Adrenerge Rezeptoren
Adrenerge Rezeptoren sind Membranproteine, die auf Noradrenalin und Adrenalin als Transmitter aus den Varikositäten des sympathischen Nervensystems bzw.
systemisch wirkende Katecholamine aus dem Nebennierenmark ansprechen. Sie werden in die zwei Haupttypen α- und β-Rezeptoren unterteilt. Durch unterschiedliche Affinität zu adrenergen Rezeptoragonisten und -antagonisten und durch physiologische Wirkungen sind beide Rezeptortypen weiter in α1-, α2-, β1-, β2- und β3-Rezeptoren, und die α-Rezeptoren weiter in Subtypen (α1A-, α1B-, α1D- bzw.
α2A/D-, α2B- und α2C-Rezeptoren) unterteilt. Unter Zuhilfenahme von molekularbiologischen Methoden wurde die Nomenklatur der Subtypen der α-adrenergen Rezeptoren in neueren Publikationen im Vergleich zu älteren modifiziert (Tab. 1).
alte Bezeichnung neue Bezeichnung
α1a/d-Rezeptor α1D-Rezeptor
α1b-Rezeptor α1B-Rezeptor
α1c-Rezeptor α1A-Rezeptor
α2a-Rezeptor α2AD-Rezeptor
α2b-Rezeptor α2B-Rezeptor
α2c-Rezeptor α2C-Rezeptor
α2d-Rezeptor α2AD-Rezeptor
Tab. 1: Alte und neue Nomenklatur der αα-adrenergen Rezeptoren (zusammengestellt nach NICHOLAS et al., 1996 und CIVANTOS CALZADA und ALEIXANDRE DE ARTINANO, 2001)
In der folgenden Arbeit wird die neue Nomenklatur verwendet.
Die Rezeptortypen werden in verschiedenen Organen in unterschiedlichen Mengen exprimiert und vermitteln daher auch ihre Wirkung in unterschiedlichem Maße. α1 -Rezeptoren herrschen an den Speicheldrüsen und der glatten Muskulatur vor. Ihre Stimulierung bewirkt die Förderung der K+- und Wassersekretion der Speicheldrüsen, Kontraktion von Arteriolen, Uterus, Bronchiolen, Sphinkter der Harnblase und des
Magen-Darm-Traktes, Vas efferens, M. dilatator pupillae und anderen. Dagegen sind α2-Rezeptoren unter anderem in Zentralem Nervensystem, Niere, Uterus, Parotis, Pankreas, Mastzellen und an Thrombozyten vorhanden. Man findet sie an präsynaptischen Membranen der cholinergen Neurone des Magen-Darm-Traktes, wo ihre Stimulierung eine Hemmung der Azetylcholinfreisetzung bewirkt. Die Stimulierung von präsynaptischen α2-Rezeptoren an den Varikositäten des Sympathikus, z.B. im Magen-Darm-Trakt und im Herzvorhof, bewirkt als negative Rückkopplung die verminderte Ausschüttung von Noradrenalin. Über β1-Rezeptoren wird die intrazelluläre Ca2+-Konzentration erhöht, was am Herzen positiv chrono-, dromo- und inotrop wirkt. In der Niere wird über β1-Rezeptoren die Reninfreisetzung erhöht. Durch die Bindung spezifischer Agonisten lassen sich die β2-Rezeptoren abgrenzen, die allgemein eine intrazelluläre Erniedrigung der Ca2+-Konzentration bewirken. Dadurch werden Blutgefäße und Bronchiolen dilatiert, die Magen-Darm-Muskulatur entspannt, die Insulinfreisetzung stimuliert sowie die Lipolyse und die Glykogenolyse gesteigert. Die β3-Rezeptoren befinden sich hauptsächlich auf Fettzellen, wo ihre Stimulierung eine Lipolyse bewirkt (zusammengefasst nach GRAHAM, 1990).
Besonders die Subtypen vaskulärer adrenerger Rezeptoren spielen eine große Rolle in der Medizin. Sie sind pharmakologisch wichtig für die Regulation des Blutdrucks und die Feineinstellung der Blutbereitstellung für die unterschiedlichen Organe. Um eine gezielte pharmakologische Behandlung auf Rezeptor-Subtyp-Ebene zu ermöglichen, ist die genaue Kenntnis der Verteilung der Rezeptor-Subtypen und eine Entwicklung subtypspezifischer Agonisten und Antagonisten nötig (zusammengefasst nach GUIMARAES und MOURA, 2001). In der Veterinärmedizin spielen die Subtypen der α1- und α2-adrenergen Rezeptoren bislang im therapeutischen Bereich keine explizite Berücksichtigung, obwohl viele ihrer Funktionen bekannt sind.
