2 Methodischer Teil
2.3 Entwicklung einer In situ-Hybridisierung mit radioaktiv
Die folgenden Schritte für die radioaktive In situ-Hybridisierung wurden in der Entwicklungsphase in unterschiedlichen Kombinationen angewendet. Bei Angaben
„x–y“ wurde je nach Versuch zwischen „x“ und „y“ variiert. Sämtliche Schritte der radioaktiven In situ-Hybridisierung wurden in gläsernen Färbeküvetten bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn keine andere Angabe erfolgt. Bei der radioaktiven In situ-Hybridisierung wurde jeweils ein doppelter (Casein) bzw.
fünffacher (adrenerge Rezeptoren) Ansatz durchgeführt.
2.3.1 Gewebevorbereitung
Die Gewebevorbereitung wurde auch bei der radioaktiven In situ-Hybridisierung aus den Gründen durchgeführt, die in dem Kapitel 2.2.1 zur Gewebevorbereitung für die nicht-radioaktive In situ-Hybridisierung beschrieben wurden.
Fixierung von Gefrierschnitten
Für die radioaktive In situ-Hybridisierung wurden die Gefrierschnitte, die höchstens zwei Tage alt waren, 20 min bei 37°C aufgetaut und getrocknet. Danach wurden sie 60 min in 4 %igem Paraformaldehyd fixiert und zweimal 5 min in 1 x PBS-Puffer gewaschen.
Acetylierung
Die Acetylierung wurde analog der Acetylierung bei der nicht-radioaktiven In situ-Hybridisierung wie unter 2.2.1 beschrieben durchgeführt.
Gewebepermeabilisierung
Für die Gewebepermeabilisierung wurden die Schnitte zunächst in einer aufsteigenden Ethanolreihe (70 % und 80 % je 1 min, 95 % und 100 % je 2 min) entwässert. Es folgte eine Permeabilisierung durch eine Inkubation in 100 %igem Chloroform von 5 min. Anschließend wurden die Schnitte 1 min in 100 %igem und 1 min in 95 %igem Ethanol inkubiert und luftgetrocknet. Die Schnitte wurden mit einem Silikonstift (Pap Pen®, ZYTOMED, Berlin) umrandet, um die Ausbreitung der Hybridisierungslösung auf den Gewebeschnitt zu begrenzen.
2.3.2 Hybridisierung
Die Hybridisierung bei der radioaktiven In situ-Hybridisierung wurde ohne Prähybridisierung durchgeführt, um eine Verdünnung der Sondenkonzentration durch Reste der Prähybridisierungslösung zu verhindern. Der RISH-Hybridisierungsmix wurde mit 0,1 M DDT versetzt und die Sonde mit der Aktivität von 2,4 - 10 x 105 cpm zugegeben. In Tab. 9 sind die in der radioaktiven In situ-Hybridisierung getesteten adrenergen Rezeptoren mit den jeweiligen Geweben, an denen die Hybridisierungen durchgeführt wurden, angegeben. Anschließend wurde die Sonde 5 min bei 70°C denaturiert und auf jeden Schnitt 50 µl aufgetragen. Die Schnitte wurden mit Parafilmluftblasenfrei abgedeckt und über Nacht bei 55°C oder 70°C hybridisiert.
Rezeptor Gewebe
Leber Niere Lunge Zitze Zisterne
α1A x x x x
α2B x x x x
β2 x x x x
Tab. 9: Auflistung der in der radioaktiven In situ-Hybridisierung getesteten adrenergen Rezeptoren mit Angabe der Gewebe, an denen die Hybridisierungen jeweils durchgeführt wurden
2.3.3 Posthybridisierungswaschen und RNase-Behandlung
Nach der Hybridisierung wurde der Parafilmentfernt und die Schnitte wurden 10 min in 2 x SSC gewaschen, um nicht gebundene und unspezifisch gebundene Sonden zu
entfernen. Es folgte ein weiterer Waschschritt von 30 min bei 45°C mit 2 x SSC, das 5 mM DTT enthielt.
Die anschließende RNase-Behandlung fand 30 min bei 37°C in 2 x SSC statt, das 20 mg/ml RNase A enthielt. Danach wurde 4 x 15 min bei 37°C in 2 x SSC gewaschen. Es folgten zwei Waschschritte von 30 min in 2 x SSC mit 50 % deionisiertem Formamid. Es wurde bei 3°C unter der Hybridisierungstemperatur bis 75°C gewaschen. Abschließend wurde 2 x 15 min bei Raumtemperatur in 0,2 x SSC gewaschen.
2.3.4 Autoradiographie
Die Autoradiographie dient dem empfindlichen Nachweis von radioaktiv markierten Nukleinsäuren. Sie beruht auf der Schwärzung eines Röntgenfilmes durch die energiereiche β- bzw. γ- Strahlung radioaktiver Proben. Dabei werden Silber-bromidkristalle in einem festen Röntgenfilm oder einer Autoradiographieemulsion in einen aktivierten Zustand versetzt und bei der anschließenden Entwicklung zu metallischem Silber reduziert. Das metallische Silber wird in Form von schwarzen Silberkörnern auf dem Film oder in dem Gewebeschnitt sichtbar. Die Beurteilung des bei der In situ-Hybridisierung entstandenen Signals geschieht mit Hilfe der Dunkel-feldmikroskopie.
