Diskussion

Entwicklung der In situ-Hybridisierung für die αα1A-, αα2B- und ββ2-adrenergen Rezeptoren beim Rind

Die untersuchten Rezeptortypen bzw. –suptypen wurden nach unveröffentlichten Daten (AG Bruckmaier, Projektpartner im von der DFG geförderten Forschungs-projekt zum mammären adrenergen System-Rind, Institut für Physiologie, Forschungszentrum für Milch und Lebensmittel Weihenstephan, Technische Universität München) als die häufigsten adrenergen Rezeptoren in der Milchdrüse des Rindes ausgewählt: der α1A-Rezeptor stellvertretend für die α1-Rezeptoren, der α2B-Rezeptor für die α2-Rezeptoren und der β2-Rezeptor für die β-Rezeptoren.

Die In situ-Hybridisierung wurde parallel zu dem eigentlichen Zielgewebe auch in Leber, Niere und Lunge getestet, da diese Gewebe dafür bekannt sind, größere Mengen an mRNA der ausgewählten Rezeptoren, in Vergleich zur Milchdrüse zu enthalten (AG Bruckmaier).

Als Positivkontrolle für das Gewebe der Milchdrüse wurde mit einer Sonde für das αS1-Casein gearbeitet. αS1-Casein wird in großer Menge in den Alveolarepithelien der Milchdrüse exprimiert. Die praktische Durchführung der In situ-Hybridisierung für den Nachweis des αS1-Caseins erfolgte in Anlehnung an MOLENAAR et al. (1992).

Es wurde zunächst das Protokoll für den Nachweis der mRNA des αS1-Caseins in Paraffinschnitten der Milchdrüse mit nicht-radioaktiver In situ-Hybridisierung erarbeitet. Anschließend wurde versucht, dieses Protokoll auf die In situ-Hybridisierung der ausgewählten adrenergen Rezeptoren zu übertragen. Als dies nicht gelang, wurde für die radioaktive In situ-Hybridisierung der Einsatz von ³⁵S getestet. Es war jedoch aus nicht bekannten Gründen kein ausreichender Einbau von radioaktiv markierten Nukleinsäuren möglich. Mit ³³P wurde die In situ-Hybridisierung für das αS1-Casein in Gefrierschnitten der Milchdrüse etabliert.

Daraufhin erfolgte die Übertragung des Protokolls auf die radioaktive In situ-Hybridisierung der adrenergen Rezeptoren in Milchdrüse, Leber, Niere und Lunge.

Mit dieser Methode konnte die Lokalisation der Expression des α1A-Rezeptors in den

Hepatozyten der Leber und die Lokalisation des α2B-Rezeptors in den Glomeruli der Niere nachgewiesen werden. Der β2-Rezeptor konnte in keinem Gewebe nachgewiesen werden. Der Nachweis der adrenergen Rezeptoren konnte auf mRNA-Ebene mit der radioaktiven In situ-Hybridisierung in Gefrierschnitten der Milchdrüse nicht erbracht werden. Der Nachweis mittels RT-PCR in Gesamt-RNA in der Zitzen- und Zisternenregion der Milchdrüse erwies sich in den eigenen Arbeiten als unproblematisch.

Obwohl die adrenergen Rezeptoren in Milchdrüsen-Gewebehomogenaten in ausreichender Menge für Radiorezeptortests zur Verfügung stehen (HAMMON et al., 1994) und mit ihrer Stimulierung messbare in vivo-Reaktionen hervorzurufen sind (BRUCKMAIER et al., 1997), scheinen sie auf mRNA-Ebene sehr gering exprimiert zu sein. NUOVO et al. (1992), geben an, dass allgemein mit der nicht-radioaktiven In situ-Hybridisierung eine Sensitivität von 20 Transkripten/Zelle erreicht werden kann.

HARPER und MARSELLE (1986) zeigten, dass die radioaktive In situ-Hybridisierung sensitiver ist. Mit ihr können auch weniger als 20 Transkripte pro Zelle nachgewiesen werden. Demnach liegen die Expressionsdaten der adrenergen Rezeptoren in der Milchdrüse möglicherweise unterhalb der Sensitivitätsgrenze der radioaktiven In situ-Hybridisierung. Um dieser Frage nachzugehen, wird im Folgenden eine Modellrechnung versucht:

