der Tierärztlichen Hochschule Hannover
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Untersuchungen zum Vorkommen von Scrapie-Prion-Protein in Tonsillenbioptaten genetisch hochempfänglicher
Schafe in Niedersachsen
I N A U G U R A L – D I S S E R T A T I O N
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Maike Andrzejewski
aus Herne
Hannover 2005
Univ. Prof. Dr. Martin Ganter
1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. Martin Ganter
2. Gutachter: PD Dr. Martin H. Groschup
Tag der mündlichen Prüfung: 3. Juni 2005
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Niedersächsisches Ministerium für den ländlichen Raum, Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz sowie durch die Niedersächsische Tierseuchenkasse.
Meinen Eltern
und Klaus Palm gewidmet .
1 Einleitung ... 11
2 Literaturübersicht ... 12
2.1 Übertragbare Spongiforme Enzephalopathien ... 12
2.2 Der Krankheitserreger ... 13
2.2.1 Hypothesen zur Natur des Erregers... 13
2.2.1.1 Die Prion-Hypothese ... 13
2.2.1.2 Die Virus-Hypothese... 14
2.2.1.3 Die Virino-Hypothese ... 15
2.2.2 Das zelluläre Prion-Protein (PrPc)... 15
2.2.3 Die Scrapie-Isoform des Prion-Proteins (PrPSc)... 16
2.2.4 TSE-Erregerstämme ... 18
2.3 Erregerinaktivierung... 19
2.4 Scrapie... 20
2.4.1 Genetisch bedingte Scrapie-Empfänglichkeit ... 20
2.4.2 Klinik... 24
2.4.3 Pathologie und Pathogenese... 25
2.4.3.1 Pathogenese... 25
2.4.3.2 Histopathologie ... 28
2.4.4 Übertragbarkeit... 29
2.5.1 Immunhistochemie (IHC) ... 33
2.5.2 Immunoblot ... 34
2.5.2.1 Western blot ... 34
2.5.2.2 PET blot... 34
2.5.2.3 ELISA... 35
2.5.3 Maus-Bioassay ... 35
2.5.4 In Deutschland zugelassene Schnelltests ... 36
2.5.4.1 Prionics-Check Western... 36
2.5.4.2 Biorad Platelia ELISA... 36
2.5.4.3 Enfer ELISA (Abbott)... 37
2.5.5 Scrapie-Lebendtests ... 38
2.6 Scrapie-Bekämpfung innerhalb der EU ... 39
2.6.1 TSE-Überwachung bei Schafen ... 39
2.6.2 Programm zur Züchtung TSE-resistenter Schafe... 40
2.6.3 Maßnahmen bei Feststellung eines Scrapie-Falles... 41
2.6.4 Durchführungsbestimmungen für Niedersachsen ... 42
3 Eigene Untersuchungen... 44
3.1 Material und Methoden ... 44
3.1.1.2 Blutentnahme ... 44
3.1.1.3 Anästhesie ... 44
3.1.1.4 Biopsie... 45
3.1.2 Methoden... 45
3.1.2.1 Entnahme der Tonsillenbioptate... 45
3.1.2.2 Aufbereitung der Gewebeproben ... 49
3.1.2.3 Immunhistochemie zum Nachweis von PrPSc... 49
3.1.2.4 Nachweis von PrPSc mit der PET blot Methode... 49
3.1.2.5 Typisierung des Prionproteingens... 50
3.2 Zur Analyse von Bioptatentnahmen... 53
3.2.1 Versuchsanordnung... 53
3.2.2 Ergebnisse ... 53
3.2.2.1 Durchführung der Tonsillenbiopsie ... 53
3.2.2.2 Vorkommen von lymphatischem Gewebe im Bioptat und die Anzahl der im histologischen Schnitt vorhandenen Lymphfollikel... 54
3.2.2.3 Trainingseffekte bei der Bioptatentnahme –Darstellung der Auswertung der ersten 100 Gewebeproben gegenüber den letzten 100 Gewebeproben... 56
3.3 Zur Verbreitung von Resistenzgenen bei niedersächsischen Schafrassen ... 58
3.3.1 Versuchsanordnung... 58
3.4 Nachweis von Scrapie-Prion-Protein in Tonsillenbioptaten genetisch empfänglicher
Schafe aus Scrapie-unverdächtigen, niedersächsischen Beständen ... 62
3.4.1 Versuchsanordnung... 62
3.4.2 Ergebnisse ... 62
3.5 Nachweis von Scrapie-Prion-Protein in Tonsillenbioptaten genetisch empfänglicher Schafe aus Scrapie positiven, niedersächsischen Beständen ... 64
3.5.1 Versuchsanordnung... 64
3.5.1.1 Bestand A ... 64
3.5.1.2 Bestand B ... 65
3.5.1.3 Bestand C ... 66
3.5.1.4 Bestand D ... 67
3.5.2 Ergebnisse ... 67
3.5.2.1 Bestand A ... 67
3.5.2.2 Bestand B ... 71
3.5.2.3 Bestand C ... 72
3.5.2.4 Bestand D ... 76
3.6 Versuch zur Bestimmung des Scrapie-Status einer Herde mit fraglichem Status ... 78
3.6.1 Versuchsanordnung... 78
3.6.2 Ergebnisse ... 78
6 Zusammenfassung... 99
7 Summary ... 102
8 Literaturverzeichnis... 105
8.1 Gesetze und Verordnungen ... 130
APES Aminopropyltriethoxysilane
AS Aminosäure
BCS Body Condition Score
BMVEL Bundesministerium für Verbraucherschutz, Ernährung und Landwirtschaft BSE Bovine Spongiforme Enzephalopathie
bzw. beziehungsweise
CJD Creutzfeldt-Jakob-Krankheit CWD Chronic Wasting Disease
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay fCJD familiäre Creutzfeldt-Jakob-Krankheit FDC follikulär dentritische Zellen
FFI Fatale Familiäre Insomnie FLI Friedrich-Loeffler-Institut
FSE Feline Spongiforme Enzephalopathie GALT gut-associated lymphoid tissue
GSS Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom
H Histidin
iCJD iatrogene Creutzfeldt-Jakob-Krankheit IHC Immunhistochemie
LAVES Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit Lnn. Lymphonodi
NMR nuclear magnetic resonance o.g. oben genannt
O.I.E. Office International des Epizooties ORF open reading frame (offener Leserahmen) PCR Polymerasekettenreaktion
PET blot paraffin-embedded tissue blot PK Proteinase K
Prion proteinaceous infectious particle PrP Prion-Protein
PrPc zelluläres Prion-Protein
PrPSc Scrapie-Isoform des Prion-Proteins
Q Glutamin
R Arginin
SAF Scrapie-assoziierte Fibrillen
sCJD sporadische Creutzfeldt-Jakob-Krankheit
Sinc-Gen scrapie incubation gen
Sip-Gen scrapie incubation period gen TKBA Tierkörperbeseitigungsanstalt
TME Transmissible Mink Encephalopathie
TSE Transmissible Spongiforme Enzephalopathie
V Valin
vCJD neue Variante der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit WB Western blot
ZNS zentrales Nervensystem
1
Einleitung
Die Traberkrankheit der Schafe, auch Scrapie genannt, ist die am längsten bekannte Übertragbare Spongiforme Enzephalopathie. Eine Übertragung von Scrapie auf den Menschen ist bisher nicht bekannt. Im Gegensatz dazu gilt es als erwiesen, dass die bekannteste Transmissible Spongiforme Enzephalopathie, die Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE), auf den Menschen übertragbar ist. Eine originäre BSE ist klinisch sowie postmortal mit den heutzutage durchgeführten Schnelltestmethoden nicht von einer originären Scrapie beim Schaf zu unterscheiden. Daher unterliegen beide Erkrankungen entsprechend dem Tierseuchenrecht gleicher Maßregelung.
Vor der Einführung einer EU-weiten Untersuchungspflicht wurden in Niedersachsen nur sporadisch Untersuchungen auf Scrapie durchgeführt. Bei Schafen ist, aufgrund der bei einigen Genotypen vorhandenen lymphogenen Ausbreitung des Scrapie-Erregers, eine intravitale bzw. präklinische Diagnosestellung anhand von Bioptatuntersuchungen von Lymphgewebe möglich. Weiterhin ist bei Schafen ein genetischer Zusammenhang zwischen Empfänglichkeit und Resistenz bezüglich einer Scrapie-Erkrankung bekannt. Eine lymphogene Ausbreitung konnte bei Rindern bislang nicht entdeckt werden. Ebenso ist bei Rindern keine genetisch bedingte Resistenz oder Empfänglichkeit bekannt.
Im Rahmen dieser Arbeit soll die praktische Anwendbarkeit der Tonsillenbioptatentnahme als präklinisches Diagnostikum von Scrapie bei lebenden Schafen untersucht werden. Es soll geklärt werden, ob die Tonsillenbioptatentnahme in der Praxis vor Ort durchführbar ist und wie zuverlässig die Gewinnung von aussagekräftigem Probenmaterial ist.
Die Bioptatuntersuchungen sollen eine Übersicht darüber geben, ob der Erreger präklinisch in Scrapie-unverdächtigen, niedersächsischen Schafbeständen bei genetisch empfänglichen Tieren nachweisbar ist. Im Vergleich dazu sollen Bioptatuntersuchungen in Scrapie- verdächtigen Herden durchgeführt werden.
Da zu Begin der Arbeit noch keine entsprechenden Daten bekannt waren, soll eine Übersicht über die Verbreitung von genetisch resistenten Tieren in der Gruppe der untersuchten Schafe gewonnen werden.
