanalyse mit Pst I.
Aufgrund des Ergebnisses aus der Elektrophorese in Abb. 5 konnte darauf geschlossen werden, dass das Insert in den Vektoren 14-17 wie im Bild A in der Abb. 6 im Vektor ausgerichtet ist.
Im Anschluss konnte mit den gereinigten Plasmiden eine PCR durchgeführt werden, bei der die gleichen Primer verwendet wurden, wie bei der PCR für die Ligation.
Dazu wurde 1 µl DNA in 10 µl DEPC-behandeltem Wasser als DNA-Matritze
pGEM-T® mit Alpha 1A 4275 bps 1000
2000 3000
4000
PstI, 1019
PstI, 1347 Insert 1275 bp
Produkt 328 bp
pGEM-T® mit Alpha 1A 4275 bps 1000
2000 3000
4000
PstI, 358
PstI, 1347 Produkt 989 bp
Insert 1275 bp 1 2 3 4 5
2000 bp → 1200 bp → 800 bp → 400 bp → 200 bp →
← 3947 bp
← 328 bp
1 = Low DNA Mass Ladder 2 = Produkte Verdauung Klon 14 3 = Produkte Verdauung Klon 15 4 = Produkte Verdauung Klon 16 5 = Produkte Verdauung Klon 17
eingesetzt. Das Produkt aus der PCR wurde anschließend im Agarosegel beurteilt.
Als Beispiel dafür dient die Abb. 7, in der die Produkte aus der Kontroll-PCR der Klone 14-17 im Gel dargestellt sind. In die Klone 14-17 wurde als Insert das Fragment der Primerkombination a1cs/aka1c2as mit der Länge 1275 bp eingefügt.
Abb. 7: Elektrophoretische Überprüfung der Kontroll-PCR der Klone 14-17 mit der Primerkombination a1cs/aka1c2as, Länge des PCR-Produktes 1275 bp.
Auch aufgrund der Kontroll-PCR konnte somit darauf geschlossen werden, dass sich das erwünschte Insert in den Vektoren der Klone 14-17 befand.
Sequenzierung des Inserts im Plasmid
Um sicherzugehen, dass die Längen und die Sequenzen der Inserts den erwünschten entsprechen, wurde an den unterschiedlichen Vektoren mit Inserts der unterschiedlichen Rezeptoren bzw. an deren PCR-Produkten Sequenzierungen durchgeführt. Dies ist wichtig für die RNA-Sondenherstellung durch Transkription an den Plasmiden, da die Sonden möglichst komplementär zu der mRNA im Gewebe sein müssen, um spezifisch zu binden. Die Sequenzierung wurde von dem PHAMISS DNA Sequencing Service im Institut für Mikrobiologie und Biotechnologie, Abteilung Pharmazeutische Mikrobiologie der Universität Bonn, übernommen. In der Abteilung wurde mit dem Kettenabbruchverfahren nach SANGER et al. (1977) gearbeitet. Es konnten jeweils Sequenzen bis zu einigen hundert Basen sequenziert werden.
2000 bp → 1200 bp → 800 bp → 400 bp → 200 bp → 100 bp →
1 2 3 4 5
← 1275 bp
1 = Low DNA Mass Ladder 2 = PCR Klon 14 a1cs/aka1c2as 3 = PCR Klon 15 a1cs/aka1c2as 4 = PCR Klon 16 a1cs/aka1c2as 5 = PCR Klon 17 a1cs/aka1c2as
Homologievergleich der ermittelten Sequenzen mit den puplizierten
Der Homologievergleich der Ergebnisse der Sequenzierung mit den bovinen Sequenzen (siehe Anhang) wurde mit dem Programm DNASIS v2.6 (HITACHI SOFTWARE ENGINEERING Co, San Francisco, CA, USA) durchgeführt. Alle Klone, deren Insert im Vektor sequenziert wurde, zeigten eine 98-100%ige Übereinstimmung mit den bovinen Sequenzen. In der Tab. 4 werden die unterschiedlichen geprüften und sequenzierten Klone mit dem jeweiligen Insert aufgeführt, wobei die Klone 18 und 20 jeweils einen Teil der Sequenz des bovinen αS1-Caseins enthalten. Diese Plasmide wurden freundlicherweise von Herrn PD Dr.
