Aus dem Institut für neue und neuartige Tierseuchenerreger am Friedrich-Loeffler-Institut und dem
Institut für Virologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Verteilung von Infektiosität und krankheitsassoziiertem Prion- Protein in Geweben von mit klassischen oder atypischen TSE- Erregern infizierten Rindern und Schafen
Habilitationsschrift zur Erlangung der VENIA LEGENDI
an der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von Dr. med. vet. Anne Balkema-Buschmann
Hannover 2011
Tag der nichtöffentlichen wissenschaftlichen Aussprache: 5. Dezember 2011
INHALTSVERZEICHNIS
VERZEICHNIS DER VERWENDETEN ABKÜRZUNGEN
1. EINLEITUNG ... 1
1.1. Theorien zur Natur des TSE-Erregers ... 1
1.2. Das Prion-Protein ... 3
1.3. Zusammenhang zwischen Prionerkrankungen und anderen Proteinopathien ... 4
1.4. Inaktivierung von TSE-Erregern ... 5
1.5. Diagnostische Möglichkeiten ... 6
1.6. Transmissible Spongiforme Enzephalopathien (TSE) ... 10
1.6.1. TSE-Erkrankungen beim Tier ... 11
1.6.2. TSE-Erkrankungen beim Menschen ... 21
1.7. Pathogenese der TSE-Erkrankungen bei Mensch und Tier ... 24
2. EIGENE ARBEITEN ... 26
2.1. Grundlagen der durchgeführten Untersuchungen ... 26
2.2. Untersuchungen zur Erregerverteilung und zum PrPSc- Verteilungsmuster in BSE-infizierten Rindern mit Hilfe des Maus- Bioassays und immunologischer Methoden ... 27
2.3. Epidemiologie der klassischen BSE-Fälle in Deutschland ... 31
2.4. Charakterisierung atypischer BSE-Fälle ... 33
2.5. Charakterisierung atypischer Scrapie-Fälle ... 38
2.6. Untersuchungen zum möglichen Risiko einer TSE-Infektion über die Umwelt ... 46
3. DISKUSSION ... 48
4. SCHLUSSFOLGERUNGEN... 63
5. ZUSAMMENFASSUNG ... 64
6. SUMMARY ... 66
7. LITERATURVERZEICHNIS ... 68
8. AUFSTELLUNG DER VERÖFFENTLICHUNGEN UND ERKLÄRUNG ÜBER DEN EIGENEN ANTEIL AN ARBEITEN, AN DENEN MEHRERE AUTOREN BETEILIGT WAREN ... 92
9. AUFSTELLUNG DER FÜR DIE BESCHRIEBENEN VERSUCHE ERTEILTEN TIERVERSUCHSGENEHMIGUNGEN NACH DEM TIERSCHUTZGESETZ 97 10. ANHANG I: WEITERFÜHRENDE INFORMATION ... 99
11. ANHANG II: IN DIESER ARBEIT BESPROCHENE ORIGINALARBEITEN………..………104
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
BASE Bovine Amyloidotische Spongiforme Enzephalopathie, siehe L-Typ- BSE
BMELV Bundesministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz
BSE Bovine Spongiforme Enzephalopathie CJK Creutzfeldt-Jakob-Krankheit
CWD Chronic Wasting Disease
C-Terminus Karboxy-Terminus eines Proteins
DMNV dorsaler Motonukleus des Nervus Vagus EFSA Europäische Agentur für Lebensmittelsicherheit
ELISA Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest (EIA), Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
EU Europäische Union
FFI tödliche familiäre Schlaflosigkeit (Fatal Familial Insomnia) FLI Friedrich-Loeffler-Institut
FSE Feline Spongiforme Enzephalopathie
GABA γ-Aminobuttersäure (Gamma-Aminobutyric Acid);
inhibitorischer Neurotransmitter im zentralen Nervensystem
Genotyp Alle in der DNA codierten genetischen Informationen eines Organismus, jedoch häufig verwendet zur Beschreibung nur eines oder weniger Merkmale. Im Zusammenhang mit den Scrapie- Resistenz-Zuchtprogrammen bezieht sich dieser Begriff auf die die TSE-Empfänglichkeit beeinflussenden Mutationen an den Positionen 136, 154 und 171 des Prion-Proteins
Glykoprofil Mengenverhältnis der drei Glykosylierungsformen des Prion-Proteins GSS Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom
GPI-Anker Glykophospho-Inositol-Anker, über den PrPC mit der Zellmembran verbunden ist
H-Typ-BSE atypische BSE-Form, die nach Proteinase K-Verdau mit einer ca. 0,5 kDa höheren Molekularmasse der unglykosylierten Form des pathologischen PrP im Vergleich zur klassischen BSE-Form einhergeht
IHC Immunhistochemie
IRMM Institut für Referenzmaterialien und -methoden, Geel, Belgien kDa Kilodalton, Maßeinheit für die Molekularmasse von Proteinen
LD50/g Maß für den Erregergehalt in einem Gramm Gewebe, berechnet nach der von Spearmann (1908) und Kaerber (1931) entwickelten Formel.