2
Literaturübersicht
2.1 Übertragbare Spongiforme Enzephalopathien
Unter „Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien“ (TSE) versteht man eine Reihe von Erkrankungen, die übertragbar sind und nach einer monate- bis jahrelangen symptomfreien Inkubationszeit zu einer neurodegenerativen Schädigung des zentralen Nervensystems führen.
In den betroffenen Bereichen kommt es zur Ansammlung einer abnormen, pathologischen Isoform eines natürlich vorkommenden, zellulären Proteins. Aufgrund der Pathogenese werden diese Erkrankungen auch unter dem Begriff Prionkrankheiten zusammengefasst.
Erkrankte Individuen sterben nach einer meist nur kurzen klinischen Phase. Nicht alle spongiformen Enzephalopathien entstehen auf infektiösem Wege. Bei den Prionkrankheiten des Menschen unterscheidet man infektiöse, spontane und erbliche Ursachen. Bei der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD), von der erstmals HANS CREUTZFELDT (1920) und ALFONS JAKOB (1921) berichteten, sind heute eine iatrogene (iCJD), eine sporadische (sCJD), eine familiäre (fCJD) und seit Mitte der neunziger Jahre eine neue Variante bekannt (vCJD) (WILL et al. 1996; BUDKA 2001). Die Kuru, die bei Eingeborenen auf Papua- Neuguinea auftrat, wurde durch rituellen Kannibalismus übertragen (KLATZO et al. 1959).
Das Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom (GSS) ist ausschließlich hereditär bedingt (GERSTMANN et al. 1936). Die Fatale Familiäre Insomnie (FFI), die erstmals Mitte der achtziger Jahre beschrieben wurde, ist wie der Name schon verdeutlicht ebenfalls eine familiär-genetisch bedingte Prionerkrankung des Menschen (LUGARESI et al. 1986).
Bei den Tieren ist die Scrapie die häufigste TSE. Sie wurde schon 1732 beschrieben und 1983 legten PARRY und OPPENHEIMER ausführlich die geschichtlichen Hintergründe dar. Mitte der achtziger Jahre wurde in Großbritannien erstmals die Bovine Spongiforme Enzephalopathie der Rinder (BSE) beschrieben (WELLS et al. 1987). Die Ursache für die BSE-Epidemie liegt mit großer Wahrscheinlichkeit in der Verfütterung von Kraftfutter, welches ungenügend erhitztes, von Scrapie-infizierten Schafen stammendes Tiermehl enthielt (WILESMITH et al. 1988, 1991). Eine Verbindung zwischen BSE und dem Auftreten der vCJD Mitte der neunziger Jahre wird als gesichert angesehen. So konnten Infektionsversuche bei ingezüchteten Mauslinien mit BSE- und vCJD-haltigem Gehirnmaterial zeigen, dass die
Länge der Inkubationszeiten und die pathologischen Läsionsprofile bei vCJD-infizierten Mäusen bedeutende Ähnlichkeit mit denen aufweisen, welche BSE-infizierte Mäuse zeigen.
Daraus ergibt sich, dass der gleiche Erregerstamm, der BSE verursacht, auch für die Entstehung von vCJD in Frage kommt (BRUCE et al. 1997).
Weiter bei Tieren bekannte übertragbare spongiforme Enzephalopathien sind die Transmissible Mink Enzephalopathie (TME) der Zuchtnerze (BURGER u. HARTSOUGH 1965), die Chronic Wasting Disease (CWD) einiger Hirscharten (WILLIAMS u. YOUNG 1980; 1982), die Feline Spongiforme Enzephalopathie (FSE) der Haus- und einiger Wildkatzen (WYATT 1990; WILLOUGHBY et al. 1992) sowie spongiforme Enzephalopathien (SE) bei einigen in Gefangenschaft lebenden Antilopenartigen (KIRKWOOD u. CUNNINGHAM 1994). SCHOON et al. (1991) berichtete über eine spongiforme Enzephalopathie beim Rothalsstrauß ohne gesicherte Erkenntnisse bezüglich der Übertragbarkeit und der Ätiologie.
2.2 Der Krankheitserreger
Die Ätiologie der spongiformen Enzephalopathie konnte trotz intensiver Forschungstätigkeit bislang nicht mit letzter Sicherheit entschlüsselt werden. Der Erreger weist ungewöhnliche Eigenschaften auf, die ihn von den geläufigen Krankheitserregern unterscheiden. Er ist daher der Gruppe der unkonventionellen Krankheitserreger zuzuordnen.
2.2.1 Hypothesen zur Natur des Erregers 2.2.1.1 Die Prion-Hypothese
Bei Inaktivierungsstudien mit ionisierender und UV-Bestrahlung, Maßnahmen die Nukleinsäuren schädigen oder zerstören, blieb die Infektiösität des Erregers erhalten, weshalb ALPER et al. (1967) bereits die Vermutung äußerte, dass der Erreger keine Nukleinsäure enthält. Es wurde bereits zu dieser Zeit angenommen, dass es sich bei diesem Erreger um
infektiöse Proteine handeln könnte (GRIFFITH 1967). PRUSINER veröffentlichte 1982 eine Hypothese, in der er ein Eiweiß als alleinigen Bestandteil des infektiösen Agens von spongiformen Enzephalopathien darstellte. Für diesen neuartigen Erreger prägte PRUSINER aus der Bezeichnung „proteinaceous infectious particle“ den Begriff „Prion“, dem eine eigenständige Nukleinsäure fehlt (PRUSINER 1998). Mit der Gewissheit, dass es sich bei diesen Prionen konstant um ein Protein handelt, bezeichnete man den Erreger auch als Prion- Protein (PrP). Die Bauanleitung für dieses Protein befindet sich nicht im Erreger selbst. Ein wirtseigenes chromosomales Gen kodiert für das Prion-Protein (CHESEBRO et al. 1985;
OESCH et al. 1985). Dieses Gen lässt sich bei allen bislang untersuchten Säuger- und Vogelarten nachweisen. Es ist aktiv, das heißt, der Organismus produziert Prion-Proteine ohne daran zu erkranken (OESCH et al. 1985; BASLER et al. 1986). Dieses physiologische Prion-Protein reagiert im Gegensatz zum Erreger sensibel auf den Verdau durch die Proteinase K (PK) (MEYER et al. 1986). Somit werden zwei Formen von Prion-Proteinen unterschieden: Zum einen die physiologische oder auch zelluläre Form (PrPc), zum anderen das pathogene oder auch Scrapie-Prion-Protein (PrPSc), welches nicht sensibel auf den Verdau durch Proteinase K reagiert. Gemäß dem Heterodimer-Modell soll es durch Anlagerung eines PrPSc an die physiologische Proteinform zu einer Umwandlung in die pathogene Form kommen (PRUSINER 1991). Es wird ein katalytischer Zyklus in Gang gesetzt, in dem das neu entstandenen PrPSc weitere Umwandlungen induzieren kann. Über die mögliche Unterstützung durch einen Katalysator („Protein X“) wird diskutiert (TELLING et al. 1995;
KANEKO et al. 1997). Der Umwandlungsprozess vom natürlichen zum abnormen Prion- Protein ist bislang nicht vollständig geklärt. Im Gegensatz zu PrPc kann PrPSc nicht vollständig metabolisiert werden. Es aggregiert und lagert sich in Form von Amyloid ab. Obwohl das Prion-Modell bis heute nicht mit letzter Sicherheit bestätigt werden kann, wird es derzeit von den meisten Wissenschaftlern akzeptiert.
2.2.1.2 Die Virus-Hypothese
Die Virushypothese, die aktuell von DIRINGER (1994) und MANUELIDIS (1994) vertreten wird, geht davon aus, dass ein bislang unentdeckter viraler Erreger die Ursache der TSE ist.
Das Prion-Protein fungiert bei dieser Hypothese als Rezeptor auf der Zelloberfläche und
ermöglicht eine Infektion der Zelle, bei der es im Rahmen von Zelluntergängen zur Aggregation der Rezeptorproteine kommt. Es wird davon ausgegangen, dass eine erregerspezifische Nukleinsäure vorhanden sein muss, deren außergewöhnliche Resistenz gegenüber chemischen und physikalischen Behandlungen einer besonderen Art von Hülle zugeschrieben wird (DIRINGER 1994; MANUELIDIS 1994, 2003). Trotz intensiver Bemühungen konnten bislang weder Scrapie-spezifische Nukleinsäuren nachgewiesen, noch vollständig ausgeschlossen werden. Für die mögliche Existenz entsprechender Nukleinsäuren wurden allerdings stark einschränkende Bedingungen ermittelt (MEYER et al. 1991;
KELLINGS et al. 1992).
Für virale Infektionen ist das Vorkommen verschiedener Erregerstämme nicht ungewöhnlich.
Mit der Prion-Hypothese lässt sich diese Tatsache nur schwer erklären. Eine mögliche Erklärung bieten hier genetische Aspekte.
2.2.1.3 Die Virino-Hypothese
Diese, von DICKINSON und OUTRAM (1988) vorgeschlagene Hypothese geht davon aus, dass es eine besonders kleine wirtsfremde Nukleinsäure gibt, die sich durch ihre feste Verpackung, z.B. im aggregierten Prion-Protein, den Nachweisversuchen entzieht. Diese Hypothese ist in den letzten Jahren kaum weiterverfolgt worden.