Es ist problematisch, Ausgangswerte für eine solche Berechnung zu finden, da quantitative Angaben aus der RT in mol spezifischer mRNA eines Genes pro µg Gesamt-RNA und gleichzeitig die Ergebnisse einer etablierten In situ-Hybridisierung für das Gen benötigt werden. Bei der Untersuchung von Gewebeproben aus der Milchdrüse des Rinds mittels quantitativer RT-PCR wurde für den α1A-adrenergen Rezeptor eine Konzentration von ca. 10 x 10^-3 amol spezifischer mRNA/µg Gesamt-RNA gemessen (WELLNITZ et al., 2001). In einem Mol einer Verbindung sind laut Loschmidt Zahl 6,02252 x 10²³ Moleküle enthalten. D.h., dass in der Milchdrüse 6,0 x 10³ Moleküle spezifischer α1A-Rezeptor mRNA/µg Gesamt-RNA enthalten sind.

Eine Zelle beinhaltet 6,4 pg DNA (CHEEK und HILL, 1970). Laut CAPUCO et al.

(2001) ist in der Milchdrüse des Rindes das Verhältnis von RNA zu DNA 1,56.

Daraus kann errechnet werden, dass der RNA-Gehalt pro Zelle bei etwa 10 pg liegt.

Daraus folgt, dass eine Zelle 6,0 x 10^-2 Moleküle α1A-mRNA enthält.

Das Ergebnis dieser Berechnung zeigt, dass die Anzahl der Transkripte pro Zelle in der vorliegenden Arbeit weit unter der in der Literatur beschriebenen Nachweisgrenze liegt. Der errechnete Wert liegt um den Faktor von ca. 350 niedriger, als die für einen Nachweis benötigten 20 Transkripte pro Zelle. Allerdings ist diese Rechnung lediglich als Versuch anzusehen, mit dem gezeigt werden soll, in welcher Größenordnung ein Transkript in einem Gewebe exprimiert wird. Die Zahlen sind nicht als Absolutwerte zu deuten, da sie einige Fehler beinhalten. So wird bei der Berechnung davon ausgegangen, dass bei der RT 100 % der mRNA in cDNA umgeschrieben ist, wovon bei optimalen Bedingungen nicht mehr als 90 % erreicht werden (FREEMAN et al., 1999). Außerdem wurde die Menge an mRNA der adrenergen Rezeptoren auf alle Zellen der Milchdrüse umgerechnet. Da davon ausgegangen wird, dass sich die adrenergen Rezeptoren in den glatten Muskelzellen um die Milchgänge herum befinden, stellt die Zellpopulation, in der die adrenergen Rezeptoren tatsächlich exprimiert werden, einen Bruchteil der gesamten Zellen der Milchdrüse dar. Daraus folgt, dass die absolute Zahl der Transkripte pro Zelle größer ist als die errechnete und sich damit dem Schwellenwert von 20 Transkripten pro Zelle annähert.

Als Vergleich zu der Rechnung mit der mRNA des α1A-adrenergen Rezeptors wird eine Vergleichsrechnung mit dem c-erbB-2-Gen durchgeführt, um die Richtigkeit der Rechnung zu demonstrieren. Das c-erbB-2-Gen ist ein Onkogen, das vermehrt beim Brustkrebs des Menschen exprimiert wird und eine schlechte Prognose in Bezug auf Ansprechbarkeit auf medikamentöse Therapie bedeutet (RÉVILLION et al., 1997).

RÉVILLION et al. (1997) haben in Biopsien von Brustkrebs beim Menschen bis zu 1,15 amol c-erbB-2 mRNA/µg Gesamt-RNA gefunden. Das bedeutet, dass in einem µg Gesamt-RNA 6,9 x 10⁵ c-erbB-2 mRNA-Moleküle enthalten sind. Unter Zugrundelegung der Annahme, dass das RNA/DNA-Verhältnis in der Milchdrüse des Menschen ähnlich ist wie beim Rind, ergibt sich ein Wert von 6,9 Molekülen c-erbB-2 mRNA pro Zelle.

Auch hier liegt ein kleiner Fehler bei der Berechnung vor, da in der In situ-Hybridisierung des c-erbB-2-Gens bei ÖTZTÜRK et al. (1998) deutlich wird, dass das c-erbB-2-Gen nur in einem Teil der Zellen exprimiert wird. So kann davon ausgegangen werden, dass bei der c-erbB-2-mRNA die Schwelle von 20 Transkripten pro Zelle, die für den In situ-Hybridisierung-Nachweis nötig sind, überschritten wird.

Die Hypothese, dass die adrenergen Rezeptoren in der Milchdrüse des Rindes unterhalb der Sensitivitätsgrenze der In situ-Hybridisierung exprimiert werden, wird auch durch die Ergebnisse im Northern Blot unterstrichen. Es ist selbst mit dem Einsatz großer Mengen an mRNA (4 µg Poly(A)⁺-mRNA) aus der Leber lediglich eine schwache Bande im Blot zu erzielen. Mit entsprechenden Proben aus Gewebe der Milchdrüse konnte im Northern Blot keine Bande nachgewiesen werden. Mit dem Ergebnis aus dem Northern Blot mit Leber-mRNA ist nachgewiesen, dass die Hybridisierung der Sonde möglich ist, in der Milchdrüse aber nicht die ausreichende Menge mRNA vorhanden ist, um einen Nachweis im Northern Blot zu ermöglichen.

NICHOLAS et al. (1996) argumentieren, dass negative Ergebnisse in der In situ-Hybridisierung mit Vorsicht interpretiert werden müssen, da ein negativer Nachweis eines Transkriptes eine physiologische Bedeutung nicht ausschließt. Glatte Muskelzellen, wie die Muskelzellen um die großen Milchgänge, sind über Gap junctions miteinander verbunden. Wird in einer Muskelzelle eine Kontraktion durch die Wirkung eines α-Agonisten ausgelöst, so breitet sich die Kontraktion über die elektrische Kopplung der Zellen über die Gap junctions über den gesamten Zellverband aus (CHRIST, 1995). Deshalb werden für die Auslösung einer physiologischen Reaktion nur wenige Rezeptoren benötigt. Diese Tatsache bildet einen möglichen Erklärungsansatz für die messbare Reaktion bei in vivo-Versuchen nach Stimulierung der adrenergen Rezeptoren trotz der geringen Expression der Rezeptoren in der Milchdrüse des Rindes.

Diskussion der angewandten Methode

Der Erfolg der Entwicklung einer In situ-Hybridisierung für eine gering exprimierte mRNA hängt stark von der Integrität der Ziel-mRNA in den Gewebeschnitten und der Fähigkeit der Sonden, das Gewebe zu penetrieren, um mit der mRNA zu hybridisieren, ab. Eine weitere Voraussetzung ist ein starkes Reportersystem, das eine geringe Anzahl von Sonden-mRNA-Hybriden sichtbar machen kann, während die Hintergrund-Färbung so gering wie möglich bleiben sollte.

Gewebepräparation

Für die Integrität der mRNA in Gewebeschnitten ist die Aufbereitung des Gewebes von entscheidender Bedeutung. Bei der Prozedur der Einbettung des Gewebes in Paraffin, bei der die Morphologie des Gewebes sehr gut erhalten bleibt, geht bis zu 30 % der mRNA verloren (LEITCH et al., 1994, BOEHRINGER MANNHEIM, 1996, JIN und LLOYD, 1997). Soll ein gering exprimiertes Gen nachgewiesen werden, ist es deshalb günstiger, mit Gefrierschnitten zu arbeiten, obwohl die Gewebestruktur bei dieser Technik oft zerstört wird, die Handhabung der Schnitte schwieriger ist und sich nicht alle Gewebe für diese Technik eignen. Für Gefrierschnitte muss das Gewebe in dickere Scheiben (ca. 12-20 µm) geschnitten werden, als es für Paraffinschnitte nötig ist (ca. 6-8 µm), woraus bei der Beurteilung im Mikroskop für Gefrierschnitte ein weiterer Morphologieverlust resultieren kann. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst versucht, die In situ-Hybridisierung für die adrenergen Rezeptoren mit Hilfe von Paraffinschnitten zu entwickeln, da es von entscheidender Bedeutung war, eine möglichst gute Erhaltung der Gewebemorphologie und damit eine hohe zelluläre Auflösung zu gewährleisten. Die Integrität der mRNA in den Paraffinschnitten wurde getestet indem in Anlehnung an MIES (1994) Gesamt-RNA aus einigen Schnitten extrahiert und anschließend eine RT-PCR durchgeführt wurde.

Aus den positiven Ergebnissen dieser Untersuchung ergibt sich, dass die mRNA in den Paraffinschnitten intakt war und somit theoretisch für den Nachweis durch In situ-Hybridisierung zur Verfügung stand. Als die Versuche keinen Erfolg brachten, wurde der Einsatz von Gefrierschnitten getestet, um einem negativen Ergebnis in der In situ-Hybridisierung durch Degradierung eines Teils der mRNA vorzubeugen. Die Gefrierschnitte wurden nicht länger als zwei Tage nach ihrer Herstellung für die In situ-Hybridisierung verwendet. YANG et al. (1999) haben nach längerer als zweitägiger Lagerung von Gefrierschnitten einen Signalverlust festgestellt.

Es wurde also schließlich der Verwendung von Gefrierschnitten der Vorzug gegeben, da es wichtiger erschien, die mRNA möglichst gut zu erhalten und damit ein Signal zu produzieren, als die Morphologie sehr gut zu erhalten.

Gewebevorbereitung

Die Gewebevorbereitung ist ein entscheidender Schritt für die In situ-Hybridisierung, da durch sie eine gewisse Permeabilisierung des Gewebes stattfinden soll. Diese Vorbereitung des Gewebes muss für jeden Gewebetyp optimiert werden (SINGER et

al., 1986). Dabei können die unterschiedlichen Möglichkeiten der Gewebevor-bereitung beliebig kombiniert werden. Paraffinschnitte müssen entparaffinisiert werden. Dazu werden sie in Xylol inkubiert, in dem sich das Paraffin löst, das Gewebe aber nicht verändert wird.

Gefrierschnitte müssen vor einer In situ-Hybridisierung fixiert werden.

Soll später mit dem Enzym Peroxidase und dem Substrat DAB gearbeitet werden, muss zu Beginn eines Versuches die Wirkung der endogenen Peroxidase mit Hilfe einer Inkubation in Wasserstoffperoxid unterdrückt werden. Es kann nötig sein, eine Proteinverdauung durchzuführen, da Proteine, besonders nach quervernetzenden Gewebefixierungen, wie der Fixierung mit Paraformaldehyd, die mRNA im Gewebeschnitt maskieren können. Die Proteinverdauung, z.B. mit Proteinase K oder Pepsin, darf aber auch nicht zu stark sein, da dann eventuell die mRNA freigesetzt wird, somit aus dem Gewebe verloren geht und die Morphologie des Gewebes zerstört werden kann (MILLAR et al., 1993). YANG et al. (1999) haben festgestellt, dass sie die besten Ergebnisse erzielt haben, wenn sie sowohl in Gehirn, als auch in Zungengewebe eine leichte Proteinase K-Verdauung durchgeführt haben. Sie vermuten, dass diese Behandlung universell einsetzbar sein könnte, da es sich bei den getesteten Geweben um sehr verschiedene handelt.

Nach der Proteinverdauung kann eine weitere Fixierung in 4 %igem Paraformaldehyd durchgeführt werden, um einem Nukleinsäureverlust vorzubeugen, wie von JIN und LLOYD (1997) empfohlen.

Die Gewebeschnitte können des weiteren mit Detergenzien vorbehandelt werden, um Lipidmembranen und Lipide aus fettreichen Geweben, wie z.B. myelinisierten Hirnregionen, zu extrahieren. Dabei kommen Triton^ X-100 oder Tween 20^ zum Einsatz. Eine weitere Möglichkeit der Gewebevorbehandlung ist die Inkubation in 0,2 M Salzsäure. Die genaue Wirkung dieser Behandlung ist nicht bekannt, allerdings könnte eine Extraktion von Proteinen und eine partielle Hydrolyse von Zielsequenzen zu einem verbesserten Signal/Hintergrund-Verhältnis führen (zusammengefasst nach BOEHRINGER MANNHEIM, 1996). Das Gleiche gilt für die Gewebevorbehandlung mit Chloroform.

Eine Acetylierung neutralisiert positiv geladene Moleküle und verhindert dadurch eine unspezifische Bindung der Sonde sowohl am Gewebe als auch an mit positiven Ladungen beschichteten Objektträgern, wie in der vorliegenden Arbeit verwendet (LEITCH et al. 1994).

Vor der eigentlichen Hybridisierung können die Gewebeschnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert und getrocknet werden, um ein Verdünnen der Sonden zu verhindern, und/oder es wird eine Prähybridisierung in dem später benutzten Hybridisierungsmix durchgeführt, um das Gewebe an die Bedingungen während der Hybridisierung zu äquilibrieren.