Hans-Martin Seyfert, Forschungsinstitut für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere, Dummerstorf, zur Verfügung gestellt.
Rezeptor α1A β2 α1A -- --
Name Insert aka1c1s/
aka1c1as
b2s/
as
a1cs/
aka1c2as Casein as Casein s
Länge Insert [bp] 199 351 1275 ca. 750 ca. 850
Name Klon Klon 2 Klon 7 Klon 14 Klon 18 Klon 20
Tab. 4: Bezeichnungen der sequenzierten und geprüften Klone mit den Bezeichnungen der enthaltenen Inserts, deren Längen und der entsprechenden Rezeptorbezeichnung.
In-vitro Transkription
Für die Linearisierung des pGEM-T-Vektors zur in-vitro Transkription eignen sich die Restriktionsendonukleasen Nsi I und Sal I für die Transkription mit der T7-RNA- Polymerase und die Restriktionsendonukleasen Nco I und Sph I für die Transkription mit der SP6-RNA-Polymerase. Die Klone 18 und 20 wurden mit dem Enzym Pst I linearisiert. Die anschließende Transkription fand mit der T7-Polymerase statt.
Ähnlich wie bei der RNA wird auch die Konzentration der DNA im Photometer bestimmt. Eine E260 nm-Einheit entspricht dabei einer Konzentration von 50 µg/ml DNA. Der Ansatz für die Linearisierung setzte sich folgendermaßen zusammen:
x µl Plasmid-DNA (5 µg) 5 µl 10 x Puffer
x µl Enzym
mit DEPC-behandeltem Wasser ad 50 µl
Die eingesetzte Menge des Enzyms berechnete sich nach folgender Formel (SAMBROOK et al., 1989):
50 • N
RE [U] = --- • µg DNA;
cλ • L
wobei RE = die Menge an eingesetztem Restriktionsenzym ist, N = die Anzahl der Schnittstellen, L = die Größe des Plasmids in kb und cλ = eine enzymspezifische Konstante darstellt. Die cλ-Werte der einzelnen Enzyme, die jeweils dazugehörigen Optimalpuffer und die optimalen Reaktionstemperaturen der Enzyme sind nach den Herstellerangaben von BOEHRINGER, Mannheim, in Tab. 13 im Kapitel 8.6 aufgeführt.
Der Linearisierungsansatz wurde 2 h bei 37°C inkubiert. Danach wurde die DNA mit einer Phenol-Chloroform-Extraktion gereinigt. Dafür musste der Ansatz 1:1 mit Phenol-Chloroform versetzt werden. Es wurde gemischt und 3 min bei 14.000 g zentrifugiert. Danach wurde die obere Schicht in ein steriles Gefäß überführt, mit 1/10 Volumen 4 M NaCl und dem 2,5fachen Volumen eiskaltem 100 %igem Ethanol versetzt und 2 h bei –20°C gefällt. Anschließend wurde 30 min bei 14.000 g zentrifugiert. Das Pellet wurde zweimal mit 70 %igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 11 µl DEPC-behandeltem Wasser aufgelöst. Zur Kontrolle der Linearisierung wurde eine Gelelektrophorese mit 1 µl des Ansatzes durchgeführt (siehe Abb. 8). Als Beispiel ist die Linearisierung des Klons 14 mit den Enzymen Nsi I und Sph I abgebildet. In Tab. 5 ist aufgeführt, welche RNA-Polymerase die as- bzw.
die s-Sonde herstellt.
Klon 2 7 14 18 20
Protein α1A 199 bp β2 351 bp α1A 1275 bp Casein ca. 750 bp Casein ca. 850 bp T7-Polymerase as-Sonde as-Sonde s-Sonde as-Sonde s-Sonde
SP6-Polymerase s-Sonde s-Sonde as-Sonde -- --
Tab. 5: Auflistung, mit welcher RNA-Polymerase bei der Transkription der verwendeten Klone die as- bzw. die s-Sonde hergestellt werden.