2.2.2 Das zelluläre Prion-Protein (PrPc)
Hierbei handelt es sich um ein Zelloberflächenprotein von 33-35 kDa, das von einem wirtseigenen Gen kodiert wird und sensibel auf den Verdau durch Proteinase K reagiert. Je nach Spezies besteht das Translationsprodukt aus 253-273 Aminosäuren (AS). So kodiert zum Beispiel das Prion-Protein-Gen des Menschen für 253 AS (KRETZSCHMAR et al. 1986), das der Maus für 254 AS (OESCH et al. 1985; LOCHT et al. 1986) und das für Schaf und Ziege für 256 AS (GOLDMANN et al. 1990, 1996). Bei der Prozessierung des PrPc im endoplasmatischen Retikulum und im Golgi-Apparat wird das Signalpeptid aus den ersten 21
AS am Aminoterminus abgespalten. Es folgt die Abspaltung von 23 AS vom C-terminalen Ende und das Anhängen eines Glykophosphatidyl-Inositol-(GPI)-Ankers. Bevor PrPc mit Hilfe des Ankers an die zelluläre Plasmamembran gekoppelt wird, wird es zweifach glykosyliert und erhält eine Disulfidbrücke, die für die Stabilität der dreidimensionalen Struktur wichtig ist (PRUSINER 1998). Mit Hilfe der magnetischen Kernresonanzspektroskopie (NMR= nuclear magnetic resonance) konnte Mitte der neunziger Jahre die dreidimensionale Struktur des PrPc am Beispiel des PrPc der Maus aufgeklärt werden. Es können zwei Domänen unterschieden werden, von denen die C-terminale drei gut ausgebildete α-Helices und zwei antiparallele ß-Faltblätter enthält. Die N-terminale Hälfte der Polypeptidkette bildet einen flexiblen Schwanz (RIEK et al. 1996, 1997). Obwohl PrPc in nahezu allen Geweben zu finden ist, wird es vor allem von neuralen Zellen produziert (OESCH et al. 1985; BASLER et al. 1986; BENDHEIM et al. 1992). Die funktionellen Aufgaben des zellulären Prion-Proteins sind trotz intensiver Forschung bis heute noch nicht klar. Verschiedene Untersuchungen weisen darauf hin, dass die kupferbindenden Eigenschaften von PrPc eine funktionelle Bedeutung haben (STOCKEL et al. 1998; VILES et al. 1999). In diesem Zusammenhang wird auch über eine Bedeutung des PrPc für die Funktion der Dioxid-Dismutase diskutiert, die die zelluläre Resistenz gegenüber oxidativem Stress beeinflusst (BROWN et al. 1999). Aufgrund des Auftretens im neuronalen Bereich, vor allem an synaptischen Plasmamembranen, wird PrPc auch eine eventuelle Funktion bei der synaptischen Erregungs-Übertragung zugesprochen. So konnte bei Mäusen, die kein Prion- Protein exprimieren (sogenannte Prion-Protein-Knock-Out-Mäuse), eine Verlängerung der Aktivierungszeit von GABAA-Rezeptor vermittelten, inhibitorischen, postsynaptischen Strömen beobachtet werden (COLLINGE et al. 1994; HERMS 1999). Ebenfalls am Model von Knock-out-Mäusen konnte eine, für die Wiederherstellung des Ruhemembranpotentials bedeutende Beeinflussung der Amplitude kalziumaktivierter Kaliumströme in Purkinjezellen registriert werden (HERMS et al. 2001).
2.2.3 Die Scrapie-Isoform des Prion-Proteins (PrPSc)
Die pathologische Isoform des Prion-Proteins kann immunhistochemisch bei allen an TSE erkrankten Individuen nachgewiesen werden. Es akkumuliert im zentralen Nervensystem
hauptsächlich im Hirngewebe und bei einigen Spezies in bestimmten lymphatischen Geweben, wie zum Beispiel in den Peyer´schen Platten nach oraler Aufnahme. Geringere Mengen an PrPSc können je nach Spezies auch in anderen Geweben und Körperflüssigkeiten nachgewiesen werden. Bereits 1972 gelangen PATTISON Infektionsversuche bei Schaf und Ziege mit Nachgeburtsteilen von Scrapie-infizierten Tieren. Bei natürlich infizierten Schafen der Genotypklasse G5 kann PrPSc in lymphatischen Geweben wie der Milz, den Lymphonodi mesenteriales und retropharyngeales und den Tonsillae palatinae schon vor Ausbruch klinischer Symptome nachgewiesen werden (VAN KEULEN et al. 1996). Bei Versuchen mit Hamstern und Schafen, die auf oralem Wege mit Scrapie infiziert wurden, konnten vor dem Auftreten klinischer Symptome geringe Mengen an PrPSc in Muskelgewebe nachgewiesen werden (ANDREOLETTI et al. 2004; THOMZIG 2004). Allerdings sind größere Mengen an PrPSc in der Muskulatur erst im fortgeschrittenen Stadium der klinischen Phase nachweisbar und reichen für eine Infektionsübertragung wahrscheinlich nicht aus.
Da die Aminosäurenzusammensetzung des PrPSc der entspricht, die das vom Wirtsgen verschlüsselte physiologische Prion-Protein aufweist (BASLER 1986), kommt es zu keiner immunologischen Reaktion beim erkrankten Individuum. Während PrPc einen höheren Anteil an α-helikalen Strukturen aufweist, besteht PrPSc zu einem höheren Anteil aus β-Faltblatt- Strukturen (PAN et al. 1993).
Bei einer Behandlung des Erregers mit Proteinase K (PK) verbleibt ein 27-30 kDa großes Proteinfragment, welches gegenüber einem weiteren PK-Verdau stundenlang resistent ist.
Dieses Proteinfragment (PrP 27-30) ist das Kernstück des PrPSc (PRUSINER et al. 1987;
BARRY al. 1986; MCKINLEY 1983 ). Es aggregiert und bildet regelmäßige, amyloide Strukturen, die man nach Aufreinigung als Prion-Rods bzw. Scrapie-assoziierte Fibrillen (SAF) findet (PRUSINER et al. 1983). An transgenen Tieren, die nur noch PrP 27-30 exprimieren, konnte gezeigt werden, dass dieser Teil des Proteins zur Infektion sowie zur Ausbildung des entsprechenden Krankheitsbildes und zur weiteren Übertragung ausreicht (FISCHER et al. 1996).
Abbildung 1: Beta-Helix-Modell von PrP 27-30: Aufbau durch Zusammenfügung von hier fünf scheibenförmigen Trimeren, gebildet aus parallel linksgewundenen ß-helikalen, Strukturen (gelb). Die spiralförmigen Windungen stellen die α-helikalen Strukturen dar (rot) (GOVAERTS et al. 2004).
2.2.4 TSE-Erregerstämme
Bereits Anfang der sechziger Jahre entdeckte man klinische Unterschiede bei seriellen Passagen von zwei Scrapie-Isolaten in Wiederkäuern und Nagetieren (PATTISON u.
MILLSON 1961). Zahlreiche verschiedene TSE-Erregerstämme konnten seitdem identifiziert werden (BRUCE 1993; PRUSINER 1998; BRUCE et al. 2002; BRUCE 2003). Die Erregerstämme lassen sich anhand der klinischen Symptomatik (PATTISON u. MILLSON 1961), der Länge der Inkubationszeit, der Übertragbarkeit, der histopathologischen Läsionsprofile und der Art von PrPSc-Ablagerungen in bestimmten Gehirnarealen unterscheiden. Diese Unterschiede werden besonders deutlich im direkten Vergleich von
immer gleichen, hochempfänglichen Mausstämmen. Weitere Unterscheidungsmerkmale sind die Resistenz gegenüber Proteinase K, das Verhalten bei Inaktivierungsversuchen und die Glykosylierung des PrPSc. Neuere Untersuchungen lassen vermuten, dass die natürlich vorkommenden Scrapie-Stämme im Laufe der letzten 20 Jahre immer wieder Veränderungen unterlegen sind. Konnten ursprünglich fünf Scrapie-Stämme von Schafen phänotypisch definiert werden, so sind daraus im Laufe der Zeit, wahrscheinlich im Zusammenhang mit zahlreichen Mauspassagen mehr als 20 unterscheidbare Maus- und Hamster-adaptierte Stämme entstanden (BRUCE 1993, 2003).
2.3 Erregerinaktivierung
Wie in zahlreichen Studien gezeigt wurde, zeichnen sich TSE-Erreger durch eine relativ hohe Resistenz gegenüber chemischen und physikalischen Inaktivierungsversuchen aus. So bleiben herkömmliche Desinfektionsmaßnahmen, die zur Abtötung konventioneller Mikroorganismen, wie Viren und Bakterien verwendet werden, meist erfolglos (TAYLOR 2000). Zu den geeigneten chemischen Desinfektionsmitteln zählen unter anderem Natriumhydroxid (NaOH) (BROWN et al. 1986; TAYLOR et al. 1994), Guanidinium- Thiocyanat (GdnSCN) (MANUELIDIS 1997) und Natriumhypochlorit (NaOCl) (BROWN et al. 1986). Physikalische Dekontaminationsmethoden, wie die Anwendung trockener Hitze oder verschiedener Bestrahlungsvorgänge, erscheinen nur bedingt geeignet.
Für die Arbeit mit formalinfixiertem Gewebe in der Histologie, ist zum Schutz der mit diesen Materialien arbeitenden Personen, eine Behandlung der Gewebe mit Ameisensäure (CH2O2) vor der Routineeinbettung sinnvoll (BROWN et al. 1990).
