2 Methodischer Teil
2.1 Vorarbeiten für die Entwicklung einer In situ-
2.1.2 Herstellung und nicht-radioaktive Markierung von RNA-
2.1.2.1 RNA-Sondenherstellung von Plasmiden
Reverse Transkription (RT)
Um nachzuweisen, dass in dem Gewebe, aus dem RNA extrahiert wurde, ein bestimmtes Gen abgelesen wird und damit auch ein bestimmtes Protein produziert werden kann, wird die mRNA dieses Gens zunächst in DNA (cDNA) umgeschrieben.
Dieser Vorgang wird RT genannt. Die Reverse Transkriptase, ein Enzym, das aus Retroviren isoliert oder rekombinant hergestellt wird (KOTEWICZ et al., 1985), stellt eine abhängige DNA-Polymerase dar. Sie synthetisiert entlang einer RNA-Matritze einen cDNA-Strang. Dazu benötigt sie den as-Primer, ein Oligonukleotid, das komplementär zu der mRNA dieses Gens im Gewebe bzw. in der extrahierten Gesamt-RNA ist. Der Primer lagert sich an die entsprechende Ziel-mRNA spezifisch an und wird von der Reversen Transkriptase zu einem cDNA-Strang verlängert.
Anschließend kann die entstandene cDNA mittels PCR (s.u.) amplifiziert werden.
Für jeden der interessierenden Rezeptorsubtypen wurde für die PCR unter Zuhilfenahme der veröffentlichten Sequenzen (siehe Kapitel 8.5) ein geeignetes Primerpaar ausgesucht und für die RT jeweils der as-Primer verwendet. Das Primerpaar umschließt jeweils die Region der DNA-Sequenz, die amplifiziert werden soll, wobei der as-Primer am 3‘-Ende und der s-Primer am 5‘-Ende dieser Sequenz liegt. Der as-Primer ist komplementär zu der nativen mRNA und der s-Primer zu der in der RT entstehenden cDNA. Da das Enzym Reverse Transkriptase am 3‘-Ende des Primers anfängt zu lesen, sollte auch die Passform des Primers am 3‘ Ende besonders gut sein. Es wurde darauf geachtet, dass das 3‘-Ende einen höheren GC-Anteil und das 5‘-Ende einen höheren AT-GC-Anteil aufweist. Insgesamt sollte der Primer ca. 18-30 bp lang sein und der GC-Gehalt sollte zwischen 50 und 60 % liegen. Die optimale Anlagerungstemperatur der Primer sollte zwischen 55 und 80°C liegen. Die Primer dürfen keine Sekundärstrukturen wie z. B. Haarnadelstrukturen bilden und auch nicht miteinander hybridisieren (FLACH et al. 1994). Die Primer umschließen eine für den jeweiligen Rezeptor-Subtyp spezifische DNA-Sequenz, die ein ausgewogenes GC:AT-Verhältnis hat. Die jeweiligen Regionen werden in der Tab. 2 aufgeführt:
Rezeptor-Subtyp Länge PCR-Produkt Lokalisation im Protein bzw.
Auswahlkriterium der Sequenz
α1A 199 3. cytoplasmatische Schleife
α1A 299 1. cytoplasmatische Schleife bis 4.
transmembrane Region α1A 1275 1. cytoplasmatische Schleife bis
cytoplasmatischer Schwanz α2B 296 stark homologe Region der bekannten
bovinen Sequenz mit der der Ratte
β2 351 3. cytoplasmatische Schleife bis
cytoplasmatischer Schwanz
β2 792 3. transmembrane Region bis
cytoplasmatischer Schwanz
Tab. 2: Länge der PCR-Produkte und deren Lokalisation im Protein der ausgewählten adrenergen Rezeptoren (SCHWINN et al., 1990, MATSUI et al. 1989, JOHNSON, 1998).
Die Sequenzen der Rezeptor-Subtypen sind mit Markierung der Primer im Anhang unter 8.5 aufgeführt.