Abb. 8: Elektrophoretische Kontrolle der Linearisierung der Vektoren für die Transkription.
Für die Transkription, d.h. die Herstellung markierter RNA, wurden entweder mit Dig oder mit Biotin markierte Nukleosidtriphosphate (NTPs) verwendet. Im NTP- Markierungsgemisch war jedes 20. bis 25. UTP mit Dig bzw. Biotin markiert (Dig RNA Markierungs-Kit, Biotin RNA Markierungs-Mix, ROCHE, Mannheim). Der Ansatz der Transkription setzte sich aus den Komponenten des Dig RNA Markierungs-Kits laut Herstellerangaben folgendermaßen zusammen:
x µl DEPC-behandeltes Wasser 2 µl NTP-Markierungsgemisch 2 µl 10 x Transkriptionspuffer 2 µl RNase-Inhibitor
mit DNA-Lösung (1 µg) ad 18 µl 2 µl RNA-Polymerase
Dabei musste streng die angegebene Reihenfolge beachtet werden. Der Transkriptionspuffer musste zimmerwarm sein, da sonst durch das enthaltene Spermidin die DNA ausgefallen wäre. Der Ansatz wurde vorsichtig auf Eis gemischt und für die Reaktion mit der T7-RNA-Polymerase 2 h, für die Transkription mit der SP6-RNA-Polymerase 3 h bei 37°C inkubiert (MELTON et al.,1984).
Anschließend wurde die DNA mit Hilfe von 2 µl DNase I RNasefrei (10 U/µl) 15 min bei 37°C verdaut. Diese Reaktion wurde mit 2 µl 0,2 M EDTA-Lösung abgestoppt.
Anschließend wurde die markierte UTPs enthaltende RNA mit 2,2 µl 4 M LiCl und 75 µl 100 %igem Ethanol über Nacht bei –20°C präzipitiert, um Verunreinigungen wie
2000 bp → 1200 bp → 800 bp → 400 bp → 200 bp → 100 bp →
1 2 3
← 4275 bp
1 = Low DNA Mass Ladder
2 = Linearisierung mit Nsi I für die Transkription mit T7
3 = Linearisierung mit Sph I für die Transkription mit SP6
Salze und wasserlösliche Substanzen zu entfernen. Nach 30 min Zentrifugation bei 14.000 g und zweimaligem Waschen des entstandenen Pellets mit 70 %igem Ethanol wurde die markierte RNA-Sonde in 100 µl DEPC-behandeltem Wasser ge- löst, aliquotiert und bei –80°C gelagert.
Sollten die längeren Sonden (länger als 600 bp) in etwa 200 bp lange Fragmente zerkleinert werden, um in einer späteren In situ-Hybridisierung ein Eindringen der Sonden in die Zellen zu erleichtern, wurde eine alkalische Hydrolyse angeschlossen.
Dazu musste die RNA-Lösung mit der gleichen Menge Carbonatpuffer gemischt werden. Es folgte eine Inkubation bei 60°C, deren Dauer (t) sich nach folgender Formel (ANGERER et al., 1987) berechnete:
t = (Lo – Lf)/(k • Lo • Lf);
wobei Lo die Ursprungslänge des Transkriptes in kb, Lf die angestrebte Länge in kb und k eine Konstante von 0,11 darstellte. Der Ansatz wurde anschließend durch Zufügen folgender Reagenzien über Nacht präzipitiert:
6 µl 3 M NaAcetat 10 µl Eisessig
540 µl 100 %iges Ethanol.
Danach wurde bei 14.000 g zentrifugiert, das entstandene Pellet zweimal mit 70 %igem Ethanol gewaschen und die markierte RNA in 100 µl DEPC-behandeltem Wasser aufgelöst. Die RNA wurde aliquotiert und bei –80°C gelagert.