Gemäß des Beschlusses 603 des Ausschusses für Biologische Arbeitsstoffe (BarbBl. 3/03) werden folgende Dekontaminations- und Inaktivierungsmaßnahmen bei Tätigkeiten mit TSE assoziierten Agenzien als zuverlässig beurteilt:
Thermische Verfahren:
o Autoklavierung in Dampfsterilisatoren mit Aerosolfiltern, möglichst im Vakuumverfahren bei 134°C, 3 bar absolut, ≥ 1 Stunde
o Verbrennung bei ≥ 850°C für ≥ 2 Sekunden oder ≥ 1000°C für ≥ 1 Sekunde Kombiniertes chemisch-thermisches Verfahren:
o Autoklavieren bei > 121°C, ≥ 30 Minuten, in 1 M NaOH Endkonzentration Chemische Verfahren:
o 1 M NaOH oder 2,5 % Natriumhypochlorit für ≥ 1 Stunde
2.4 Scrapie
Scrapie, die Transmissible Spongiforme Enzephalopathie (TSE) der Schafe ist schon seit 250 Jahren bekannt. Wo und wann genau die Erkrankung erstmalig auftrat ist nicht nachvollziehbar (BROWN u. BRADLEY 1998). Die erste schriftlich fixierte Beschreibung eines Scrapie-Falles in England stammt aus dem Jahr 1732 (MCGOWAN 1922). Die Erkrankung kommt auch bei der Ziege und beim Mufflon vor und ist heute mit Ausnahme von Australien und Neuseeland in nahezu allen Ländern der Welt verbreitet.
Die Verbreitung von Scrapie in Europa steht sehr wahrscheinlich in Zusammenhang mit dem Export von spanischen Merino-Schafen in zahlreiche Länder (PARRY 1983).
Bei den Scrapie-Erregern sind bisher über 20 verschiedene Stämme bekannt (BRUCE 1993).
Die Einteilung erfolgt nach klinischer Symptomatik, Inkubationszeit, Übertragbarkeit, histopathologischen Veränderungen bei der Maus und anderen Kriterien (siehe „TSE- Erregerstämme“).
2.4.1 Genetisch bedingte Scrapie-Empfänglichkeit
Für den Ausbruch einer klinischen Scrapie sind nach heutigem Wissenstand zwei Komponenten erforderlich:
1. Ein genetisch empfängliches Tier muss 2. Kontakt zum infektiösen Agens haben.
Die DNA des Prion-Protein-Gens von Mensch, Maus und Schaf weist zahlreiche Polymorphismen auf, die mit einer bestimmten Empfänglichkeit für Prionerkrankungen in direktem Zusammenhang stehen (GOLDMANN et al. 1990, 1991, 1994). Diese Genveränderungen bewirken an bestimmten Stellen den Einbau einer anderen Aminosäure.
Dies hat zur Folge, dass sich Teile des Prion-Proteins mit höherer oder geringerer Wahrscheinlichkeit statt in eine Alpha-Helixstruktur in eine Beta-Faltblattstruktur umwandeln können. Änderungen der Aminosäuren-Sequenz können möglicherweise die Struktur von PrP destabilisieren, so dass eine konformationelle Umwandlung begünstigt wird. Eine Konformationsänderung findet demzufolge eher oder seltener statt, abhängig davon welche Aminosäure Verwendung findet, und an welcher Position innerhalb der Sequenz diese Aminosäure in das Molekül eingebaut wird (PRUSINER 1998).
Das Prion-Protein-Gen (PrnP) des Schafes besitzt drei Exons. Das dritte Exon beinhaltet den offenen Leserahmen (ORF), der für das Prion-Protein, bestehend aus 256 AS, kodiert.
Wichtig für das Vorliegen einer Scrapie-Empfänglichkeit oder Scrapie-Resistenz sind vor allem die Polymorphismen an den Positionen 136, 154 und 171 des PrnP (HUNTER et al.
1994; WESTAWAY et al. 1994). Zahlreiche Studien haben die Bedeutung dieser drei Aminosäurepositionen im zellulären Prion-Protein bestätigt.
Die unterschiedlichen Genotypen ergeben sich daraus, für welche AS an entsprechender Stelle kodiert wird. So bedeutet der Genotyp VRQ/ARQ, dass auf dem ersten Allel an Position 136 für Valin (V), an Position 154 für Arginin (R) und an Position 171 für Glutamin (Q) kodiert wird. Für das zweite Allel bedeutet das, Alanin (A) an Position 136, Arginin (R) an Position 154 und Glutamin (Q) an Position 171. In Zusammenhang mit der Empfänglichkeit sind hauptsächlich fünf Allele von Bedeutung: ARQ, ARH (H= Histidin), ARR, AHQ und VRQ. Schafe mit dem Genotyp ARR/ARR weisen die größte Scrapie- Resistenz auf, im Gegensatz dazu entspricht der Genotyp VRQ/VRQ einer hohen Scrapie- Anfälligkeit (BELT et al. 1995; O´Doherty et al. 2002). Es ist bislang unklar, ob Tiere des Genotyps ARR/ARR persistent infiziert werden können, ohne klinisch zu erkranken.
Nach dem Vorhandensein des gewünschten Allels ARR und dem Nichtvorhandensein des ungünstigen Allels VRQ erfolgt heute eine Einteilung in die Genotypklassen 1 bis 5, worüber eine Klassifizierung der Scrapie-Empfänglichkeit vorgenommen wird. Aber auch eine solche
Klassifizierung bietet keine absolute Sicherheit. So sind einzelne Fälle bekannt, bei denen trotz Vorliegen des grundsätzlich am günstigsten eingestuften Genotyps ARR/ARR, positive TSE-Befunde nachgewiesen wurden (IKEDA et al. 1995; BUSCHMANN et al. 2004).
Eine mögliche Rassedisposition gegenüber Scrapie ist sehr wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass die Genotypenverteilung innerhalb einer Rasse züchterischen Einflüssen unterliegt. Anlass zu weiteren Untersuchungen geben Hinweise, dass das beschriebene Empfänglichkeitsschema nicht unbedingt für alle Scrapie-Stämme gleich ist. So gibt es Schafherden, in denen Tiere mit einem resistenteren Genotyp (AHQ/AHQ) an Scrapie erkrankten, während hochempfängliche Schafe (VRQ/ARQ) in einem Alter von fünf und sechs Jahren nicht an Scrapie erkrankt waren (TRANULIS et al. 1999). Es erkranken auch nicht zwangsläufig alle Tiere mit einem VRQ-Allel in einer kontaminierten Umgebung, jedoch nimmt die Wahrscheinlichkeit zu (JEFFREY et al. 2002). Weiterhin gibt es Hinweise, dass unter bestimmten Bedingungen, das ARQ-Allel ebenfalls mit einer verstärkten Empfänglichkeit behaftet ist, sofern VRQ nur selten vorkommt (ELSEN et al. 1999).
Der Einteilung in die Genotypklassen ist vor einigen Jahren noch eine Einteilung in fünf Risikoklassen (R1-R5) vorausgegangen (DAWSON et al. 1998). Bei dieser älteren Einteilung wurde z.B. der Genotyp ARQ/ARQ der Risikoklasse R4 und somit einem hohen Scrapie- Risiko zugeteilt, während er nach neuerer Einteilung in die Kategorie G3 fällt. Bei der früheren Einteilung in fünf Risikoklassen wurde die Genotypverteilung innerhalb der einzelnen Rassen mehr berücksichtig als bei der aktuellen Einteilung in die Genotypklassen.
Tabelle 1: Beziehung zwischen PrP-Gen-Varianten und dem Erkrankungsrisiko bei Exposition (DEFRA 2003)
Genotypisierungsergebnis Genotyp- Klassen
Grad der Empfänglichkeit
ARR/ARR G 1 Schafen weisen die höchste genetische Resistenz auf ARR/AHQ
ARR/ARH ARR/ARQ
G 2 Schafe sind genetisch resistent, sollten aber nur nach sorgfältiger Abwägung für die weitere Zucht genutzt werden.
AHQ/AHQ ARQ/ARH AHQ/ARQ ARH/ARH ARH/ARQ ARQ/ARQ
G3 Schafe mit geringer genetischer Resistenz.
Die Tiere sollten nicht zur Zucht eingesetzt werden.
ARR/VRQ G 4 Schafe sind genetisch Scrapie-anfällig. Kein Einsatz in der Zucht. Tiere sollten umgehend geschlachtet
werden.
AHQ/VRQ ARH/VRQ ARQ/VRQ VRQ/VRQ
G 5 Schafe mit der höchsten Empfänglichkeitsstufe. Kein Einsatz in der Zucht. Tiere sollten umgehend
geschlachtet werden.
2.4.2 Klinik
Die Inkubationszeit und der klinische Verlauf von Scrapie unterliegen Variationen, je nach Erregerstamm und nach genetisch bedingter Resistenzlage der betroffenen Schafe.
Die Inkubationszeit steht im Zusammenhang mit dem, früher von DICKINSON u. OUTRAM (1988) als scrapie incubation gen (Sinc-Gen) oder scrapie incubation period gen (Sip-Gen) bezeichneten Gen, welches mit dem PrP-Gen identisch ist (DICKINSON u. OUTRAM 1988;
MOORE et al. 1998). In befallenen Herden erkranken Tiere meist in einem Alter von etwa dreieinhalb Jahren (WINELAND et al. 1998). Nach entsprechend langer asymptomatischer Phase zeigen sich zu Beginn der Krankheit Verhaltensänderungen, Bewegungsstörungen und Sensibilitätsstörungen in unterschiedlicher Ausprägung. Zu den Verhaltensänderungen zählen vermehrte Schreckhaftigkeit, Übererregbarkeit und häufiges Zittern. Ataxien vor allem der Hinterhand und im fortgeschrittenen Stadium eine parademarschartige Bewegung der Vordergliedmaßen, die zu der deutschen Bezeichnung „Traberkrankheit“ führte, werden als häufige Bewegungsstörungen beschrieben. Die Sensibilitätsstörungen äußern sich in einem unnatürlichen Juckreiz, der zum Benagen und Scheuern der entsprechenden Körperregionen verleitet und damit Vliesschäden und oberflächliche Hauterosionen verursacht. Oft ist ein Beknabbern der Beine zu beobachten. Während des Scheuerns kann eine typische knabbernde Bewegung der Lippen und der Zunge beobachtet werden, was als Gnubbern oder positiver Nibbling-Reflex bezeichnet wird. Dieser Reflex kann auch manuell durch Kratzen der Rückenregion ausgelöst werden. Im weiteren Verlauf kommt es zu Abmagerung, Schwäche, Festliegen und Exitus (KÜMPER 1994; CAPUCCHIO et al. 2001; SMIT 2001).