Die Primer (LIFE TECHNOLOGIES, Karlsruhe) wurden in einer Konzentration von 100 pmol/µl in DEPC-behandeltem Wasser gelöst. In der RT und der PCR wurden die Primer in einer Konzentration von 50 pmol/µl eingesetzt. Die as-Primer sind im Folgenden aufgelistet:
Rezeptor Primername Primer α1A a1cas 5‘-GGA GAT GAC CAA AGA GAG C-3‘
aka1c1as 5‘-GCG GGA GAA TTC GAG CAG TCT CAC GG-3‘
aka1c2as 5‘-GAG TGG GTA CCT AAG ATC ACC CTC CCA TC-3‘
α2B a2bas 5‘-TAC CAG GCC TCT TGG TTG AGC T-3‘
β2 b2as 5‘-CCA GGT GAT ATC CAC TCT GTT C-3‘
Bei der RT wurde native mRNA mit Superscript (LIFE TECHNOLOGIES, Karlsruhe), einer Reversen Transkriptase, in cDNA umgeschrieben. In der RT wurde 1 µg Gesamt-RNA in einer Konzentration von 0,1 µg/µl (mit DEPC-behandeltem Wasser
verdünnt) eingesetzt. Zur Linearisierung der mRNA wurde diese Verdünnung 5 min bei 65°C inkubiert und bis zum Einsatz kurzfristig auf Eis gelagert.
Für die RT wurden folgende Reagenzien pipettiert:
10 µl Gesamt-RNA in Wasser (entspricht 1 µg Gesamt-RNA) 5,5 µl DEPC-behandeltes Wasser
0,5 µl 50 U RNase-Inhibitor/µl 5,0 µl 5 x First Strand Buffer 2,5 µl 0,1 M DTT
0,5 µl 50 pmol Primer as/µl 0,5 µl 100 mM dNTPs 0,5 µl 200 U Superscript/µl
Für die Reaktion wurde der Ansatz 1-2 h bei 42°C im Trio-Thermocycler V2.23 (BIOMETRA, Göttingen) inkubiert. Nach Abschluss der Reaktion wurde das Produkt direkt in einer PCR weiterverwendet oder bis zum weiteren Gebrauch bei –20°C gelagert.
Polymerase Kettenreaktion
Die PCR ermöglicht es, einen bestimmten Abschnitt eines DNA-Moleküls, wie z.B.
die cDNA aus einer RT, in vitro enzymatisch zu amplifizieren (MULLIS et al., 1986).
Die dazu verwendeten Enzyme sind thermostabile DNA-Polymerasen wie z.B. die Taq-Polymerase aus dem Bakterium Thermus aquaticus (SAIKI et al., 1988). Die PCR besteht aus sich wiederholenden Zyklen mit den folgenden Reaktionsschritten:
Denaturierung: Die DNA wird auf 94°C erhitzt, wodurch sich der Doppelstrang in Einzelstränge teilt.
Primeranlagerung: Die Primer hybridisieren bei einer für jedes Primerpaar spezifischen Temperatur mit der einzelsträngigen DNA.
Kettenverlängerung: Bei 72°C, der Optimaltemperatur für die Taq Polymerase, werden die Primer am 3‘-Ende verlängert, so dass neue doppelsträngige DNA-Moleküle entstehen.
Für die PCR wurde jeweils das Produkt aus der RT als Ausgangs-cDNA verwendet.
Es wurde zusätzlich zum as-Primer der s-Primer benötigt. Die s-Primer sind im Folgenden aufgelistet:
Rezeptor Primername Primer
α1A a1cs 5‘-CGG TCA CAC ACT ACT ACA TCG-3‘
aka1c1s 5‘-CCT GGC CAT GGA CTG CCG GGT CTA CG-3‘
aka1c2s 5‘-GCT CCA GTC AAG AAT TCA AAA AGG CC-3‘
α2B a2bs 5‘-TTG CTG GGC TAC TGG TAC TTC-3‘
β2 b2s 5‘-GAC AAC GCA GGA CCT CCA AG-3‘
b2s2 5‘-ACT TCC ATT GAC GTG TTA TGC G-3‘
Die einzelnen Reagenzien wurden in folgenden Mengen pipettiert:
10 µl DNA-Template 5,0 µl 10 x PCR-Puffer 0,5 µl 100 mM dNTPs 0,5 µl 50 pmol Primer as/µl 0,5 µl 50 pmol Primer s/µl 32,0 µl Wasser
1,5 µl 50 mM MgCl2
0,2 µl 5 U Taq Polymerase/µl
Abschließend wurde der Ansatz mit Mineralöl überschichtet, um die Verdunstung von Flüssigkeit zu verhindern, und das Gefäß in den auf 94°C vorgeheizten Thermo-cycler gesteckt. Dann wurde im ThermoThermo-cycler das folgende PCR-Programm ge-startet:
94°C = Denaturierung der DNA-Stränge 5 min 94°C = Denaturierung der DNA-Stränge 40 sec
x°C = Anlagerung der Primer bei Optimaltemperatur 40 sec 32 Zyklen 72°C = Kettenverlängerung durch Polymerase 40 sec
72°C = Kettenabschluss 5 min
Die Anlagerungstemperatur der Primer wurde je nach Primerpaar variiert, bis die optimale Temperatur gefunden wurde. Die Temperatur für den Kettenaufbau durch die Polymerase wurde bei den längeren PCR-Produkten, d.h. ab 792 bp, für 60 sec
gehalten. Nach dem Abpipettieren des Mineralöls wurde das entstandene PCR-Produkt direkt in der Elektrophorese (s.u.) getestet oder bei –20°C gelagert.
Für die PCR des 1275 bp langen Fragmentes des α1A-Rezeptors konnte als DNA-Template das Plasmid pBCα1Cbov verwendet werden, in dem die komplette Sequenz des bovinen α1A-Rezeptors kloniert ist. Das Plasmid wurde freundlicherweise von Dr. R. J. Lefkowitz, Duke University Medical Center, Durham, North Carolina, USA zur Verfügung gestellt. Es wurde in einer Verdünnung von 1:50.000 der Plasmidpräparation für die PCR eingesetzt.
Die optimalen Anlagerungstemperaturen der Primer während der PCR und die Längen der PCR-Produkte sind in Tab. 3 zusammengefasst.
Rezeptor α1A α1A α1A α2B β2 β2
Tab. 3: Optimale Anlagerungstemperaturen der Primer bzw. Primerkombinationen und Länge der entstehenden PCR-Produkte der ausgewählten adrenergen Rezeptoren.
Elektrophoretischer Nachweis des PCR-Produktes
Die PCR-Produkte wurden in einem 2 %igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Bei der Elektrophorese wird die Polarität der Nukleinsäuren genutzt. Da die Phosphatgruppen der Nukleinsäuren als Protonendonatoren dienen, sind DNA und RNA negativ geladen. Im elektrischen Feld wandern sie daher Richtung Anode.
Im Agarosegel werden lineare DNA-Fragmente ihrer Größe nach separiert, da die Poren der Siebstruktur der Agarose kleinen Fragmenten weniger Widerstand leisten.
Das verwendete Agarosegel enthielt 2 µg Ethidiumbromid/ml. Die Agarose wurde in TBE-Puffer gekocht und als Laufpuffer diente ebenfalls TBE-Puffer. Zur Abschätzung der Länge der DNA-Fragmente wurde zusätzlich der DNA-Längenmarker Low DNA Mass Ladder (LIFE TECHNOLOGIES, Karlsruhe) aufgetragen. Das Auftragen des Markers und der Proben erfolgte mit 5 x TBE-Ladepuffer. Die Elektrophorese erfolgte bei 80 V für 2 bis 3 h. Die Abb. 3 zeigt ein Photo einer Elektrophorese am Beispiel der PCR für den Nachweis des Fragmentes der Primerkombination a1cs/aka1c2as
des α1A-Rezeptors, das mit dem Scanner Fluor Imager SI, aufgenommen wurde. Die Anregung im Fluor Imager SI (MOLECULAR DYNAMICS, Braunschweig) erfolgte bei 488 nm.
Abb. 3: Elektrophoretischer Nachweis eines PCR-Produktes am Beispiel der PCR für den Nachweis des Fragmentes der Primerkombination a1cs/aka1c2as des αα1A-Rezeptors.
Ligation des PCR-Produktes in das Plasmid pGEM-T
Für die Ligation des PCR-Produktes in das Plasmid pGEM-T musste das PCR-Produkt in gereinigter Form vorliegen. Dazu wurde nach der Elektrophorese in einem 0,8 %igen Agarosegel die entsprechende Bande, die mit UV-Licht sichtbar gemacht wurde, mit einem sterilen Skalpell ausgeschnitten und die DNA mittels Ultrafree-DA (MILLIPORE, Eschborn) aus dem Gel gelöst. Das Ausschneiden der Bande wurde durch die Anfertigung eines Photos kontrolliert und dokumentiert. In der Abb. 4 ist als Beispiel ein Agarosegel nach dem Ausschneiden der Bande des PCR-Produktes des α1A-Rezeptors dargestellt.
Die so erhaltenen reinen PCR-Produkte dienten direkt als Insert für die Ligation (HOLTON und GRAHAM, 1991, MARCHUK et al., 1991, MEAD et al., 1991). Der Ansatz für die Ligation setzte sich nach der Gebrauchsanweisung für das pGEM-T Vector System II folgendermaßen zusammen:
2000 bp → 1200 bp → 800 bp → 400 bp → 200 bp → 100 bp →
1 2
← 1275 bp
1 = Low DNA Mass Ladder 2 = PCR-Produkt
Primerkombination a1cs/aka1c2as
5 µl 2 x Ligationspuffer 1 µl 50 ng pGEM-T/µl
x µl PCR-Produkt
1 µl T4 DNA Ligase (3 U)
mit DEPC-behandeltem Wasser ad 10 µl
Dabei berechnete sich die Menge an eingesetztem PCR-Produkt nach folgender Formel entsprechend der Gebrauchsanweisung für das pGEM-T Vector System II:
Vektor [ng] • Größe des Inserts [kb]
--- • molares Verhältnis Insert:Vektor = Insert [ng];
Größe des Vektors [kb]
Die Reaktion fand über Nacht bei 4°C statt.
Abb. 4: Agarosegel nach Ausschneiden der Bande eines PCR-Produktes für eine Ligation am Beispiel der Primerkombination des αα1A-Rezeptors.
Transformation des Plasmides in Bakterien des Stammes E. coli JM109
Zur Transformation des bei der Ligation hergestellten Plasmides (COHEN et al., 1972) in Bakterien des Stammes E. coli JM109 wurden 2 µl des Ligationsproduktes auf den Boden eines sterilen 15 ml-Röhrchens verbracht. Dann wurden die kompetenten Zellen auf Eis aufgetaut und vorsichtig gemischt. 50 µl der Zellen wurden zu dem Ligationsprodukt pipettiert, vorsichtig gemischt und 20 min auf Eis inkubiert. Anschließend folgte eine Inkubation bei 42°C für 45-50 sec und eine auf
1 2
←1275 bp 2000 bp →
1200 bp → 800 bp →
400 bp → 200 bp →
1 = Low DNA Mass Ladder
2 = PCR-Produkt, Primerkombination a1cs/aka1c2as
Eis für 2 min. Danach wurden 950 µl modifiziertes, auf Raumtemperatur gebrachtes LB-Medium (siehe Anhang) zu dem Ansatz gegeben und dieser bei 37°C 90 min auf dem Schüttler inkubiert. Danach wurde das Medium in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß abgegossen und 5 min bei 5.000 g zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand bis auf einen Tropfen abgegossen, das Pellet vorsichtig in diesem Tropfen resuspendiert und die entstandene Suspension unter sterilen Bedingungen auf einer Standard II-Agarplatte, die Ampicillin enthielt, ausgestrichen. Die Agarplatte wurde zuvor für die sogenannte Blau-Weiß-Selektion präpariert, indem 25 µl 100 mM X-Gal, 90 µl Wasser und 10 µl 10 %iges IPTG auf ihr ausgestrichen wurden und eine Inkubation von 30 min bei 37°C folgte. Die präparierten Agarplatten wurden anschließend über Nacht bei 37°C inkubiert.
Erfolgskontrolle von Ligation und Transformation
Der Erfolg von Ligation und Transformation konnte durch die sogenannte Blau-Weiß-Selektion, Plasmidpräparation (Miniprep) mit anschließender Restriktionsanalyse und PCR kontrolliert werden. Auf den Standard II-Agarplatten konnten nur Bakterien wachsen, die bei der Transformation ein Plasmid aufgenommen hatten, da auf dem pGEM-T-Vektor die Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Ampicillin verankert ist und der Standard II-Agar Ampicillin enthielt (SARIS und PAULIN, 1990).
Die sogenannte Blau-Weiß-Selektion (RÜTHER et al., 1981) gab Auskunft, ob die JM109-Zellen bei der Transformation ein Plasmid mit oder ohne Insert aufgenommen hatten. Bei der erfolgreichen Klonierung eines Inserts in den pGEM-T-Vektor wurde dessen codierende Sequenz für die β-Galaktosidase unterbrochen, so dass die Zelle, die diesen Vektor aufgenommen hatte, das Enzym nicht herstellen konnte. Die β-Galaktosidase setzt das Substrat X-Gal mit dem Inducer IPTG zu einem blauen Farbstoff um. Kolonien, die das Insert beinhalteten, wuchsen farblos und Kolonien, die das Insert nicht enthielten, waren blau.
Für die Plasmidpräparation (BIRNBOIM und DOLY, 1979), die eine Reinigung der Plasmide aus den Bakterien darstellt, wurde je eine farblose Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher von der Agarplatte gepickt, 3 ml LB-Medium mit 100 µg Ampicillin/µl mit der Kolonie beimpft und über Nacht bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde je 1 ml Bakterienkultur 1 min bei 13.000 g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das entstandene Pellet wurde vorsichtig in 100 µl Miniprep-Puffer 1, dem
10 µg RNase A zugefügt worden waren, resuspendiert. Danach wurden 100 µl Miniprep-Puffer 2 zugegeben, das Gemisch dreimal geschwenkt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von 100 µl Miniprep-Puffer 3 wurde das Gemisch erneut dreimal geschwenkt und 15 min bei 13.000 g zentrifugiert. Der klare Überstand wurde in ein steriles Reaktionsgefäß überführt und zur Präzipitation mit 600 µl 100 %igem Ethanol gemischt. Nach einer halben Stunde Inkubation bei –20°C wurde 20 min bei 14.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig entfernt und das entstandene Pellet zweimal mit 70 %igem Ethanol gewaschen. Anschließend wurde es bei Raumtemperatur getrocknet und in 20 µl DEPC-behandeltem Wasser aufgelöst.
Als Kontrolle wurde eine Restriktionsanalyse angeschlossen. Dazu wurde eine Restriktionsendonuklease bzw. eine Enzymkombination ausgewählt, die bei einer Restriktionsverdauung mit dem jeweiligen Insert im Vektor charakteristische Banden im Agarosegel ergeben.
Der Ansatz für eine Restriktionsanalyse setzte sich folgendermaßen zusammen:
1 µl Plasmidpräparation
1 µl Enzym ([U] je nach Enzym unterschiedlich)
1 µl 10 x Optimalpuffer zu dem jeweiligen Enzym (siehe Tab. 13, Kapitel 8.6) 7 µl DEPC-behandeltes Wasser
Zur Veranschaulichung des Ergebnisses einer solchen Restriktionsanalyse ist in Abb. 5 beispielhaft die Verdauung der Plasmide der Klone 14-17 dargestellt, in denen sich das Insert der Primerkombination a1cs/aka1c2as befindet. Der Verdau wurde mit Pst I in Puffer H durchgeführt.
Die Ausrichtung des Inserts im Plasmid konnte nach der Elektrophorese folgendermaßen festgestellt werden: Das Restriktionsenzym Pst I schneidet das Insert am Rand, so dass je nach Ausrichtung ein größeres Fragment von 989 bp oder ein kleineres Fragment von 328 bp und der Rest des mit Vektors 3.286 bzw.
3.947 bp entstehen. Das Enzym besitzt jeweils eine singuläre Schnittstelle im Insert sowie im Vektor. Die Abb. 6 veranschaulicht dies.
Abb. 5: Elektrophoretische Kontrolle einer Restriktionsanalyse am Beispiel des Verdaus der Plasmide der Klone 14-17, in denen sich als Insert das PCR-Produkt der Primerkombination a1cs/aka1c2as befindet, Verdau mit Pst I.
A B
Abb. 6: Bild A und Bild B, Möglichkeiten der Ausrichtung eines Inserts im pGEM-T-Vektor am Beispiel des PCR-Produktes der Primerkombination a1cs/aka1c2as mit Angabe des Produktes einer Restriktionsanalyse mit Pst I.
Aufgrund des Ergebnisses aus der Elektrophorese in Abb. 5 konnte darauf geschlossen werden, dass das Insert in den Vektoren 14-17 wie im Bild A in der Abb. 6 im Vektor ausgerichtet ist.
Im Anschluss konnte mit den gereinigten Plasmiden eine PCR durchgeführt werden, bei der die gleichen Primer verwendet wurden, wie bei der PCR für die Ligation.