Quantifizierung der markierten RNA-Sonden mittels Dot-Blot
Für die Quantifizierung der markierten RNA-Sonden mittels Dot-Blot wurde eine Nitrozellulosemembran (SARTORIUS AG, Göttingen) auf die Größe einer Petrischale zurechtgeschnitten. Die Reaktionen fanden bei Raumtemperatur statt. Es wurden Verdünnungsreihen aus Dig-markierter Kontroll-RNA mit bekannter Konzentration von 100 ng/µl (Dig RNA Markierungs-Kit, ROCHE, Mannheim), aus der as-RNA- Sonde und der s-RNA-Sonde mit den Verdünnungsstufen 1, 1:5, 1:10, 1:20 und 1:40 angefertigt. Von jeder Verdünnungsstufe wurde jeweils 1 µl auf die Nitrozellulosemembran aufgetragen, die Tropfen getrocknet und die RNA 5 min unter UV-Licht auf der Membran fixiert. In der Petrischale wurde die Membran dann 1 min in Maleinsäure-Puffer (MA-Puffer) gewaschen und anschließend 30 min in MA-Puffer
mit 1 % Blocking-Reagenz (BOEHRINGER, Mannheim) abgesättigt. Es folgte ein kurzes Waschen in MA-Puffer und eine 30 minütige Inkubation mit dem entsprechenden Antikörper in MA-Puffer. Bei Dig-markierten Sonden wurde der Anti- Dig-AP Antikörper in einer Verdünnung von 1:5.000 und bei Biotin-markierten Sonden ein Streptavidin-POD (SA-POD) Konjugat in der Konzentration 200 ng/ml MA-Puffer eingesetzt. Anschließend wurde die Membran 2 min in ISH-Puffer 3 gewaschen. Für die Farbreaktion wurde die Membran in dem jeweiligen Farbreagenz an einem lichtgeschützten Ort inkubiert, bis eine deutliche Färbung sichtbar war. Für die Dig-markierten RNA-Sonden setzte sich das Farbreagenz aus 45 µl NBT- Stammlösung (75 mg/ml in 70 % Dimethylformamid) und 35 µl BCIP-Stammlösung (50 mg/ml in Dimethylformamid) in 10 ml ISH-Puffer 3 zusammen, während das Farbreagenz für die Biotin-markierten Sonden aus 10 µl H2O2 (30 %ig), 6 mg DAB, 200 µl CoCl2 (1 %ig) und 10 ml PBS bestand. Die Reaktion wurde mit einer zehnminütigen Inkubation in ISH-Puffer 4 bzw. mit Wasser abgestoppt, die Membran in Wasser gewaschen und luftgetrocknet. Anschließend konnten die Konzentrationen der einzelnen Sonden abgeschätzt werden. Dazu wurde die Farbintensität der Verdünnungsstufen der Sonden mit denen der markierten Kontroll-RNA (100 ng/µl) verglichen.
2.1.2.2 RNA-Sondenherstellung von PCR-Produkten
Für die Herstellung von RNA-Sonden aus PCR-Produkten wurde jeweils ein Primer in der PCR an seinem 5‘-Ende um die Sequenz des Promotors für die T7-RNA- Polymerase verlängert. Die Sequenz für den Promotor der T7-RNA-Polymerase lautet:
5‘-CCA AGC TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GA-3‘.