Es ist kaum möglich, den genauen Zeitraum zu bestimmen, in dem klinische Symptome erkennbar sind, da Tierbesitzern und Pflegern meist die nötige Erfahrung fehlt, um die ersten Anzeichen der Erkrankung richtig zu deuten. So werden die Tiere erst auffällig, wenn sie sich bereits in unterschiedlich fortgeschrittenen Stadien der Erkrankung befinden (PARRY 1983;
HEALY et al. 2003).
Anhand von konsequent durchgeführten neurologischen Untersuchungen erkrankter, irischer Kreuzungsschafe, konnten HEALY et al. (2003) mit abnehmender Häufigkeit Hinterhandataxie (71%), Tremor des Kopfes (61%), Verhaltensänderung (57%), Gnubbern
(51%), gedrungenere Körperhaltung (51%), Zähneknirschen (44%), gesenkte Kopfhaltung (38%), Body Condition Score (BCS) unter 1,5 (38%) und verminderte Oberflächensensibilität der Hintergliedmaßen (36%) beobachten.
Das Auftreten von Scrapie innerhalb einer Population wird bekanntlich durch Polymorphismen im ovinen PrP-Gen (Genotyp) beeinflusst. In wie weit diese Polymorphismen einen Einfluss auf die Ausprägung der klinischen Symptome haben, ist bislang nicht genau bekannt (BELT et al. 1995; TRANULIS et al. 1999). Es besteht die Möglichkeit, dass der Genotyp Einfluss auf die Geschwindigkeit hat, mit der sich PrPSc im Nervengewebe anreichert, und dass der Erregertyp (Scrapie-Stamm) die Verteilung dieser Ablagerungen und damit auch die Schädigung funktionalen Gewebes beeinflusst. Die Schädigung kann die Ausprägung klinischer Symptome beeinflussen (GONZALEZ et al.
2002). Hinweise über einen möglichen Zusammenhang zwischen Genotyp und Symptomatik ergeben sich ebenfalls daraus, dass eine offensichtliche Assoziation zwischen positivem Nibbling-Reflex und den Genotypen ARQ/ARH und ARQ/ARQ besteht (HEALY et al.
2003).
Des weiteren kann eine negative Korrelation zwischen Juckreiz und Ataxie festgestellt werden, so dass Scrapie als Differentialdiagnose auch dann in Betracht gezogen werden sollte, wenn nur eins dieser beiden Symptome auftritt. Ein positiver Zusammenhang zwischen Juckreiz, Zähneknirschen und positivem Nibbling-Reflex ist ebenfalls bei den untersuchten irischen Schafen nachweisbar.
2.4.3 Pathologie und Pathogenese
2.4.3.1 Pathogenese
Schafe infizieren sich unter natürlichen Bedingungen zum größten Teil durch orale Aufnahme des Erregers. Dabei ist die Empfänglichkeit abhängig vom Genotyp des Schafes und vom Scrapie-Stamm. Das enterische Nervensystem dient dem Erreger als Eintrittspforte ins Nervengewebe (VAN KEULEN et al. 1999). So kann bei genetisch hochempfänglichen Schafen (Genotypklasse G5), nach einer Infektion auf natürlichem Weg bereits im Alter von
fünf Monaten PrPSc im enterischen Nervengewebe des Duodenums und des Ileums immunhistochemisch nachgewiesen werden (VAN KEULEN et al. 2000; MCBRIDE et al.
2001).
Bei Schafen hat neben dem neuronalen Weg auch der Weg über das lymphatische System Bedeutung für die Erregerausbreitung. MCBRIDE et al. beschrieb 1992 erstmals den immunhistochemischen Nachweis von physiologischen Prion-Protein in nicht nervalem Gewebe von Mäusen. Physiologisches Prion-Protein fand sich auf follikulär dendritischen Zellen (FDC) der lymphatischen Follikel in der Milz, den Lymphknoten und den Peyer´schen Platten. Für die Ausbreitung des Erregers von der Peripherie wird PrPc exprimierendes Gewebe benötigt (BLATTLER et al. 1997).
Bei natürlich mit Scrapie infizierten, hochempfänglichen Schafen der Genotypklasse G5, kann PrPSc in Lymphfollikeln der Milz, der Tonsillen, der retropharyngealen Lymphknoten und in den mesenterialen Lymphknoten nachgewiesen werden. Hierbei ist die Anhäufung von PrPSc in den Tonsillen prozentual am höchsten (VAN KEULEN et al. 1996). Für die Überwindung der Schleimhautbarriere innerhalb des Magen-Darm-Traktes sind spezialisierte Epithelzellen, sogenannte M-Zellen, von entscheidender Bedeutung (PRESS et al. 2004).
Die Pathogenese der Scrapie bei hochempfänglichen Tieren (VRQ/VRQ) wird von VAN KEULEN (2002) in drei Phasen gegliedert. Dabei beschreibt er als Phase 1 das Vorkommen von PrPSc im GALT (gut-associated lymphoid tissue). Hierzu zählen Tonsillen, Peyer´sche Platten des kaudalen Jejunums und Ileums und die dazugehörenden drainierenden Lymphknoten wie die Lymphonodi retropharyngeales, Lnn. jejunales und Lnn. ileocaecales.
Phase 2 entspricht der Ausbreitung des Erregers vom GALT in lymphatisches Gewebe das nicht mit dem Magen-Darm-Trakt assoziiert ist. Ob bei dieser Verbreitung FDC und Makrophagen eine bedeutende Rolle spielen, ist nicht abschließend geklärt. Als Phase 3 wird die Neuroinvasion beschrieben, die ihren Anfang im enterischen Nervensystem nimmt, das in unmittelbarer Nachbarschaft zum GALT steht. Von hier aus breitet sich der Erregers über sympathische und parasympathische, efferente Fasern des autonomen Nervensystems (Nervus vagus) retrograd weiter aus. Der Weg verläuft über das dorsale Motorneuron des Nervus vagus bis ins Rückenmark. Über entsprechende Fasern des Nervus splanchnicus gelangt der Erreger in die graue Substanz des thorakalen Rückenmarks. Es folgt die Invasion in die
Medulla oblongata und ins Gehirn. Von hieraus findet eine weitere, zentrifugale Ausbreitung über afferente Nervenfasern statt, so dass der Erreger auch nach Invasion ins zentrale Nervensystem in sensorischen Ganglien zu finden ist.
2.4.3.1.1 Rolle des Genotyps
Zahlreiche Studien geben Anlass zur Vermutung, dass die Pathogenese innerhalb der unterschiedlichen Genotypen in unterschiedlicher Weise verläuft. So konnte bislang die lymphatische Ausbreitung nur bei Schafen mit der höchsten Empfänglichkeitsstufe G5 nachgewiesen werden. Hier hat der Genotyp einen wesentlichen Einfluss auf die schnelle Erregerausbreitung über lymphatische Bahnen. Es wird angenommen, dass eine Erregerausbreitung über lymphatisches Gewebe bei Schafen des Genotyps VRQ/ARR nicht erfolgt (VAN KEULEN et al. 1996; ANDREOLETTI et al. 2000; HEGGEBO et al. 2003;
VAN KEULEN et al. 2000). Allerdings wird auch von zwei VRQ/ARQ Tieren berichtet, bei denen keine lymphatische Phase zu beobachten war (JEFFREY et al. 2002). Bei den von BENESTAD (2003) beschriebenen, am Scrapie-Stamm Nor98 erkrankten Schafen, die alle mindestens ein AHQ-Allel trugen, konnte ebenfalls kein PrPSc im lymphatischen Gewebe nachgewiesen werden. Des weiteren fand sich, bei den zwei in Deutschland identifizierten Scrapie-positiven ARR/ARR Schafen, kein Hinweis einer PrPSc-Akkumulation in lymphatischen Geweben (BUSCHMANN et al. 2004b). Hieraus kann geschlossen werden, dass bei Tieren, die ein ARR- oder AHQ-Allel tragen, das lymphatische System keine entscheidende Rolle in der Pathogenese dieser Tiere spielt. Bislang ist nur ein Fall beschrieben, bei dem PrPSc in den Peyer´schen Platten eines VRQ/ARR Tieres nachweisbar war (ERSDAL et al. 2003).
2.4.3.1.2 Weitere Einflüsse auf die Pathogenese
Die Beteiligung des lymphatischen Systems an der Pathogenese scheint darüber hinaus vom jeweiligen Erreger-Stamm abhängig zu sein, da bei BSE das lymphatische Gewebe offenbar nicht involviert ist (SOMERVILLE et al. 1997). Hinweise auf eine Stammabhängigkeit geben auch die Beschreibung der Nor98 Fälle sowie in Deutschland und Frankreich identifizierte atypische Scrapie-Formen (BUSCHMANN et al. 2004a, b).
Eine umfassende Darstellung der immunbiologischen Prozesse im Rahmen einer TSE- Erkrankung findet sich bei MABBOTT und BRUCE (2001). Follikulär dendritische Zellen spielen nachweislich eine große Rolle bei der Scrapie-Replikation, da ihr Fehlen bei transgenen Mäusen die Ablagerung von PrPSc im lymphatischen Gewebe und die folgende neuronale Ausbreitung stark beeinflusst. Diesbezüglich eine indirekte Bedeutung haben B- Lymphozyten, da sie für die Reifung und Ausdifferenzierung von FDC essentiell sind. Der Einfluss von Makrophagen scheint eher unbedeutend.
