3 Ergebnisse zur Entwicklung der In situ-Hybridisierung
3.2 Radioaktive In situ-Hybridisierung
Nachweis der mRNA von ααS1-Casein in den Alveolarepithelien der Milchdrüse:
In situ-Hybridisierung von Gefrierschnitten der Milchdrüse mit 33P-markierten Sonden
Der Nachweis der mRNA von αS1-Casein in den Alveolarepithelien der Milchdrüse an Gefrierschnitten mit 33P-markierten Sonden fand nach dem im Folgenden aufgelisteten Protokoll statt. Die Vorbereitung der Schnitte für die Hybridisierung wurde im S 1-Labor durchgeführt und die anschließenden Schritte bis zur Gegen-färbung im Isotopenlabor. Die Gefrierschnitte für dieses Protokoll waren maximal zwei Tage alt.
Fixierung von Gefrierschnitten
• 30 min 37°C
• 60 min 4 %iges Paraformaldehyd
• 2 x 5 min 1 x PBS
Acetylierung
• 2 x 5 min 0,1 M Trietholamin-Lösung, pH 8,0, mit 0,25 % Acetanhydrid
Gewebepermeabilisierung
• 1 x 1 min 70 % Ethanol
• 1 x 1 min 80 % Ethanol
• 1 x 2 min 95 % Ethanol
• 1 x 2 min 100 % Ethanol
• 1 x 5 min 100 % Chloroform
• 1 x 1 min 100 % Ethanol
• 1 x 1 min 95 % Ethanol
• Objektträger lufttrocknen und Gewebeschnitte mit Pap Pen® umranden
Isotopenlabor
Hybridisierung mit der RNA-Sonde
• 2,4 x 105 cpm der Sonde pro 50 µl RISH-Hybridisierungsmix mit 0,1 M DTT
• 5 min bei 70°C
• Hybridisierung je Gewebeschnitt in 50 µl verdünnter Sonde mit Parafilm abgedeckt über Nacht bei 55°C in einer Feuchtkammer mit Wasser
Waschvorgang
• Entfernen des Parafilms
• 1 x 10 min 2 x SSC
• 1 x 30 min 2 x SSC + 5 mM DTT bei 45°C
RNase-Behandlung
• 1 x 30 min 20 µg/ml RNase A in 2 x SSC bei 37°C
• 4 x 15 min 2 x SSC bei 37°C
• 2 x 30 min 2 x SSC bei 52°C
• 2 x 15 min 0,2 x SSC
Autoradiographie
• 1 x 1 min 70 % Ethanol mit 0,3 M NH4Ac, pH 7,4
• 1 x 1 min 80 % Ethanol mit 0,3 M NH4Ac, pH 7,4
• 1 x 1 min 95 % Ethanol
• 1 x 5 min 100 % Ethanol
• Lufttrocknen der Objektträger Möglichkeit A:
• 5 Tage mit einem Gewebeschnitt je Mehrfachansatz Exposition eines Röntgenfilms
• 2 min Entwickler
• 10 sec Wasser
• 5 min Fixierer
• 2 min Wasser Möglichkeit B:
• 2 sec restliche Objektträger des Mehrfachansatzes in Autoradiographieemulsion NTB-2 tauchen
• 1 h Objektträger in einer möglichst vertikalen Position in absoluter Dunkelheit trocknen
• 8 Tage Exposition der Proben in mit Trockenperlen bestückten, lichtdichten Kunststoffgefäßen bei 4°C
• Objektträgerboxen 60 min bei Raumtemperatur vor Öffnen erwärmen lassen
• 4 min Entwickler D-19 (1:1)
• 10 sec Wasser
• 5 min Fixierer
• 30 min Wasser
Gegenfärbung
• 1–3 min Kresylviolett
• Waschen in Wasser
• 1 x 10 sec 95 % Ethanol
• 1 x 30 sec 95 % Ethanol + einige Tropfen Essigsäure
• 1 x 30 sec 100 % Ethanol
• 1 x 2 min Rothihistol®
• Eindecken mit Entellan
Die Abb. 14 bis 17 zeigen die Ergebnisse der radioaktiven In situ-Hybridisierungen von Milchdrüsengewebe des Rindes mit der αS1-Casein-Sonde. Es wird jeweils eine
Abb. der as- und der s-Sonde als Dunkelfeldbild und als Hellfeldbild dargestellt. Das Hellfeldbild dient der besseren Orientierung im Gewebeschnitt.