Sie gibt die Dosis an, die bei der Hälfte der infizierten Tiere zum Tod führt (letale Dosis50).
L-Typ BSE atypische BSE-Form, die nach Proteinase K-Verdau mit einer ca. 0,5 kDa niedrigeren Molekularmasse der unglykosylierten Form des pathologischen PrP im Vergleich zur klassischen BSE-Form einhergeht (syn. BASE)
LRS lymphoretikuläres System
M. Musculus
mAk / mab monoklonaler Antikörper / monoclonal antibody
N. Nervus
N-Terminus Amino-Terminus eines Proteins
Nor98 atypische Scrapieform, die im Jahre 2003 erstmals bei einem 1998 in Norwegen aufgetretenen Fall beschrieben wurde
OIE Weltorganisation für Tiergesundheit (Office Internationale des Epizooties / World Organisation of Animal Health)
PMCA zyklische Vermehrung fehlgefalteter Proteine (Protein Misfolding Cyclic Amplification)
PrP Prion-Protein
PrPC zelluläre Form des PrP (physiologisch)
PrPSc pathologische, krankheitsassoziierte Form des PrP SAF Scrapie-assoziierte Fibrillen
SEAC Spongiform Encephalopathy Advisory Committee; beratend für das britische Landwirtschaftsministerium, das britische Gesundheitsministerium und die Food Standards Agency (FSA) sCJK spontan auftretende Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, d.h. ohne
erkennbare äußere oder innere Ursache
SRM spezifizierte Risikomaterialien, die gemäß Verordnung EU 999/2001 (in der geltenden Fassung) markiert und unschädlich beseitigt werden müssen
STEG TSE Community Reference Laboratory Strain Typing Expert Group
Expertengruppe, die im Auftrag der Europäischen Kommission Ergebnisse zur Stammdifferenzierung außergewöhnlicher TSE-Fälle begutachtet
Tga 20 transgene Mauslinie, die das murine PrPC überexprimiert Tgbov XV transgene Mauslinie, die das bovine PrPC überexprimiert Tgshp XI transgene Mauslinie, die das ovine PrPC überexprimiert TME Transmissible Enzephalopathie der Nerze
TSE Transmissible Spongiforme Enzephalopathie vCJK Variante der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit VK Vereinigtes Königreich
VLA Veterinary Laboratories Agency, Weybridge, VK
1 1. Einleitung
Die EU-weite Einführung der aktiven Überwachungsprogramme für transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE) bei Rindern 2001 und bei kleinen Wiederkäuern 2002 hat zu einem deutlichen Anstieg der gemeldeten TSE-Fälle geführt. Diesem Anstieg der Fallzahlen in der gesamten Europäischen Union folgten intensive Diskussionen auf wissenschaftlicher und politischer Ebene über das Infektionsrisiko für den Verbraucher sowie über notwendige Bekämpfungsstrategien. Voraussetzung für solche Überlegungen sind Informationen über die Zahl der infizierten Tiere unter Feldbedingungen, die Erregerverbreitung in den verschiedenen Geweben und die Ausscheidung des Erregers durch lebende Tiere, sowie möglichst genaue Daten und Annahmen zu den Infektionswegen und zur minimalen Infektionsdosis bei Mensch und Tier.