Bezüglich einer Erregerverbreitung über die Blutbahn lassen sich in der Literatur nur wenige aussagekräftige Hinweise finden. Bei natürlich infizierten Ziegen und Schafen ist ein Nachweis von TSE-Erregern im Blut nicht gelungen (HADLOW et al. 1980, 1982). Neuere Studien hierzu demonstrieren eine Scrapie-Übertragbarkeit mittels Bluttransfusion, und bestätigen so eine vorhandene Infektiösität im Blut (HUNTER et al. 2002). Es ist aber nicht bewiesen, dass eine Ausbreitung der Infektion von der Peripherie zum zentralen Nervensystem (ZNS) auf hämatogenem Wege stattfindet.
Letztlich wird deutlich, dass die Pathogenese der Scrapie noch längst nicht vollständig geklärt ist. Es bleibt auch fraglich, ob ein negativer Nachweis in bestimmten Geweben oder Körperflüssigkeiten nicht darauf zurückzuführen ist, dass die angewandten Untersuchungsmethoden nicht sensitiv genug sind, oder dass neben dem oralen Infektionsweg unter natürlichen Bedingungen auch noch andere Infektionswege in Frage kommen, die bestimmte Gewebeabschnitte im Rahmen der Pathogenese umgehen.
2.4.3.2 Histopathologie
Die histopathologischen Veränderungen beschränken sich auf das ZNS und hier vorwiegend auf die graue Substanz (FRASER 1976). Mikroskopisch fallen in der grauen Substanz des Stammhirns Zeichen einer neuronalen Degeneration in Form von Vakuolisierung auf. Die Vakuolen finden sich perineural, intraneural oder in der Nähe von Nervenzellen. Je nach Inkubations- bzw. Krankheitsstadium reichen die Läsionen in Thalamus, Medulla, Pons und Zwischenhirn von nur wenigen Vakuolen bis zu massiver Vakuolisierung. Man spricht dann vom Status spongiosus. Perineurale Vakuolation kann allerdings bei Schafen nicht als
Scrapie-typisches Merkmal angesehen werden, da es in geringerer Ausprägung auch bei gesunden Schafen auftreten kann. Weiterhin ist von Fällen berichtet worden, bei denen nach Infektion mit einem bestimmten Erregerstamm neuronale Vakuolenbildung lichtmikroskopisch nur sehr spärlich nachweisbar war. Das histologische Läsionsprofil wird bei Schafen nicht nur von dem Erregerstamm, sondern auch vom Genotyp des Prion-Protein- Gens und von weiteren, bislang undefinierten, individuellen Faktoren beeinflusst (BEGARA- MCGORUM et al. 2002, GONZALEZ et al. 2002; LIGIOS et al. 2002; JEFFREY u.
GONZALEZ 2004). Im Gegensatz zu Mäusen, ist daher bei befallenen Schafen eine Stamm- Typisierung ausschließlich anhand des Läsionsprofiles nicht möglich. Die Stammtypisierung anhand des Läsionsprofils im zentralen Nervensystem von Mäusen gilt als Goldstandard.
Neben der Vakuolenbildung sind häufig andere Formen der neuronalen Degeneration zu finden. Diese äußern sich in einzelnen dunklen, verdichteten Neuronen (HADLOW et al.
1982) und Nervenzellverlust, Astrozytose und Amyloidose. Im Experiment konnte anhand von Mäusen, die mit mausadaptierten Scrapie-Stämmen infiziert wurden, nachgewiesen werden, dass der neuronalen Degeneration eine Mikrogliaaktivierung vorausgeht (GIESE et al. 1998). Der Grad der histologischen Veränderungen im ZNS ist individuell variabel und lässt sich nicht unbedingt mit der klinischen Symptomatik in Einklang bringen (JEFFREY u.
GONZALEZ 2004).
2.4.4 Übertragbarkeit
Es sind verschiedene Übertragungswege für Scrapie bekannt. Ein permantentes Einschleppungsrisiko für Herden stellt der Handel mit lebenden Schafen und Ziegen aus endemischen Scrapie-Gebieten dar (PARRY 1983). Der Erreger wird sowohl vertikal als auch horizontal übertragen. Dabei spielt aus epidemiologischer Sicht wohl die maternale Übertragung auf die Lämmer, die sowohl prä-, peri-, als auch postnatal erfolgen kann, die größte Rolle. Die hohe Widerstandfähigkeit des Erregers lässt die indirekte Übertragung genauso bedeutend erscheinen wie die direkte Übertragung. Bereits in den 70er Jahren konnten damals durchgeführten Untersuchungen maternale als auch laterale Übertragbarkeit demonstrieren (DICKINSON 1976, DICKINSON et al. 1974). Gegenstand der
Untersuchungen waren Suffolk Schafe, die aus einer Herde mit hoher Scrapie-Inzidenz stammten und Scottish-Blackface Schafe, die aus einer Scrapie-freien Herde stammten. Beim gegenseitigen Austausch von Schafen aus beiden Gruppen, kam es zu Scrapie-infizierten Nachkommen in beiden Gruppen und es erkrankten Tiere aus der bis dahin Scrapie-freien Gruppe der Scottish-Blackface Schafe.
Scrapie-Übertragungsstudien, bei denen mittels Embryotransfer Nachkommen infizierter Muttertiere auf Scrapie-freie Ammenmütter übertragen wurden, geben Hinweise auf eine intrauterine Übertragung (FOSTER et al. 1992, 1996). Die ebenfalls bedeutende perinatale Übertragung kann durch den intensiven Kontakt mit infektiösem Fruchtwasser und Nachgeburtsteilen erfolgen (DETWILER 1992). Die Ausscheidung infektiöser Nachgeburten und Fruchtwässer und die damit einhergehende Kontamination der Umwelt sind wesentliche Faktoren der horizontalen Übertragung. Der Erregernachweis im Kot kann in direktem Zusammenhang mit der Aufnahme von infektiösen Nachgeburtsteilen stehen. Scrapie- kontaminierte Weiden, Stallböden und Pferche können jahrelang eine Infektionsquelle darstellen. Es konnte dargestellt werden, dass die Infektiösität im Erdboden unter günstigen Bedingungen auch noch nach drei Jahren nachweisbar ist (BROWN u. GAJDUSEK 1991).
Die Rolle der Heumilbe als belebter Übertragungsvektor für den Erreger wird diskutiert (WISNIEWSKI et al. 1996).
Experimentell konnte im Mausversuch weiterhin eine konjunktiviale Erregeraufnahme nachgewiesen werden. Daneben gelang eine Erregeraufnahme auch über Läsionen der Maulschleimhaut und der Zahnpulpa, mit wahrscheinlicher Erregerausbreitung über Fasern des Nervus trigeminus zum ZNS, unter Umgehung des Magen-Darm-Traktes (SCOTT et al.
1993; INGROSSO et al. 1999).
Es sind zwei Fälle bekannt, bei denen eine iatrogene Übertragung durch die Anwendung eines kontaminierten Impfstoffes stattfand. In beiden Fällen wurde zur Impfstoffherstellung kontaminiertes Hirnmaterial von Schafen verarbeitet (ROBINSON 1996; CARAMELLI et al.
2001; ZANUSSO et al. 2003). Die Impfstoffe gegen Louping Ill in Schottland (1935) und gegen Mycoplasma agalactiae in Italien (1994-1997) führten zu einer erheblichen Erhöhung der Scrapie-Inzidenz in den betroffenen Regionen. Das Scrapie-Risiko war auch noch in den
Jahren 2002-2003 in gegen M. agalactiae geimpften italienischen Herden bis zu 40 mal höher als in ungeimpften (RU et al. 2004).
2.4.5 Atypische Scrapiefälle
Neben den hier vorab beschriebenen „klassischen Scrapie-Fällen“ wird seit der Einführung einer EU weiten, intensivierten Scrapie-Überwachung aus einigen Ländern auch von Entdeckungen sogenannter „atypischer Scrapie-Fälle“ berichtet (BENESTAD et al. 2003;
BUSCHMANN et al 2004a, b; ORGE et al. 2004). Diese Fälle unterscheiden sich von der klassischen Form durch unterschiedliche biochemische Eigenschaften sowie in der Erregerverteilung im Gehirn. Daher werden sie nicht von allen BSE-Schnelltestes eindeutig erkannt (BUSCHMANN et al. 2004a).
Bereits im Jahr 1998 wurde erstmals in Norwegen bei Schafen ein neuer Scrapie-Stamm diagnostiziert, der heute als Nor98 bezeichnet wird. An diesem Stamm erkrankte Tiere werden erst in einem außergewöhnlich hohen Durchschnittsalter von 6,5 Jahren klinisch auffällig mit den Hauptsymptomen Ataxie, Schreckhaftigkeit und Abmagerung. Typische klinische Symptome wie Juckreiz und Wollverlust konnten bislang nicht beobachtet werden.