Bei den adrenergen Rezeptoren handelt es sich um G-Protein gekoppelte Zellmembranrezeptoren. Alle G-Protein gekoppelten Rezeptoren durchlaufen die Plasmamembran siebenmal. Das Protein besitzt einen extrazellulären Amino-Terminus und einen intrazellulären Carboxyl-Amino-Terminus. Durch die sieben α-helikal angeordneten transmembranen Domänen werden drei intrazelluläre und drei extrazelluläre Schleifen gebildet (Übersicht bei STRYER, 1995) (Abb. 1). Dabei ist
die Aminosäuresequenz der transmembranen Domänen zwischen den einzelnen adrenergen Rezeptoren am stärksten konserviert, während die dritte cytoplasmatische Schleife beim Rind die größten Unterschiede in der Sequenz zwischen den einzelnen Rezeptorsubtypen aufweist (VENKATARAMAN et al., 1997).
Die adrenergen Rezeptoren werden auch in der Milchdrüse des Rindes exprimiert (WELLNITZ et al., 2001).
Abb. 1: G-Protein gekoppelter Rezeptor (aus STRYER, Biochemie, 1995)
Adrenerge Rezeptoren in der Milchdrüse des Rindes
Bei der Milchabgabe spielt die Milchejektion eine entscheidende Rolle. Bis zu 80 % der produzierten Milch werden in den Alveolen der Milchdrüse gespeichert, wo sie durch kapillare Kräfte gehalten werden. Es sind maximal 21,0 % (PFEILSTICKER et al., 1996) der Milch direkt durch Absaugen aus der Drüsenzisterne zu ermelken. Die Milch aus den Alveolen muss aktiv ejiziert werden, um über das Milchgangsystem in die Drüsenzisterne abfließen zu können und von dort aus für das Jungtier bzw. die Melkmaschine verfügbar zu werden. Dies geschieht durch die Kontraktion der Myoepithelzellen, die die Alveolen korbartig und die kleinen Milchgänge in longitudinaler Richtung umspannen. Bei der taktilen Zitzenreizung kommt es über
COO -NH3+
extrazelluläre Seite
cytosolische Seite
Oligo- saccharid-einheit
einen neuro-endokrinen Reflexbogen zur Freisetzung von Oxytocin aus dem Hypophysenhinterlappen in die periphere Zirkulation. Oxytocin verursacht die Kontraktion der Myoepithelzellen und damit die Ejektion der Milch. Die Milchejektion hält bis zum Ende der Euterentleerung an und verlangsamt sich mit fortschreitender Entleerung (BRUCKMAIER et al., 1994). Zu Beginn des Melkens wird die Zisternenfraktion der Milch schnell abgesaugt und die Geschwindigkeit des Milchentzuges im weiteren Verlauf von der Geschwindigkeit der Milchejektion bestimmt (PFEILSTICKER et al., 1995).
Wie von BATRA (1986) zusammengefasst, ist eine zügige, schonende und dabei vollständige Euterentleerung beim Melken aus arbeitswirtschaftlichen Gründen und vor allem zur Erhaltung der Eutergesundheit von größter Bedeutung. Unnötige Belastung des Milchdrüsengewebes während des maschinellen Milchentzuges durch mangelnde Ejektion sowie im Euter zurückbleibende Milch führen auch zu einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber Mastitiserregern. Es ergeben sich eine beeinträchtigte Tiergesundheit sowie erhebliche wirtschaftliche Verluste.
Große individuell charakteristische Unterschiede im Verlauf der Milchabgabe bei Kühen lassen eine starke Variation der Milchejektionsgeschwindigkeit vermuten.
Neben der oxytocinabhängigen Kontraktion der Myoepithelzellen kann davon ausgegangen werden, dass der Transport der Milch durch das Milchgangsystem ein wesentliches Regulativ für Geschwindigkeit und Effizienz der Milchejektion darstellt.