RT-PCR
Die RT-PCR für den α2B- und den β2-Rezeptor bzw. die PCR vom Plasmid für den α1A-Rezeptor fand unter den gleichen Bedingungen statt, wie unter 2.1.2.1 beschrieben. Es wurde jeweils ein Primer durch einen mit einem Promotor gekoppelten ersetzt, so dass von jedem Rezeptor zwei Primerpaare entstanden,
deren PCR-Produkte einmal für die Transkription der as-Sonde und einmal für die der s-Sonde verwendet werden konnten. Die Primer sind im Folgenden aufgelistet:
as-Primer:
Rezeptor Primername Primer α1A aka1c2as 5‘-GAG TGG GTA CCT AAG ATC ACC CTC CCA TC-3‘
a1cT7as 5‘-CCA AGC TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA
GAG AGT GGG TAC CTA AGA TCA CCC TCC CAT C-3‘
α2B a2bas 5‘-TAC CAG GCC TCT TGG TTG AGC T-3‘
a2bT7as 5‘-CCA AGC TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA
GAT ACC AGG CCT CTT GGT TGA GCT-3‘
β2 b2as 5‘-CCA GGT GAT ATC CAC TCT GTT C-3‘
b2T7as 5‘-CCA AGC TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA
GAC CAG GTG ATA TCC ACT CTG TTC-3‘
s-Primer:
Rezeptor Primername Primer
α1A a1cs 5‘-CGG TCA CAC ACT ACT ACA TCG-3‘
a1cT7s 5‘-CCA AGC TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC GGT CAC ACA CTA CTA CAT CG-3‘
α2B a2bs 5‘-TTG CTG GGC TAC TGG TAC TTC-3‘
a2bT7s 5‘-CCA AGC TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAT TGC TGG GCT ACT GGT ACT TC-3‘
β2 b2s2 5‘-ACT TCC ATT GAC GTG TTA TGC G-3‘
b2T7s 5‘-CCA AGC TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAA CTT CCA TTG ACG TGT TAT GCG-3‘
Die PCR wurde mit der gleichen Anlagerungstemperatur wie die PCR mit den Primern ohne Promotor durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden in einem 1 %igen Agarosegel elektrophoretisch getrennt. Die Längen der PCR-Produkte sind in Tab. 6 wiedergegeben.
Rezeptor α1A α2B β2
as-Primer aka1c2 as
a1cT7 as
aka1c2
as a2bas a2bT7
as a2bas b2as b2T7as b2as s-Primer a1cs a1cs a1cT7s a2bs a2bs a2bT7s b2s2 b2s2 b2T7s Länge PCR-
Produkt [bp] 1275 1307 1307 296 328 328 793 825 825
Sonde -- as s -- as s -- as s
Tab. 6: Längen der PCR-Produkte der ausgewählten Rezeptoren für die Herstellung von RNA Sonden von PCR-Produkten.
Abb. 9: Elektrophoretische Kontrolle der PCR für die Herstellung von RNA-Sonden aus PCR Produkten.
Die Abb. 9 stellt das Ergebnis der Kontrollelektrophorese der Primerpaare a1cs/a1cT7as und a1cT7s/aka1c2as dar.
Reinigung des PCR-Produktes
Für die Transkriptionsreaktion wurde das PCR-Produkt gereinigt, um Verunreinigungen wie Primer, Pufferbestandteile und Enzyme, die bei der Transkription stören würden, zu beseitigen. Dazu wurde eine Elektrophorese in einem 0,8 %igen Agarosegel durchgeführt und die entsprechende Bande über UV- Licht mit einer sterilen Skalpellklinge ausgeschnitten. Anschließend wurde die DNA aus dem Gel mit QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden) oder NucleoSpin Extract (MACHEREY-NAGEL, Düren) nach Herstelleranleitung extrahiert.
2000 bp → 1200 bp → 800 bp → 400 bp → 200 bp → 100 bp →
1 2 3
← 1307 bp
1 = Low DNA Mass Ladder 2 = Promotierung α1c T7AS 3 = Promotierung α1c T7S
Sequenzierung und Homologievergleich
Die PCR-Produkte, die jeweils an einem Ende einen Promotor enthielten, wurden ebenfalls von dem PHAMISS DNA Sequencing Service im Institut für Mikrobiologie und Biotechnologie, Abteilung Pharmazeutische Mikrobiologie der Universität Bonn, sequenziert. Der Homologievergleich der Ergebnisse der Sequenzierung mit den bovinen Sequenzen wurde mit dem Programm DNASIS v2.6 durchgeführt. Es konnte bei allen PCR-Produkten, die jeweils einen Promotor enthielten, eine 100 %ige Übereinstimmung erzielt werden.