Abb. 14: Radioaktive In situ-Hybridisierung: Gewebe: Milchdrüse Rind, 200fache Vergrößerung, Sonde: ααS1-Casein as, Dunkelfeld.
Abb. 15: Radioaktive In situ-Hybridisierung: Gewebe: Milchdrüse Rind, 200fache Vergrößerung, Sonde: ααS1-Casein as, Hellfeld.
Es kann sehr deutlich das positive Signal der Hybridisierung mit der as-Sonde von dem negativen Signal mit der s-Sonde unterschieden werden. Das Signal ist gut von
dem leichten Hintergrundsignal zu unterscheiden. In der Abb. 16, der Darstellung der Hybridisierung mit der s-Sonde im Dunkelfeld, ist ausschließlich ein leichtes Hintergrundsignal zu sehen. In den Alveolarepithelien fehlt ein Signal.
Abb. 16: Radioaktive In situ-Hybridisierung: Gewebe: Milchdrüse Rind, 200fache Vergrößerung, Sonde: ααS1-Casein s, Dunkelfeld.
Abb. 17: Radioaktive In situ-Hybridisierung: Gewebe: Milchdrüse Rind, 200fache Vergrößerung, Sonde: ααS1-Casein s, Hellfeld.
Nachweis der mRNA der αα1A-, αα2B- und ββ2-adrenergen Rezeptoren: In situ-Hybridisierung von Gefrierschnitten der Milchdrüse, der Leber, der Niere und der Lunge mit 33P-markierten Sonden
Das Protokoll für den Nachweis der mRNA der α1A-, α2B- und β2-adrenergen Rezeptoren mit der In situ-Hybridisierung in Gefrierschnitten der Milchdrüse, der Leber, der Niere und der Lunge wurde analog dem für den Nachweis der mRNA von αS1-Casein in den Alveolarepithelien der Milchdrüse mit 33P-markierten Sonden mit geringfügigen Abwandlungen durchgeführt.
Von jeder as-Sonde wurde die nach der Transkription maximal mögliche Menge eingesetzt. Die Menge der s-Sonde wurde jeweils angeglichen. Die jeweils eingesetzte Menge an radioaktiver Aktivität ist in der Tab. 10 aufgeführt.
Sonde Menge der eingesetzten Aktivität [cpm]
α1Aas 4,6 • 105
α1As 4,6 • 105
α2Bas 1,2 • 105
α2Bs 1,2 • 105
β2as 5,0 • 105
β2s 5,0 • 105
Tab. 10: Menge der eingesetzten Aktivität der Sonden für die In situ-Hybridisierung der adrenergen Rezeptoren.
Die Objektträger der Mehrfachansätze wurden jeweils nach 4, 6, 10 oder 25 Wochen Exposition entwickelt und fixiert. Die In situ-Hybridisierung der Leber mit der Sonde für den α1A-Rezeptor ergab nach 68 Tagen Inkubation die besten Ergebnisse. Die Leberzellen zeigen nach der Hybridisierung mit der as-Sonde ein deutliches Signal, während in dem Kontrollgewebe, das mit der s-Sonde hybridisiert wurde, kein Signal entstand (Abb. 18-21).
Abb. 18: Radioaktive In situ-Hybridisierung: Gewebe: Leber Rind, 200fache Vergrößerung, Sonde: αα1A-adrenerger Rezeptor as, Dunkelfeld.
Abb. 19: Radioaktive In situ-Hybridisierung: Gewebe: Leber Rind, 200fache Vergrößerung, Sonde: αα1A-adrenerger Rezeptor as, Hellfeld.
Abb. 20: Radioaktive In situ-Hybridisierung: Gewebe: Leber Rind, 200fache Vergrößerung, Sonde: αα1A-adrenerger Rezeptor s, Dunkelfeld.
Abb. 21: Radioaktive In situ-Hybridisierung: Gewebe: Leber Rind, 200fache Vergrößerung, Sonde: αα1A-adrenerger Rezeptor s, Hellfeld.
Die Hybridisierung der Niere mit der α2B-Sonde ergab nach 64 Tagen das beste Signal-Hintergrundverhältnis.