Durch die Behandlung von Kühen mit α-adrenergen Agonisten kann die Milchejektion trotz normaler Oxytocinfreisetzung beim Melken blockiert werden (BRUCKMAIER et al., 1991, 1997). Obwohl eine Kontraktion der Zitze in longitudinaler Richtung eindeutig messbar und sichtbar war, wurde der maximale Milchfluss durch die Stimulation der α-adrenergen Rezeptoren nicht beeinflusst, solange Milch in der Zisterne vorhanden war, was bedeutet, dass die Kontraktion der Zitze keinen Einfluss auf den Milchfluss hat. Ein weiteres Nachfließen von Milch in die Drüsenzisterne war aber reduziert bzw. völlig unterbrochen (BRUCKMAIER et al., 1997). α1-, α2- und β2-adrenerge Rezeptoren wurden in Rezeptorbindungsstudien mit radioaktiv markierten Liganden in hoher Konzentration in Gewebehomogenaten aus Zitzenmuskulatur und Gewebe um die Drüsenzisterne, in dem die großen Milchgänge in die Zisterne münden, nachgewiesen. Im proximalen Drüsengewebe
waren eine geringe Konzentration der Rezeptoren nachweisbar (HAMMON et al., 1994).
Damit ergibt sich ein Widerspruch zu der Hypothese, wonach für die Milchabgabe während des Melkens lediglich die Milchejektion im Alveolargewebe sowie der Tonus der Zitzenmuskulatur ausschlaggebend seien. Störungen der Milchabgabe, wie sie etwa unter der Einwirkung von Stress beobachtet werden, wurden bei erfolgter Oxytocinausschüttung als verminderte Oxytocinwirkung interpretiert, die sich aus dem adrenerg reduzierten Blutfluss zu den Alveolen und damit einem verminderten Zustrom von Oxytocin an seine Zielzellen erklären soll (GOREWIT und AROMANDO, 1985). Dass im proximalen Drüsengewebe kaum Liganden für adrenerge Rezeptoren binden, deutet darauf hin, dass die Oxytocinwirkung im Drüsenkörper gegeben ist und nicht durch adrenerge Agonisten blockiert wird (HAMMON et al., 1994). Der Abfluss der Milch wird durch einen Einfluss des adrenergen Systems verhindert.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen lassen vermuten, dass die Transportkapazität der milchabführenden Gänge wesentlich durch das sympathische Nervensystem reguliert wird. Die glatte Muskulatur der Zitze reagiert mit deutlichen Tonusveränderungen auf die Stimulation der α- und β-adrenergen Rezeptoren (LEFCOURT, 1982, BRUCKMAIER et al., 1997). Der Tonus der glatten Muskulatur der Zitze hat allerdings kaum Einfluss auf Verfügbarkeit und Flussrate der Milch, die bereits in der Drüsenzisterne vorhanden ist. Dagegen kann der Übertritt der Alveolarmilch in die Zisternenhohlräume durch Stimulierung der α-adrenergen Rezeptoren reduziert oder sogar völlig unterbrochen werden.
Durch Stimulation mit β-adrenergen Agonisten wurden der Milchfluss in der Anfangsphase des Melkens sowie der maximale Milchfluss erhöht, während die Milchmenge nicht beeinflusst wurde (BRUCKMAIER et al., 1991).
Ungeklärt ist bisher, wo genau die Regulation der Milchejektion über das adrenerge System stattfindet. Alle Ergebnisse, die eine relativ hohe Dichte adrenerger Rezeptoren im Bereich der großen Milchgänge zeigen, beruhen auf deren Nachweis in Homogenaten. Deshalb ist die exakte Lokalisation der adrenergen Rezeptoren auf zellulärer Ebene nicht bekannt und damit auch ihre physiologische Wirkung hypothetisch. Zum besseren Verständnis der Vorgänge während der Milchejektion ist daher ein Rezeptornachweis in Gewebeschnitten nötig.
Möchte man die Lokalisation von Rezeptoren nachweisen, so kann dies auf Proteinebene mittels spezifischer Antikörper (Immunhistochemie) oder Liganden (In situ-Ligandenbindung) oder auf mRNA-Ebene mittels markierter Nukleinsäuresonden (In situ-Hybridisierung) geschehen. In der vorliegenden Arbeit wird ein Nachweis auf Transkriptionsebene, d.h. mit In situ-Hybridisierung, angestrebt.
In situ-Hybridisierung (ISH)
Die In situ-Hybridisierung erlaubt eine direkte Aussage über die Lokalisation und Verteilung von Nukleinsäuren in biologischen Präparaten in situ, d.h. in Geweben, Zellen, Zellkernen und Chromosomen. Mit dieser Methode können die gewebs- und zelltypspezifische Expression der mRNA von Proteinen und auch der zeitliche Verlauf der Expression untersucht werden. Sie eignet sich auch zur Identifizierung und Charakterisierung viraler und bakterieller Sequenzen und zur Geschlechtsbestimmung (WILKINSON, 1998, LEITCH et al., 1994).
Seit der Etablierung nicht-radioaktiver Markierungssysteme (LANGER et al., 1981, BRIGATI et al., 1983) stellt die In situ-Hybridisierung in vielen Laboratorien ein Routineverfahren insbesondere in der Diagnostik viraler Infektionen dar (Übersichten bei WARFORD und LAUDER, 1991). Sie gewinnt zunehmend an Bedeutung bei embryologischen, zellbiologischen, genetischen und pathologischen Fragestellungen (JIN und LLOYD, 1997).
Die Methode der radioaktiven In situ-Hybridisierung wurde erstmals 1969 zeitgleich von JOHN et al. und GALL und PARDUE zur Lokalisation von ribosomalen RNA-Sequenzen in Zellpräparationen publiziert. Sie beruht auf dem Prinzip der molekularen Hybridisierung einzelsträngiger Nukleinsäuren (DNA und/oder RNA), wobei die RNA-RNA-Hybridisierung besonders stabil ist. Eine markierte Nukleinsäuresonde hybridisiert in situ mit einem Nukleinsäurestrang, z.B. der mRNA des nachzuweisenden Proteins.
Für den Nachweis von mRNA im Gewebe zur Erforschung der räumlichen Expression werden RNase-frei gewonnene Gewebedünnschnitte benötigt. Dabei kann es sich um Paraffinschnitte, Gefrierschnitte oder auch in Harze eingebettete Gewebeschnitte handeln. Die Sonde kann eine RNA-Sonde, eine DNA-Sonde oder ein Oligonukleotid sein. Sie muss in ihrer Nukleinsäuresequenz komplementär zu der nachzuweisenden Nukleinsäure sein, d.h. eine RNA-Sonde ist der Gegenstrang zu der mRNA im Gewebe bzw. entspricht dem codogenen Strang der DNA. Markierte
RNA-Sonden werden durch in vitro-Transkription mit markierten Nukleotiden hergestellt. Dabei kann die Markierung nicht-radioaktiv oder radioaktiv erfolgen. Die nicht-radioaktive Markierung hat u.a. die Vorteile, dass sie einfacher und sicherer in der Handhabung und auch günstiger ist. Es kann mit Digoxigenin (Dig), Biotin oder Fluorescein markiert werden. Diese Moleküle können immunhistochemisch indirekt mit Hilfe von markierten Antikörpern bzw. Streptavidin-Enzym-Konjugaten nachgewiesen oder im Fall von Fluorescein direkt unter dem Mikroskop beurteilt werden. Die radioaktive Markierung wird mit Autoradiographie sichtbar gemacht und ist sensitiver. Die Auswertung der In situ-Hybridisierung findet mikroskopisch statt (zusammengefasst nach LEITCH et al., 1994 und JIN und LLOYD, 1997).
Ziel dieser Arbeit
Ziel dieser Arbeit ist es, eine In situ-Hybridisierung für den Nachweis der Lokalisation der Expression der adrenergen Rezeptoren auf zellulärer Ebene in der Milchdrüse des Rindes zu entwickeln. Damit soll die Hypothese geprüft werden, ob der ejektionsbedingte Transport der Milch vom Alveolargewebe in die Drüsenzisterne durch die Stimulierung von adrenergen Rezeptoren im Bereich des Milchgangsystems beeinflusst wird. Es wird vermutet, dass sich die adrenergen Rezeptoren in den glatten Muskelzellen, die zirkulär um die großen Milchgänge lokalisiert sind, befinden (WELLNITZ et al., 2001). Sie sind somit an der Verhinderung des Milchflusses beteiligt, indem bei ihrer Stimulierung die großen Milchgänge verengt werden. Dadurch wird ein Abfließen der Milch in die Drüsenzisterne verhindert. Mit dem Nachweis der Lokalisation der adrenergen Rezeptoren in den Zellen des Euters soll der genaue Wirkort der Katecholamine untersucht werden.