Dazu wurde 1 µl DNA in 10 µl DEPC-behandeltem Wasser als DNA-Matritze
pGEM-T® mit Alpha 1A 4275 bps 1000 2 = Produkte Verdauung Klon 14 3 = Produkte Verdauung Klon 15 4 = Produkte Verdauung Klon 16 5 = Produkte Verdauung Klon 17
eingesetzt. Das Produkt aus der PCR wurde anschließend im Agarosegel beurteilt.
Als Beispiel dafür dient die Abb. 7, in der die Produkte aus der Kontroll-PCR der Klone 14-17 im Gel dargestellt sind. In die Klone 14-17 wurde als Insert das Fragment der Primerkombination a1cs/aka1c2as mit der Länge 1275 bp eingefügt.
Abb. 7: Elektrophoretische Überprüfung der Kontroll-PCR der Klone 14-17 mit der Primerkombination a1cs/aka1c2as, Länge des PCR-Produktes 1275 bp.
Auch aufgrund der Kontroll-PCR konnte somit darauf geschlossen werden, dass sich das erwünschte Insert in den Vektoren der Klone 14-17 befand.
Sequenzierung des Inserts im Plasmid
Um sicherzugehen, dass die Längen und die Sequenzen der Inserts den erwünschten entsprechen, wurde an den unterschiedlichen Vektoren mit Inserts der unterschiedlichen Rezeptoren bzw. an deren PCR-Produkten Sequenzierungen durchgeführt. Dies ist wichtig für die RNA-Sondenherstellung durch Transkription an den Plasmiden, da die Sonden möglichst komplementär zu der mRNA im Gewebe sein müssen, um spezifisch zu binden. Die Sequenzierung wurde von dem PHAMISS DNA Sequencing Service im Institut für Mikrobiologie und Biotechnologie, Abteilung Pharmazeutische Mikrobiologie der Universität Bonn, übernommen. In der Abteilung wurde mit dem Kettenabbruchverfahren nach SANGER et al. (1977) gearbeitet. Es konnten jeweils Sequenzen bis zu einigen hundert Basen sequenziert werden.
2000 bp → 1200 bp → 800 bp → 400 bp → 200 bp → 100 bp →
1 2 3 4 5
← 1275 bp
1 = Low DNA Mass Ladder 2 = PCR Klon 14 a1cs/aka1c2as 3 = PCR Klon 15 a1cs/aka1c2as 4 = PCR Klon 16 a1cs/aka1c2as 5 = PCR Klon 17 a1cs/aka1c2as
Homologievergleich der ermittelten Sequenzen mit den puplizierten
Der Homologievergleich der Ergebnisse der Sequenzierung mit den bovinen Sequenzen (siehe Anhang) wurde mit dem Programm DNASIS v2.6 (HITACHI SOFTWARE ENGINEERING Co, San Francisco, CA, USA) durchgeführt. Alle Klone, deren Insert im Vektor sequenziert wurde, zeigten eine 98-100%ige Übereinstimmung mit den bovinen Sequenzen. In der Tab. 4 werden die unterschiedlichen geprüften und sequenzierten Klone mit dem jeweiligen Insert aufgeführt, wobei die Klone 18 und 20 jeweils einen Teil der Sequenz des bovinen αS1-Caseins enthalten. Diese Plasmide wurden freundlicherweise von Herrn PD Dr.
Hans-Martin Seyfert, Forschungsinstitut für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere, Dummerstorf, zur Verfügung gestellt.
Rezeptor α1A β2 α1A -- --
Name Insert aka1c1s/
aka1c1as
Tab. 4: Bezeichnungen der sequenzierten und geprüften Klone mit den Bezeichnungen der enthaltenen Inserts, deren Längen und der entsprechenden Rezeptorbezeichnung.
In-vitro Transkription
Für die Linearisierung des pGEM-T-Vektors zur in-vitro Transkription eignen sich die Restriktionsendonukleasen Nsi I und Sal I für die Transkription mit der T7-RNA-Polymerase und die Restriktionsendonukleasen Nco I und Sph I für die Transkription mit der SP6-RNA-Polymerase. Die Klone 18 und 20 wurden mit dem Enzym Pst I linearisiert. Die anschließende Transkription fand mit der T7-Polymerase statt.