Histopathologisch fehlt die typische Vakuolenbildung im Hirnstam. Dagegen sind Kleinhirnläsionen und Veränderungen in der Großhirnrinde deutlich ausgeprägt. Eine Akkumulation von PrPSc in lymphatischen Geweben konnte bislang nicht nachgewiesen werden (BENESTAD et al. 2003). Inzwischen gibt es Hinweise, dass für diese Scrapie-Form auch noch ein weiterer Polymorphismus an Position 141 des Prion-Protein-Gens bedeutsam ist (MOUM et al. 2004). Eine feste Verbindung der atypischen Scrapie-Formen zu bestimmten Genotypen wird nicht beschrieben, allerdings scheinen die Allele ARR und AHQ auffällig häufig vorzukommen. Der Erreger dieser Fälle zeichnet sich durch eine deutlich höhere Sensitivität gegenüber Proteinase K aus, und neben dem Stamm Nor98 wird eine weitere Form beschrieben, die durch ein anderes Molekulargewicht auffällt (BUSCHMANN et al. 2004a, b). Damit scheint es neben der klassischen Scrapie-Form mindestens zwei weitere unterschiedliche Scrapie-Phänotypen zu geben. Innerhalb des Zeitraums 2002-2004 konnten in Deutschland etwa 38% der Scrapie-positiven Fälle als atypisch diagnostiziert
werden. Im Gegensatz zu den klassischen Scrapie-Fällen war in den betroffenen Herden meist nur ein einzelnes Tier positiv (GRETZSCHEL et al. 2005).
In Bezug auf klinische Symptome wird im Zusammenhang mit „atypischen Scrapie-Fällen“
wiederholt vom Auftreten von Ataxien berichtet 1.
2.5 Diagnostik
Die Klinik der Traberkrankheit umfasst ein breites, relativ unspezifisches und von individuellen Aspekten geprägtes Spektrum an Symptomen. Klinisch kann daher nur eine Verdachtsdiagnose gestellt werden, in Bezug auf die lange Inkubationszeit ist das diagnostische Fenster sehr klein. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit eines zuverlässigen Testsystems für derartige Verdachtsfälle.
Die zur Zeit angewandten Tests zur Bestätigung einer Prion-Erkrankung nutzen Gehirn- Material und sind nur post mortem anwendbar. Histopathologische Veränderungen, die sich zum Teil in typischen Läsionsprofilen darstellen, können eine Diagnosestellung ermöglichen, die aber nicht immer eindeutig ist (FRASER 1976). Wesentlich sensitiver sind immunhistochemische Verfahren. Mit diesen Verfahren wird das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein eines spezifischen Fragments von PrPSc (PrP 27-30) nach Proteinase K- Verdau überprüft. PrPSc ist bis heute, der einzige bekannte Marker für das Agens, das Prionerkrankungen auslöst.
Mittels Immunhistochemie und Immunoblot kann PrPSc bei Schafen mit empfänglichem Genotyp auch schon im präklinischen Stadium in Bioptaten aus lymphatischem Gewebe nachgewiesen werden (VAN KEULEN et al. 2000; ANDREOLETTI et al. 2000). Zum Nachweis von PrPSc im Hirngewebe eignen sich ebenfalls Enzym-gekoppelte-Immunoassays, sogenannte ELISA-Systeme. Eine weitere Methode ist der Infektionsversuch im Maus- Lebendtest (Maus-Bioassay). Hier können nach mehreren Mauspassagen auch unterschiedliche Scrapie-Stämme typisiert werden.
2.5.1 Immunhistochemie (IHC)
Im Rahmen der TSE-Diagnostik eignet sich die IHC für den Nachweis von PrPSc zur postmortalen Scrapie-Diagnose (MCKINLEY et al. 1991; MILLER et al. 1993; VAN KEULEN et al. 1995, 1996). Das PrPSc wird bei dieser Methode als zelluläres Antigen mit Hilfe eines speziellen Antikörpers in Form einer Antigen-Antikörper-Bindung nachgewiesen.
Eine Vielzahl monoklonaler und polyklonaler Antikörper ist mittlerweile entwickelt worden, die jeweils ein spezifisches Epitop des PrPSc binden (O´ROURKE et al. 1998; GARSSEN et al. 2000; HARDT et al. 2000). Gewebeproben werden routinemässig in Paraffin eingebettet, und Gewebeschnitte von 3-5 µm Dicke angefertigt. Vorbehandlungen mit Ameisensäure und Proteinase K, erhitzen in der Mikrowelle oder kochen im Dampfdrucktopf verbessern die Antigen-Antikörperreaktion, indem PrPc denaturiert wird und gleichzeitig die Immunreaktivität von PrPSc erhöht wird (MILLER et al. 1993). Diese zum Teil sehr aggressiven Vorbehandlungsmaßnahmen erfordern eine extrem gute Haftung der Gewebeschnitte auf dem Objektträger. Eine Beschichtung der Objektträger mit Aminopropyltriethoxysilane (APES) ist eine Möglichkeit die Haftung zu verbessern. Bei der indirekten Immunreaktion wird dem Gewebeschnitt zunächst ein primärer Antikörper zugefügt, der am entsprechenden Epitop des Antigens (PrPSc) bindet. In einem zweiten Schritt bindet ein spezifischer Antikörper, der mit einem Enzym konjugiert ist, den ersten Antikörper. Für die Sichtbarmachung des Antigen-Antikörperkomplexes stehen unterschiedliche immunologische Detektionssysteme zu Verfügung. Ein Beispiel ist das Biotin-Streptavidin-Detektionssystem von Vectastain (ABC Kit). Bei diesem Verfahren reagiert ein biotinylierter sekundärer Antikörper mit dem primären unmarkierten Antikörper.
Es folgt ein vorgeformter Makromolekularkomplex aus Avidin- und biotinylierter Meerrettichperoxidase. In einem weiteren Schritt reagiert 3,3´Diamino-Benzidin- Tetrahydrochlorid-Dihydrat mit diesem Makromolekularkomplex, was zu einem unlöslichen, dunkelbraunen Reaktionsendprodukt führt (BOURNE 1983; HARDT et al. 2000).
Bedingungen für eine ideale immunhistochemische Färbung sollen starke PrPSc-Färbung, keine PrPc –Färbung, keine unspezifische Hintergrundfärbung und die Integritätserhaltung des
1 Laut persönlicher Mitteilung von BOTTERON, SRTSE-Meeting, Bern, 30. September bis 02. Oktober 2004
zu untersuchenden Gewebes sein, auch bei Anwendung unterschiedlicher Antikörper.
Wesentlich für jede immunhistochemische Färbung ist das Mitführen von Positiv- und Negativkontrollen (BOURNE 1983).
2.5.2 Immunoblot
Zu den Immunoblots zählen unter anderem der Western blot (WB) und der PET blot. Dabei ist der letztgenannte nicht offiziell als diagnostischer Test anerkannt. Er gilt aber sensitiv und besonders geeignet, die Verteilung von PrPSc zu beurteilen.
2.5.2.1 Western blot
Bei dieser Methode wird eine zu untersuchende Gewebeprobe (Stammhirn) homogenisiert und einem PK-Verdau unterzogen. Die verbliebenen Proteinbruchstücke werden auf einem Polyacrylamidgel mittels Elektrophorese entsprechend dem Molekulargewicht aufgetrennt und anschließend auf eine Polyvinylmembran übertragen. Der immunologische Nachweis von PrPSc erfolgt ähnlich dem Protokoll für die IHC durch Inkubation dieser Membran mit spezifischen Antikörpern, an die ein Markerenzym gekoppelt ist. Die Visualisierung der entstandenen Antigen-Antikörper-Komplexe erfolgt mittels Farbstoffen oder Chemilumineszenz (BURNETTE 1981). In der TSE-Diagnostik kann PK-resistentes Prion- Protein mittels Western blot im Hirngewebe von infizierten Schafen, Rindern, Mäusen, Hamstern und Menschen nachgewiesen werden (DOI et al. 1988; KATZ et al. 1992). Mit dem Western blot kann eine Vielzahl von Proben innerhalb kurzer Zeit untersucht werden, weshalb er sich als Schnelltest besonders eignet (COOLEY et al. 2001).
2.5.2.2 PET blot
Der parafin-embedded tissue blot (PET blot) ist eine sensitive Methode zum Nachweis von PrPSc in Formalin-fixiertem und Paraffin-eingebettetem Geweben. Dies gilt sowohl für
sporadische als auch erworbene Formen von Prionerkrankungen. Diese Methode ist sensitiver als IHC. Sogar in Fällen, bei denen ein PrPSc-Nachweis mittels IHC nicht möglich war, gelang ein positiver Nachweis im PET blot Verfahren (SCHULZ-SCHAEFFER et al. 2000).
Von in Paraffin eingebetteten Gewebeproben werden 3-5 µm dicke Gewebeschnitte angefertigt und auf eine Nitrozellulosemembran aufgebracht. Es folgt ein Proteinase K- Verdau. Der Nachweis von an Nitrozellulose gebundenem PrPSc erfolgte mit einem monoklonalen Primärantikörper. Eine Visualisierung wird, wie bei der IHC, über den Einsatz eines sekundären Antikörpers mit anschließender Farbreaktion ermöglicht.
2.5.2.3 ELISA
ELISA-Tests (enzyme-linked immunosorbent assay) sind inzwischen weit verbreitete Verfahren, um einzelne Proteine nachweisen zu können. Wie bei den Immunoblots werden auch hier die Mechanismen des Immunsystems genutzt. Zu untersuchendes Gewebe wird homogenisiert und einem Vorverdau mit Proteinase K unterzogen. Eine Mikrotiterplatte, an die bereits ein primärerer monoklonaler, anti-PrPSc -Antikörper gekoppelt ist, wird mit der gewonnenen Proteinlösung inkubiert. Das PrPSc wird also direkt aus dem Probenmaterial
„herausgefangen“. Es folgt ein Waschprozess um übriggebliebene ungebundene Proteine zu entfernen, bevor die Platte erneut mit einem zweiten, enzym-markierten Anitkörper inkubiert wird (GRASSI et al. 2001). Nach einem weiteren Waschprozess folgt die Auswertung des Tests in der Regel photometrisch.
2.5.3 Maus-Bioassay
Eine Methode um Scrapie-Infektiosität nachzuweisen ist die Zubereitung eines Inokulates aus Gewebe von verdächtigen Tieren und die intrakraniale oder intraperitoneale Injektion dieses Inokulates in Mäuse. Die Scrapie-Diagnose wird histopathologisch oder durch PrPSc- Nachweis in Hirngewebe mittels Western blot gestellt (BRUCE et al. 1991). Entscheidende Nachteile eines Mauslebendtests sind die lange, bis zu zwei Jahre dauernde Inkubationszeit,
bevor sich die Erkrankung im Versuchstier entwickelt und die hohen Kosten. Ein großer Vorteil ist die hohe Sensitivität.
2.5.4 In Deutschland zugelassene Schnelltests
Bei einer Evaluierung durch eine wissenschaftliche Arbeitsgruppe der europäischen Union im Jahre 1999 erwiesen sich drei von fünf TSE-Tests als äußerst leistungsfähig und erhielten darauf hin die Zulassung zum Einsatz in der EU (MOYNAGH u. SCHIMMEL 1999). Bei dieser Testevaluierung fand die Überprüfung der Testsysteme allerdings nur mit BSE- Probenmaterial statt. Eine Anwendbarkeit für den Nachweis von Scrapie ist daher nicht eindeutig bestätigt. Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass die erneute Untersuchung bestätigter Scrapie-Fälle aus Deutschland und Frankreich mit vier verschiedenen Schnelltests zu unterschiedlichen Ergebnissen führte (BUSCHMANN et al. 2004a). Eine einfache Übertragung der zugelassenen Testsysteme für den Einsatz zur aktiven Scrapie-Surveillance bei kleinen Wiederkäuern ist demzufolge kritisch zu betrachten.
2.5.4.1 Prionics-Check Western
Hierbei handelt es sich um ein Western blot Kit zum postmortalen Nachweis von PrPSc in Hirnstammgewebe von Rindern und Schafen (SCHALLER et al. 1999).
2.5.4.2 Biorad Platelia ELISA
Hierbei handelt es sich um einen klassischen ELISA, bei dem die primären Antikörper an einer Platte gebunden sind. Diese Platte wird mit der Proteinase K behandelten Probe inkubiert. Ungebundene Proteinfragmente werden im Anschluss abgewaschen. Mit Hilfe eines sekundären Antikörpers an den kovalent ein Enzym gebunden ist, welches eine Farbreaktion katalysieren kann, erfolgt der Nachweis (GRASSI et al. 2001).
2.5.4.3 Enfer ELISA (Abbott)
Wie der Biorad Test arbeitet auch dieser Test mit einer klassischen ELISA Technik. Dem Sekundärantikörper ist ein Enzym angefügt, das bei der Zugabe eines bestimmten Substrats eine Chemolumineszenz ergibt.
Die zur Zeit in Europa am häufigsten angewandten Testsysteme sind der Prionics-Check Western und der Biorad Platelia ELISA, wobei in Deutschland vorwiegend der Biorad Platelia ELISA Einsatz findet.
Alle angewandten Testsysteme haben die Gemeinsamkeit, dass sie nur den Proteinase K resistenten Teil des PrPSc nachweisen. Des weiteren werden Gewebeproben im Rahmen der TSE-Überwachung aus der Obexregion des Hirnstammes untersucht. Positive Scrapie-Fälle, wie sie bei norwegischen, am Stamm Nor98 erkrankten Schafen beobachtet wurden, wären wahrscheinlich mit diesen Schnelltests nicht entdeckt worden. Bei einem Vergleich der Schnelltests Prionics-Check Western und Biorad Platelia ELISA wurde Nor 98 in 20 untersuchten Fällen mit Biorad Platelia ELISA bestätigt, während Prionics-Check Western bei 11 der Fälle ein negatives Ergebnis lieferte und die übrigen neun nur schwer zu interpretieren waren. Weiterhin konnte ein große Anzahl atypischer Scrapie-Fälle (24 in Deutschland und 29 in Frankreich) ebenfalls nur mit dem Biorad Platelia ELISA zuverlässig detektiert werden, während Prionics-Check Western, Enfer ELISA und ein weiterer Schnelltest (Prionics-Check LIA) negative Ergebnisse lieferten.
Die im Rahmen der EU-weiten Scrapie-Überwachung durchgeführten Schnelltests wären für die Detektion von atypischen Scrapie-Fällen somit nur bedingt geeignet, da außerdem histopatohologische Veränderungen und PrPSc–Akkumulationen statt im Obexbereich, eher in Klein- und Großhirnrinde zu finden sind (BENESTAD et al. 2003, BUSCHMANN et al 2004a, b).
2.5.5 Scrapie-Lebendtests
Wie bereits beschrieben, kann verändertes Prion-Protein bei infizierten Schafen der Genotypenklassen G3 und G5, in verschiedenen peripheren, lymphatischen Organen vorkommen. Basierend auf dieser Erkenntnis sind Nachweisverfahren von Scrapie am lebenden Tier entwickelt worden. So kann unter Allgemeinanästhesie Tonsillengewebe aus dem Rachenraum von Schafen entnommen werden und auf das Vorkommen von PrPSc untersucht werden. Da bei bestätigten Scrapie-positiven Fällen in 80% der Follikel PrPSc nachweisbar ist, erscheint eine Anzahl von mindestens drei auswertbaren Follikeln ausreichend, um ein Vorliegen von Scrapie auszuschließen. Eine Probe die weniger als drei Follikel enthält, ist dementsprechend bei negativer immunhistochemischer PrPSc –Färbung, zum sicheren Scrapie-Ausschluss nicht geeignet. Für eine positive Bewertung ist allerdings jede Anzahl an Follikeln ausreichend. Bei Schafen mit dem empfänglichsten, homozygoten Genotyp VRQ/VRQ (G5) konnte PrPSc schon nach der Hälfte der erwarteten Inkubationszeit und ein Jahr vor Ausbruch der ersten klinischen Symptome in Follikeln der Tonsille nachgewiesen werden (SCHREUDER et al. 1996, 1998; VAN KEULEN et al. 1996).
Eine andere Möglichkeit ist der Nachweis im lymphatischen Gewebe des dritten Augenlides (O´ROURKE et al .1998, 2000).
Biopsiematerial aus der Darmschleimhaut scheint bei homozygoten VRQ-Tieren ebenfalls ein befriedigendes Ergebnis zu liefern (GUNNES 2004). Allerdings war bei heterozygoten VRQ- Tieren nur in 20% der gewonnenen Lymphfollikel PrPSc nachweisbar.
THURING et al. (2002) verglich den Einsatz unterschiedlicher Biopsietechniken, indem sie Gewebeproben aus fünf unterschiedlichen Lokalisationen toter Tiere sammelte und die drei bewährtesten Techniken im Anschluss an fünf lebenden Schafen testete. Hierbei zeigte sich, im Hinblick auf die Anzahl auswertbarer lymphatischer Follikel, die Bioptatentnahme vom dritten Augenlid am effektivsten. Die holländische Arbeitsgruppe um SCHREUDER et al.
kam jedoch zu einem anderen Ergebnis. Klinische Nebenerscheinungen infolge der Bioptatentnahme ergaben sich nicht bei den Versuchstieren. Ein Anstieg der Plasma-Cortisol- Konzentration wurde darauf zurückgeführt, dass Zwangsmaßnahmen und Anästhesie eine
deutlich höhere Stressbelastung für die Tiere darstellten, als die eigentliche Durchführung der Biopsie.
2.6 Scrapie-Bekämpfung innerhalb der EU
2.6.1 TSE-Überwachung bei Schafen
Um ein hohes Maß an Lebensmittelsicherheit und an Schutz der öffentlichen Gesundheit zu gewährleisten, findet in jedem Mitgliedstaat der Europäischen Union die Verordnung (EG) 999/2001 Anwendung (Amtsblatt L147 vom 31.05.2001). Sie umfasst Vorschriften zur Verhütung, Kontrolle und Tilgung bestimmter transmissibler spongiformer Enzephalophatien und ist in all ihren Teilen für die Mitgliedsstaaten der EU verbindlich. Zahlreiche Änderungsverordnungen sorgen dafür, dass diese Verordnung dem aktuellen Stand der Wissenschaft stets angepasst und durch weitere europäische und nationale Bestimmungen ergänzt wird.
Jeder Mitgliedstaat ist verpflichtet, TSE-Überwachungsprogramme auf der Basis von Schnelltests bei Rind, Schaf und Ziege zu erstellen. Außerdem bestehen Verpflichtungen bezüglich der Entfernung und unschädlichen Beseitigung bestimmter Wiederkäuergewebe als spezifiziertes Risikomaterial, sowie ein Verfütterungsverbot für bestimmtes tierisches Eiweiß an bestimmte Tierkategorien.
Gemäß dem EU-Überwachungsprogramm für kleine Wiederkäuer müssen in allen Mitgliedstaaten repräsentative Stichproben von Schafen und Ziegen die über 18 Monate alt sind, oder bei denen mehr als zwei bleibende Schneidezähne das Zahnfleisch durchbrochen haben, auf TSE-Erreger untersucht werden. Dies betrifft in Deutschland derzeit jeweils 10.000 geschlachtete und verendete Schafe pro Jahr. Durch die nationale TSE- Überwachungsverordnung (BGBl. I S.3631) wurde die Anzahl der zu untersuchenden Schafe und Ziegen dahingehend erweitert, dass alle verendeten Tiere die mindestens 18 Monate alt sind, oder bei denen mindestens zwei bleibende Schneidezähne das Zahnfleisch durchbrochen haben, zu untersuchen sind. Der PrPSc-Nachweis hat mit einem, im Anhang X der Verordnung (EG) 999/2001 aufgeführten Schnelltest zu erfolgen.