Für die Autoradiographie wurden die Schnitte in einer aufsteigenden Ethanolreihe folgendermaßen entwässert:
1 min 70 % Ethanol mit 0,3 M NH4Ac, pH 7,4 1 min 80 % Ethanol mit 0,3 M NH4Ac, pH 7,4 1 min 95 % Ethanol
5 min 100 % Ethanol.
Anschließend wurden die Schnitte luftgetrocknet. Alle im Folgenden aufgeführten Schritte wurden unter besonderen Lichtverhältnissen (Sicherheitslampe mit Filter Nr.
2 (KODAK), 15 W Glühbirne) in der Dunkelkammer durchgeführt.
Es wurde zunächst von jedem doppelten bzw. fünffachen Ansatz mit einen trockenen staubfreien Objektträger ein Röntgenfilm BIOMAX ML (KODAK) für 5 Tage exponiert, welcher nach folgendem Protokoll entwickelt wurde:
2 min Entwickler (SIGMA) 10 sec Wasser
5 min Fixierer (SIGMA) 2 min Wasser.
Aus der Beurteilung des Röntgenfilms ergab sich ein erster Anhaltspunkt über den Erfolg der In situ-Hybridisierung und über die Expositionszeiten der Objektträger mit der Autoradiographieemulsion. Ist nach fünf Tagen Exposition des Röntgenfilms ein deutliches Signal zu erkennen, so können die Objektträger mit der Autoradiographieemulsion nach wenigen Tagen entwickelt werden, wie z.B. die In situ-Hybridisierung von Eutergewebe mit der Casein-Sonde, die nach 8 Tagen Exposition entwickelt wurde. Ist das Signal jedoch sehr schwach bzw. kein Signal zu sehen, so beträgt die Expositionszeit der Objektträger Wochen bis Monate.
Die Autoradiographieemulsion NTB-2 (KODAK) wurde im Wasserbad bei 42°C 1 h verflüssigt. Sie wurde 1:1 mit Wasser verdünnt und in die gläserne Tauchkammer für Objektträger (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH, Braunschweig) überführt. Es folgte eine weitere Inkubation von 30 min bei 42°C, um die Tauchkammer zu erwärmen und um möglichst alle entstandenen Luftblasen aus der Emulsion aufsteigen zu lassen. Die dann noch in der Emulsion verbliebenen Luftblasen wurden durch das Eintauchen von drei leeren Objektträgern entfernt. Anschließend wurden die Objektträger mit den Gewebeschnitten möglichst senkrecht in einer langsamen, kontrollierten Bewegung einmal für 2 sec in die Emulsion eingetaucht und langsam wieder herausgezogen. Dabei wurde darauf geachtet, dass keine Tropfen in die Flüssigkeit zurückfallen konnten, um die Bildung von Luftblasen zu verhindern.
Danach wurden die Objektträger in nahezu senkrechter Position auf saugfähiges Papier gestellt und bei absoluter Dunkelheit für 1 h luftgetrocknet. Die Exposition erfolgte in mit Trockenperlen bestückten, lichtdicht verschlossenen Kunststoffgefäßen bei 4°C für 8 Tage bis 25 Wochen. Die Entwicklung der Objektträger erfolgte nach folgendem Protokoll:
Kunststoffgefäße mit Objektträgern 30 min vor Öffnen bei Raumtemperatur 4 min Entwickler D-19 (KODAK) (1:1), gefiltert
10 sec Wasser
5 min Fixierer (KODAK), gefiltert 15–30 min Wasser.
2.3.5 Gegenfärbung
Bei der Gegenfärbung werden die Zellen oder Zellbestandteile des Objektes angefärbt, so dass eine Orientierung im Gewebe möglich wird.
Die Objektträger wurden nach der Entwicklung und Fixierung aus dem Leitungs-wasser entnommen und nach folgendem Protokoll einer Kresylviolett-Kernfärbung unterzogen:
1–2 min Kresylviolett (1 %ige wässrige Lösung) Waschen in Wasser
10 sec 95 % Ethanol
10–60 sec 95 % Ethanol mit einigen Tropfen Essigsäure 30 sec 100 % Ethanol
2 min Rothihistol® Eindecken mit Entellan 2.3.6 Photodokumentation
Die Photodokumentation erfolgte am Labor-System-Mikroskop von LEICA mit dem Photoapparat Wild MPS 51 (SWISS OPTIC AG, Heerbrugg, Schweiz) und der Belichtungsautomatik Photoautomat Wild MPS 45 (SWISS OPTIC AG, Heerbrugg, Schweiz). Als Filmmaterial wurden Ilford Schwarz-Weiß Tageslichtfilme 100 ASA, Delta Professional, verwendet. Die entwickelten Fotos wurden mit Hilfe eines Scanners digitalisiert und mit dem Programm Adobe-Photoshop (Version 6.0) bearbeitet und beschriftet.