Ähnlich wie bei der RNA wird auch die Konzentration der DNA im Photometer bestimmt. Eine E260 nm-Einheit entspricht dabei einer Konzentration von 50 µg/ml DNA. Der Ansatz für die Linearisierung setzte sich folgendermaßen zusammen:
x µl Plasmid-DNA (5 µg) 5 µl 10 x Puffer
x µl Enzym
mit DEPC-behandeltem Wasser ad 50 µl
Die eingesetzte Menge des Enzyms berechnete sich nach folgender Formel (SAMBROOK et al., 1989):
50 • N
RE [U] = --- • µg DNA;
cλ • L
wobei RE = die Menge an eingesetztem Restriktionsenzym ist, N = die Anzahl der Schnittstellen, L = die Größe des Plasmids in kb und cλ = eine enzymspezifische Konstante darstellt. Die cλ-Werte der einzelnen Enzyme, die jeweils dazugehörigen Optimalpuffer und die optimalen Reaktionstemperaturen der Enzyme sind nach den Herstellerangaben von BOEHRINGER, Mannheim, in Tab. 13 im Kapitel 8.6 aufgeführt.
Der Linearisierungsansatz wurde 2 h bei 37°C inkubiert. Danach wurde die DNA mit einer Phenol-Chloroform-Extraktion gereinigt. Dafür musste der Ansatz 1:1 mit Phenol-Chloroform versetzt werden. Es wurde gemischt und 3 min bei 14.000 g zentrifugiert. Danach wurde die obere Schicht in ein steriles Gefäß überführt, mit 1/10 Volumen 4 M NaCl und dem 2,5fachen Volumen eiskaltem 100 %igem Ethanol versetzt und 2 h bei –20°C gefällt. Anschließend wurde 30 min bei 14.000 g zentrifugiert. Das Pellet wurde zweimal mit 70 %igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 11 µl DEPC-behandeltem Wasser aufgelöst. Zur Kontrolle der Linearisierung wurde eine Gelelektrophorese mit 1 µl des Ansatzes durchgeführt (siehe Abb. 8). Als Beispiel ist die Linearisierung des Klons 14 mit den Enzymen Nsi I und Sph I abgebildet. In Tab. 5 ist aufgeführt, welche RNA-Polymerase die as- bzw.
die s-Sonde herstellt.
Klon 2 7 14 18 20
Protein α1A 199 bp β2 351 bp α1A 1275 bp Casein ca. 750 bp Casein ca. 850 bp T7-Polymerase as-Sonde as-Sonde s-Sonde as-Sonde s-Sonde
SP6-Polymerase s-Sonde s-Sonde as-Sonde -- --
Tab. 5: Auflistung, mit welcher RNA-Polymerase bei der Transkription der verwendeten Klone die as- bzw. die s-Sonde hergestellt werden.
Abb. 8: Elektrophoretische Kontrolle der Linearisierung der Vektoren für die Transkription.
Für die Transkription, d.h. die Herstellung markierter RNA, wurden entweder mit Dig oder mit Biotin markierte Nukleosidtriphosphate (NTPs) verwendet. Im NTP-Markierungsgemisch war jedes 20. bis 25. UTP mit Dig bzw. Biotin markiert (Dig RNA Markierungs-Kit, Biotin RNA Markierungs-Mix, ROCHE, Mannheim). Der Ansatz der Transkription setzte sich aus den Komponenten des Dig RNA Markierungs-Kits laut Herstellerangaben folgendermaßen zusammen:
x µl DEPC-behandeltes Wasser 2 µl NTP-Markierungsgemisch 2 µl 10 x Transkriptionspuffer 2 µl RNase-Inhibitor
mit DNA-Lösung (1 µg) ad 18 µl 2 µl RNA-Polymerase
Dabei musste streng die angegebene Reihenfolge beachtet werden. Der Transkriptionspuffer musste zimmerwarm sein, da sonst durch das enthaltene Spermidin die DNA ausgefallen wäre. Der Ansatz wurde vorsichtig auf Eis gemischt und für die Reaktion mit der T7-RNA-Polymerase 2 h, für die Transkription mit der SP6-RNA-Polymerase 3 h bei 37°C inkubiert (MELTON et al.,1984).
Dabei musste streng die angegebene Reihenfolge beachtet werden. Der Transkriptionspuffer musste zimmerwarm sein, da sonst durch das enthaltene Spermidin die DNA ausgefallen wäre. Der Ansatz wurde vorsichtig auf Eis gemischt und für die Reaktion mit der T7-RNA-Polymerase 2 h, für die Transkription mit der SP6-RNA-Polymerase 3 h bei 37°C inkubiert (MELTON et al.,1984).