In-vitro Transkription
Das gereinigte PCR-Produkt konnte direkt als Template in der in-vitro Transkription eingesetzt werden. Der Ansatz der Reaktion erfolgte wie bei der Transkription an Plasmiden (s. S. 33), wobei ebenfalls 1 µg DNA eingesetzt wurde. DNase-Verdau, Fällung der RNA-Sonden und alkalische Hydrolyse, sowie die Quantifizierung der markierten RNA-Sonden mittels Dot-Blot wurden analog durchgeführt.
2.1.3 Herstellung und radioaktive Markierung von RNA-Sonden
Die Arbeiten mit radioaktiv markierten Substanzen fanden im Kontrollbereich des Institutes für Physiologie, Biochemie und Hygiene der Tiere, Abteilung Biochemie, der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn mit der Genehmigungsnummer U 65/85 statt.
Die Vorbereitung der DNA für die Herstellung von radioaktiv markierten RNA-Sonden erfolgte wie unter 2.1.2.1 und 2.1.2.2 beschrieben. Dabei wurde die DNA für die αS1- Casein-Sonden wie bei der Herstellung von RNA-Sonden von Plasmiden und die DNA für die Sonden für die α1A-, α2B- und β2-adrenergen Rezeptoren wie bei der Herstellung von RNA-Sonden aus PCR-Produkten behandelt.
Die Transkription wurde mit dem RNA Markierungs-Kit für radioaktive Markierung von RNA-Sonden (AMERSHAM, Braunschweig) bei Raumtemperatur angesetzt, wobei entweder mit α-35S UTP oder mit α-33P UTP gearbeitet wurde. Die folgende Reihenfolge wurde eingehalten:
4 µl 5 x Transkriptionspuffer 1 µl 0,2 M DTT
1 µl 20 U RNase Inhibitor/µl 0,5 µl 20 mM GTP
0,5 µl 20 mM ATP 0,5 µl 20 mM CTP 1,0 µg DNA-Template 2,5 µl α-35S UTP bzw. 5 µl α-33P UTP
mit DEPC-behandeltem Wasser ad 18 µl 2 µl 10 U T7 RNA-Polymerase/µl
Der Ansatz wurde vorsichtig gemischt, kurz zentrifugiert und 2 h bei 37°C inkubiert.
Nach 1 h wurden 2 µl T7 RNA-Polymerase zugefügt, um die Sondenausbeute zu erhöhen.
Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden 2 µl des Ansatzes entnommen und 1:100 mit DEPC-behandeltem Wasser für den folgenden Inkorporationstest verdünnt. Von dieser Verdünnung wurden jeweils zweimal 2 µl auf ein DE81 Ionen- austauscherpapier (WHATMAN, Kent, UK) getropft. Die Tropfen wurden getrocknet und anschließend der radioaktive Zerfall in „counts per minute“ (cpm) in dem Szintillationscocktail Lumasafe plus (LUMAC-LSC, Groningen) mit dem Beta IV Liquid Scintillation Counter (KONTRON INSTRUMENTS) gemessen. Das Ergebnis dieser Messung entspricht der gesamten Menge an Radioaktivität. Es wurden weitere zweimal 2 µl der Verdünnung auf je ein DE81 Ionenaustauscherpapier getropft und getrocknet. Diese beiden Papiere wurden zweimal 5 min in 2 x SSC und anschließend 1 min in DEPC-behandeltem Wasser gewaschen. Es folgte ein einminütiger Waschschritt in 100 %igem Ethanol und Lufttrocknung. Dann wurden die beiden Papiere entsprechend im β-Counter gemessen. Das Ergebnis der Messung entspricht der inkorporierten Radioaktivität. Aus diesen beiden Messungen konnte anschließend der prozentuale Anteil der eingebauten radioaktiv markierten Nukleotide im Verhältnis zu den für die Transkription eingesetzten mit folgender Formel berechnet werden: