Northern Blot Hybridisierung

In der Northern Blot Hybridisierung wurde die Spezifität der Bindung der RNA-Sonde an der extrahierten RNA eines Gewebes getestet. Es wird zunächst eine RNA-Agarosegel-Elektrophorese und anschließend ein Kapillarblot für den Transfer der aufgetrennten RNA auf eine Nitrozellulosemembran durchgeführt (ALWINE et al., 1977, THOMAS, 1980). Danach erfolgt die Hybridisierung der zu testenden RNA-Sonde mit der aufgetrennten RNA und die Sichtbarmachung auf der Membran. Dabei

2000 bp → 1200 bp → 800 bp → 400 bp → 200 bp → 100 bp →

← 299 bp 1 2 3 4 5

1 = Low DNA Mass Ladder

2 = RT-PCR, Entparaffinisierung mit Xylol 3 = PCR, Entparaffinisierung mit Xylol 4 = RT-PCR, Entparaffinisierung bei 70°C 5 = PCR, Entparaffinisierung bei 70°C

kann dann mit Hilfe eines RNA-Längenstandards oder dem Einsatz einer Kontrollsonde beurteilt werden, ob die Sonde spezifisch an der Ziel-RNA bindet.

RNA-Agarosegel-Elektrophorese

Für die Agarosegel-Elektrophorese von RNA wurde ein 1,8 %iges Formaldehyd-Gel gegossen. Im Gegensatz zur DNA muss RNA in einem denaturierenden Agarosegel aufgetrennt werden, um eine zu starke Aufknäuelung der RNA zu verhindern. Dazu wird Formaldehyd zugegeben.

Es wurden 1,44 g Agarose in 47 ml DEPC-behandeltem Wasser gekocht und auf Handwärme abgekühlt. Dann wurden unter einem Abzug 12 ml 10 x MOPS-Puffer (1,5 x) und 20 ml 37 %iges Formaldehyd (9,25 %) zugefügt, gemischt und das Gel in eine RNase-freie Gelkammer gegossen. Als Laufpuffer wurde 1 x MOPS-Puffer ver-wendet.

Für die Elektrophorese wurde zunächst Gesamt-RNA aus boviner Leber wie unter 2.1.1 beschrieben extrahiert. Es wurde die Leber als Organ gewählt, da in diesem Organ laut nicht veröffentlichter Studien von PD Dr. R. Bruckmaier, Institut für Physiologie des Forschungszentrums für Milch und Lebensmittel der Technischen Universität München, verhältnismäßig mehr mRNA der adrenergen Rezeptoren vorhanden ist, als in Eutergewebe. Anschließend erfolgte eine mRNA Anreicherung mit dem entsprechenden mRNA Anreicherungs-Kit von PeqLab nach Herstellerprotokoll. Die Anreicherung erfolgt durch Oligo-dT-Celluloseaffinitätschromatographie. Dabei wird die Tatsache ausgenutzt, dass fast alle eukaryotischen mRNA-Moleküle an ihrem 3‘-Ende eine Poly-Adenylat (Poly (A)⁺)- Kette tragen. Daher bindet mRNA an oligo-dT-gekopppelte Cellulose, während andere RNA-Moleküle, wie tRNA und rRNA in Lösung bleiben. Die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen oligo-dT und mRNA werden in Gegenwart von Puffern niedriger Salzkonzentrationen destabilisiert und die mRNA von der Säule eluiert. Die erhaltene mRNA wird Poly(A)⁺-mRNA genannt. Das mRNA-Pellet wurde in 100 µl DEPC-behandeltem Wasser gelöst und mit 2 µl RNase-Inhibitor versetzt.

Die Konzentration wurde wie unter 2.1.1 beschrieben photometrisch bestimmt.

Die extrahierte Leber-mRNA wurde linearisiert, indem 12 µl der mRNA (4,0 µg/µl) mit 108 µl DEPC-behandeltem Wasser und 120 µl Probenpuffer 3 min gekocht wurden.

Anschließend erfolgte eine Zentrifugation von 10 sec bei 14.000 g und die Mischung wurde mit 48 µl Ladepuffer versetzt. In jede zweite Tasche des Gels wurden 24 µl

der Mischung geladen, die jeweils 4 µg RNA enthielten. Vor dem Laden der Proben wurde bei 4°C für 5 min eine Spannung von 70 V angelegt. Anschließend wurde die Probe aufgetragen, für 5 min eine Spannung von 90 V und für 3,5 h von 45 V angelegt.

Northern Blot

Beim Northern Blot wird die elektrophoretisch aufgetrennte Poly(A)⁺-mRNA aus dem Gel auf eine positiv geladene Nylonmembran übertragen und immobilisiert. Dazu wurde ein Kapillarblot verwendet, der folgendermaßen aufgebaut war: in einer Elektrophoresekammer wurde eine Filterpapierbrücke so platziert, dass die Enden jeweils in ein Pufferreservoir mit 15 x SSC tauchten. Das Agarosegel wurde auf das Filterpapier gelegt. Das Filterpapier wurde rund um das Gel mit Parafilm^ abgedeckt.

Anschließend wurde auf das Gel die positiv geladene Nylonmembran (BOEHRINGER, Mannheim) gelegt, die zuvor mit Wasser angefeuchtet worden war.

Auf die Nylonmembran wurden einige Schichten Filterpapier und eine Glasplatte gelegt. Diese wurde mit einem Gewicht beschwert (Abb. 11).

Abb. 11: Schematische Darstellung des Aufbaus eines Northern Blots.

Anschließend wurde über Nacht bei Raumtemperatur geblottet. Dabei wurde der Puffer aus dem Pufferreservoir durch Kapillarkräfte durch das Agarosegel und die Nylonmembran in das Filterpapier gesogen. Bei diesem Vorgang wurde die mRNA aus dem Gel auf die Membran transportiert und blieb dort an der positiven Beschichtung haften. Die Poly(A)⁺-mRNA wurde 3 min auf dem Transilluminator (UV-Licht) auf der Nylonmembran fixiert.

Agarosegel Gewicht Filterpapier Nylonmembran

Filterpapierbrücke, Enden in 15 x SSC getaucht

Glasplatte

Hybridisierung

Die Northern Blot Hybridisierung wurde nach dem Herstellerprotokoll für die Nylonmembranen (BOEHRINGER, Mannheim) durchgeführt. Die Membran wurde zunächst in Streifen von 1 cm Breite und 6 cm Länge geschnitten. Das entsprach der Breite und Länge der Spuren im Agarosegel. Die einzelnen Streifen wurden in verschlossenen Plastikbeuteln jeweils mit 1,2 ml Northern Blot Hybridisierungs-Puffer in einem rotierenden Hybridisierungsofen Hybridiser HB-2D (TECHNE, Cambridge, UK) 2 h bei 67°C prähybridisiert. Anschließend wurde der Puffer gegen 300 µl Northern Blot Hybridisierungspuffer ausgetauscht, der jeweils 1 µl der Sondenlösung enthielt. Die Sondenlösung wurde zuvor 3 min gekocht. Ein Streifen der Nylon-membran wurde ohne die Zugabe von einer Sonde in Northern Blot Hybridisierungspuffer inkubiert. Von den Sonden wurden die in Tab. 7 genannten Mengen eingesetzt.

Sonde eingesetzte Menge

humanes β-Aktin 10 ng

bovine α1A-sense 20 ng

bovine α1A-antisense 20 ng

Tab. 7: Auflistung der eingesetzten Sondenmenge der ββ-Aktin-, αα1A-antisense- und αα1A-sense Sonden bei der Northern Blot Hybridisierung.

Die Hybridisierung fand in verschlossenen Plastikbeuteln über Nacht bei 67°C im Hybridisierungsofen bei ständiger Rotation statt. Danach wurden die Membranen in einer Plastikschale ebenfalls bei ständiger Bewegung zweimal 10 min bei Raumtemperatur in 20 ml 2 x SSC, das 1 % SDS enthielt, gewaschen. Anschließend fanden zwei weitere Waschschritte von 20 min bei 67°C in 20 ml 0,2 x SSC, das 1 % SDS enthielt, statt.

Immunologische Detektion

Die Immunologische Detektion wurde mit CDP-Star (ROCHE, Mannheim) nach dem Herstellerprotokoll durchgeführt. Dabei handelt es sich um ein ultra-sensitives Chemilumineszenz-Substrat für die alkalische Phosphatase. Die Membranen wurden zunächst 5 min in 20 ml CDP-Star-Waschpuffer gewaschen. Anschließend folgte

eine Inkubation von 30 min in 100 ml CDP-Star-Blockierungslösung. Danach wurden die Membranen 30 min in 20 ml CDP-Star-Blockierungslösung, die den Anti-Dig-AP Antikörper in einer Verdünnung von 1:20.000 enthielt, inkubiert. Dann wurden die Membranen zweimal 15 min in 100 ml CDP-Star-Waschpuffer gewaschen und 5 min in 20 ml CDP-Star-Detektionspuffer equilibriert. Anschließend wurden die Membranen in einen Plastikbeutel überführt, 2 ml CDP-Star-Arbeitslösung (CDP-Star 1:100 in CDP-Star-Detektionspuffer) zugegeben und 5 min inkubiert. Dann wurde die überschüssige Flüssigkeit aus dem Plastikbeutel ausgestrichen und dieser ver-schweißt.

Für den Nachweis der Chemilumineszenz wurde ein Röntgenfilm Biomax  ML (KODAK) mit den Membranen exponiert. Die optimale Expositionszeit wurde für jeden Blot jeweils empirisch bestimmt. Der Röntgenfilm wurde 1 min in GBX Entwickler (SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen) entwickelt, 1 min mit Wasser gründlich abgespült und 5 min in GBX Fixierer (SIGMA-ALDRICH) fixiert. Abschließend wurde der Röntgenfilm mit Wasser abgespült und getrocknet.

Es konnte ein schwaches Signal bei der Hybridisierung der α1A-as-Sonde (1275 bp) mit der Poly(A)⁺-mRNA auf der Höhe der hybridisierten β-Aktin-Sonde nachgewiesen werden. Bei der Hybridisierung mit der α1A-s-Sonde (1275 bp) und bei dem Streifen, der nur mit Northern Blot Hybridisierungspuffer inkubiert worden war, konnte kein Signal nachgewiesen werden.

2.2 Entwicklung einer In situ-Hybridisierung mit nicht-radioaktiv markierten