Abb. 22: Radioaktive In situ-Hybridisierung: Gewebe: Niere Rind, Glomerulum (von Pfeilen eingerahmt), 200fache Vergrößerung, Sonde: αα2B-adrenerger Rezeptor as, Dunkelfeld.
Abb. 23: Radioaktive In situ-Hybridisierung: Gewebe: Niere Rind, Glomerulum (von Pfeilen eingerahmt), 200fache Vergrößerung, Sonde: αα2B-adrenerger Rezeptor as, Hellfeld.
In den Abb. 22 bis 25 ist ein Signal in einem Glomerulum (Abb. 22) im Vergleich zu der Negativ-Kontrolle (Abb. 24) dargestellt. Die Pfeile rahmen jeweils ein Glomerulum ein.
Abb. 24: Radioaktive In situ-Hybridisierung: Gewebe: Niere Rind, Glomerulum (von Pfeilen eingerahmt), 200fache Vergrößerung, Sonde: αα2B-adrenerger Rezeptor s, Dunkelfeld.
Abb. 25: Radioaktive In situ-Hybridisierung: Gewebe: Niere Rind, Glomerulum (von Pfeilen eingerahmt), 200fache Vergrößerung, Sonde: αα2B-adrenerger Rezeptor s, Hellfeld.
Es wurden in der radioaktiven In situ-Hybridisierung keine Unterschiede zwischen der as- und der s-Sonde bei dem α1A-Rezeptor in Niere, Lunge und Milchdrüse, bei dem α2B-Rezeptor in Leber, Lunge und Milchdrüse und bei dem β2-Rezeptor in allen getesteten Geweben deutlich. Die In situ-Hybridisierung dieser Rezeptoren in diesen Geweben hat ein negatives Ergebnis erbracht (Tab. 11).
Rezeptor Gewebe
Leber Niere Lunge Zitze Zisterne
α1A + - - -
α2B - + - -
β2 - - - -
Tab. 11: Auflistung der in der radioaktiven In situ-Hybridisierung getesteten adrenergen Rezeptoren; die Gewebe, an denen die Hybridisierungen jeweils durchgeführt wurden sind dunkelgrau unterlegt; + bedeutet positives Signal, - bedeutet kein Signal
Beispielhaft für die negativ verlaufenden Nachweise in der Milchdrüse (Zitze und Zisternenregion) und der Lunge sind in den Abb. 26 bis 29 die Fotos der Hybridisierung von Zitzengewebe mit der α1A-Sonde dargestellt. Die Autoradiographie wurde nach der Inkubation von 62 Tagen entwickelt. Die Pfeile markieren den Verlauf der glatten Muskulatur, in der ein Signal erwartet werden würde. Die Hintergrundfärbung ist sehr schwach, es kann jedoch kein Signal nach der Hybridisierung mit der as-Sonde im Vergleich zu der mit der s-Sonde unterschieden werden. Die anderen negativ verlaufenden In situ-Hybridisierungen mit den Sonden der adrenergen Rezeptoren sehen entweder ähnlich aus oder zeigen eine unspezifische Hintergrundfärbung.
Abb. 26: Radioaktive In situ-Hybridisierung: Gewebe: Zitze Rind (Verlauf der glatten Muskulatur mit Pfeilen eingerahmt), 200fache Vergrößerung, Sonde: αα1A-adrenerger Rezeptor as, Dunkelfeld.
Abb. 27: Radioaktive In situ-Hybridisierung: Gewebe: Zitze Rind (Verlauf der glatten Muskulatur mit Pfeilen eingerahmt), 200fache Vergrößerung, Sonde: αα1A-adrenerger Rezeptor as, Hellfeld.
Abb. 28: Radioaktive In situ-Hybridisierung: Gewebe: Zitze Rind (Verlauf der glatten Muskulatur mit Pfeilen eingerahmt), 200fache Vergrößerung, Sonde: αα1A-adrenerger Rezeptor s, Dunkelfeld.
Abb. 29: Radioaktive In situ-Hybridisierung: Gewebe: Zitze Rind (Verlauf der glatten Muskulatur mit Pfeilen eingerahmt), 200fache Vergrößerung, Sonde: αα1A-adrenerger Rezeptor s, Hellfeld.