In der vorliegenden Arbeit wurden diese Möglichkeiten der Gewebevorbereitung für die In situ-Hybridisierung in vielen Varianten und Kombinationen für die unterschiedlichen Sonden und Gewebe getestet. Dabei stellte sich heraus, dass die Vorbereitung von Paraffinschnitten des Milchdrüsengewebes für die nicht-radioaktive In situ-Hybridisierung mit der αS1-Caseinsonde optimal war, wenn das Gewebe nach dem Entparaffinisieren 10 min mit 0,2 M Salzsäure behandelt, eine 15-minütige Inkubation mit 20 µg/ml Proteinase durchgeführt wurde und sich die Acetylierung anschloss. Abschließend wurden die Gewebeschnitte dehydriert. Bei der entsprechenden radioaktiven In situ-Hybridisierung wurde die Gewebevorbereitung folgendermaßen durchgeführt: Auftauen, 60 min Fixierung in 4 %igem Paraformaldehyd, Acetylierung, Gewebepermeabilisierung mit einer 5-minütigen Inkubation in Chloroform, Dehydrierung in einer aufsteigenden Alkoholreihe. Es kann dadurch, dass trotz zahlreicher Modifikationen die Hybridisierungen der Sonden für die adrenergen Rezeptoren mit Milchdrüsengewebe keine Ergebnisse erbracht haben, nicht mit Sicherheit gesagt werden, ob diese Art der Gewebevorbereitung, wie sie für die Hybridisierung mit der αS1-Casein-Sonde durchgeführt wurde, auch für die Sonden der adrenergen Rezeptoren in der Milchdrüse optimal ist.

Auswahl der Art der Sonden

Bei der Entwicklung einer In situ-Hybridisierung muss entschieden werden, mit welcher Art von Sonden gearbeitet werden soll. Dabei gibt es die Möglichkeiten, mit DNA-Sonden, synthetischen Oligonukleotidsonden oder RNA-Sonden zu arbeiten.

Wenn man die Expression eines Genes über den Nachweis seiner mRNA im Zytoplasma untersuchen möchte, kann man theoretisch mit allen drei Möglichkeiten arbeiten. Allerdings sind RNA-DNA-Hybride weniger stabil als RNA-RNA-Hybride.

Synthetische Oligonukleotidsonden, kurze Nukleinsäuremoleküle von ca. 20-40 Basen Länge, binden sehr spezifisch und sind relativ einfach herzustellen, allerdings begrenzt die geringe Länge die Zahl der eingebauten Markermoleküle und damit die Sensitivität der Sonden. Um die Sensitivität zu erhöhen, kann versucht werden, mit

einem Cocktail von synthetischen Oligonukleotidsonden zu arbeiten. Allerdings muss bei der Verwendung von Oligonukleotidsonden sichergestellt sein, dass die ausgewählten Sequenzen ausschließlich in der nachzuweisenden mRNA vorkommen. Dazu muss möglichst das gesamte Genom sequenziert sein, was beim Rind nicht der Fall ist. Es ist wahrscheinlicher, dass ähnliche Sequenzen auch noch an anderer Stelle des Genoms vorkommen, wenn man mit Oligonukleotidsonden arbeitet, als wenn man mit RNA- oder DNA-Sonden arbeitet, die aus wesentlich längeren Nukleinsäuremolekülen bestehen. RNA-Sonden sind sehr spezifisch und bis zu zehnmal sensitiver als die entsprechenden DNA-Sonden (SCHENBORN und MIERENDORF, 1985). Allerdings sind sie auch sehr empfindlich gegenüber ubiquitär vorkommenden RNasen, so dass bei ihrer Verwendung besondere Vorsichtsmaßnahmen für möglichst RNase-freies Arbeiten getroffen werden müssen (zusammengefasst nach LEITCH et al., 1994). Da sowohl die Sensitivität als auch die Spezifität in der vorliegenden Arbeit entscheidende Rollen spielen, wurde die Arbeit mit RNA-Sonden den anderen Möglichkeiten vorgezogen.

Präparation der DNA-Matritzen für die in vitro-Transkription

Für die in vitro-Transkription gibt es verschiedene Möglichkeiten, DNA als Vorlage vorzubereiten. Es kann eine in vitro-Transkription von einem Transkriptionsvektor, einem Plasmid, durchgeführt werden. In einem Transkriptionsvektor wird die Sequenz der gewünschten Sonde von Promotoren für RNA-Polymerasen flankiert (MELTON et al., 1984).

Eine andere Möglichkeit ist es, die Transkription direkt von einem PCR-Produkt durchzuführen. Dazu muss in der PCR ein Promotor für eine RNA-Polymerase an einen Primer gekoppelt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst versucht, die in vitro-Transkription von einem Transkriptionsvektor durchzuführen.

Die Sonden, die in der in vitro-Transkription von einem Transkriptionsvektor von der T7-RNA-Polymerase hergestellt wurden, waren durchgehend verwendbar, die komplementären, die von der SP6-RNA-Polymerase produziert wurden, jedoch teilweise nicht. Teilweise wurde kein oder sehr wenig Sondenmaterial hergestellt oder die Länge des Produktes stimmte nicht mit der des Produktes der T7-RNA-Polymerase überein. Außerdem erschien es sehr aufwändig, die DNA-Matritzen für die Transkriptionsreaktionen durch Klonierung, Plasmidpräparation und Linearisierung vorzubereiten. Deshalb wurde dazu übergegangen mit der direkten

Transkription vom PCR-Produkt zu arbeiten. Dafür wurde jeweils an einen Primer der Promotor für die T7-RNA-Polymerase angehängt, da mit diesem Enzym keine Probleme auftraten. Damit konnten die Probleme beseitigt werden, die durch die Verwendung der SP6-RNA-Polymerase aufgetreten waren. Allerdings stellte sich bei der direkten Transkription vom PCR-Produkt das Problem, ausreichende Mengen von DNA als Matritzen zu erhalten, da die DNA für die empfindliche Transkriptionsreaktion besonders aufgearbeitet werden musste, und bei der Aufarbeitung über 50 % des PCR-Produkts verloren ging. Um die nötige Menge PCR-Produkt zu produzieren, musste mit der entsprechenden Anzahl an Ansätzen gearbeitet werden.

Der Methode der direkten in vitro-Transkription vom PCR-Produkt wurde der Transkription vom Plasmid der Vorzug gegeben, da der methodische Aufwand bei der Transkription vom PCR-Produkt geringer erscheint.

Markierung der Sonden

RNA-Sonden lassen sich durch in vitro-Transkription entweder nicht-radioaktiv oder radioaktiv markieren. Bei der nicht-radioaktiven Markierung wird zwischen der Markierung mit direkt nachweisbaren Molekülen wie Fluoreszenzfarbstoffen, oder indirekt nachzuweisenden Molekülen wie Biotin oder Digoxigenin, unterschieden. Die direkte Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen ist dabei weniger sensitiv, als die indirekte (LEITCH et al., 1994). Bei der nicht-radioaktiven Markierung können durch den Einbau von zu vielen Markermolekülen in die Sonde bei der Hybridisierung Störungen durch sterische Effekte auftreten. Deshalb wird die in vitro-Transkription mit einem nicht-radioaktiven Markierungsmix durchgeführt, in dem lediglich jedes 20.

bis 25. Uracil markiert ist. Aus dieser Tatsache ergibt sich eine Sensitivitätsgrenze für die so markierten Sonden, da nicht unbegrenzt viele Basen markiert werden.

Als erstes nicht-radioaktives Markermolekül wurde Biotin in Nukleinsäuren eingebaut (LANGER et al., 1981). Die Detektion erfolgt dabei über ein Streptavidin-Enzym-System. Dabei können aber Probleme auftreten, wenn das Testgewebe biotinreich ist, was z.B. in der Leber der Fall ist, wodurch eine relativ hohe unspezifische Bindungsrate resultieren könnte. Dieses Problem stellt sich bei der Markierung mit dem Molekül Digoxigenin nicht, da Digoxigenin natürlicherweise ausschließlich in den Blüten und Blättern von Digitalis purpurea vorkommt. Deshalb bindet der

hochspezifische Anti-Digoxigenin-Antikörper nicht an anderes biologisches Material (zusammengefasst nach HERRINGTON et al., 1989).

In der vorliegenden Arbeit wurden zwar unterschiedliche Markierungssysteme getestet, das Hauptaugenmerk allerdings auf die Markierung mit Digoxigenin gelegt.

Das αS1-Casein konnte mit nicht-radioaktiver Markierung mit Digoxigenin in der In situ-Hybridisierung in der Milchdrüse nachgewiesen werden. Der Nachweis der adrenergen Rezeptoren war mit nicht-radioaktiv markierten Sonden in den getesteten Geweben nicht möglich.

Bei der radioaktiven Markierung handelt es sich um radioaktive Isotope von Elementen, die direkt in eine Base oder in eine zugehörige Phosphatgruppe eingebaut sind. Da die radioaktiv markierte Sonde keine Seitengruppen trägt, kommt

Bei der radioaktiven Markierung handelt es sich um radioaktive Isotope von Elementen, die direkt in eine Base oder in eine zugehörige Phosphatgruppe eingebaut sind. Da die radioaktiv markierte Sonde keine Seitengruppen trägt, kommt