Schließlich sind in Bezug auf die Gefährdung des Menschen eine mögliche Reduktion des Erregergehaltes durch lebensmitteltechnologische Bearbeitung sowie die Höhe der Speziesbarriere zwischen Rind und Mensch in die Überlegungen einzubeziehen. Diese Analysen werden dadurch verkompliziert, dass der ursächliche TSE-Erreger bis heute nicht eindeutig identifiziert, sondern nur postuliert werden konnte.
Am Friedrich-Loeffler-Institut wurde der Schwerpunkt der Forschungsarbeiten auf die Erforschung der Pathogenese, der Erregerverbreitung und -ausscheidung sowie auf die Untersuchung zu Speziesbarrieren bei TSE-Übertragungen gelegt.
Die dazu von mir geleisteten Arbeiten sind in dieser Arbeit zusammengefasst.
1.1. Theorien zur Natur des TSE-Erregers
Virus- und Virino-Hypothesen
Nachdem die Übertragbarkeit der Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien mittels experimenteller Infektion verschiedener Tierspezies bewiesen worden war, wurden verschiedene Erregertypen als Ursache diskutiert. Transmissible Spongiforme Enzephalopathien weisen Charakteristika einer sogenannten ‚slow- virus’-Infektion wie beispielsweise einer Retrovirusinfektion auf, da die
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Inkubationszeit Monate bis Jahre dauern kann, nach Ausbruch der Krankheit aber eine Heilung nicht mehr möglich ist (Gajdusek, 1977). Auch ‚Virinos’, also äußerst kleine Viruspartikel, wurden als TSE-Erreger diskutiert (Dickinson & Outram, 1988). Beiden gemeinsam ist die Hypothese, dass das Agens nur über eine sehr kleine Nukleinsäure verfügen kann, und dass es von einer Hülle aus wirtseigenen Proteinen umgeben sein muss. Allerdings ist es verschiedenen Arbeitsgruppen bisher nicht gelungen, in Hirnpräparationen erkrankter Individuen eine erregerspezifische Nukleinsäure nachzuweisen (Meyer et al., 1991; Riesner et al., 1993; Safar et al., 2005). Die Beteiligung von Nukleinsäuren wäre die einfachste Erklärung für das Auftreten von TSE-Erregerstämmen. Die Arbeitsgruppe um Laura Manuelidis konnte immerhin zeigen, dass in der erregerhaltigen Fraktion einer Hirnpräparation kurze Nukleinsäuren in der 120S-Fraktion angereichert werden, die in der entsprechenden Fraktion aus Gehirnen gesunder Individuen nicht nachweisbar sind (Akowitz et al., 1990; Dron et al., 1996; Manuelidis, 2007).
‚Protein-only’-Hypothese
Auf der Suche nach einem Erreger ohne Nukleinsäure entwickelte Stanley Prusiner 1982 die sogenannte ‚protein-only’-Hypothese. Nach diesem Modell ist ein fehlgefaltetes körpereigenes Protein in der Lage, diese Umfaltung in die pathologische Isoform auch bei anderen Molekülen desselben Proteins auszulösen (Prusiner, 1982). Aus dem Begriff des „Protein-artigen infektiösen Partikels“
(‚proteinaceous infectious particle’; ‚proin’) wurde der Terminus ‚prion’ gebildet.
Ähnliche Postulate waren bereits in den 1960er Jahren geäußert worden (Pattison
& Jones, 1967; Alper et al., 1967; Griffith, 1967).
Für den molekularen Ablauf der Erreger-Replikation wurden zwei Modelle proklamiert: Das Kristallisationskeim-Polymerisierungsmodell geht von einem physiologischen Gleichgewichtszustand zwischen PrPC und PrPSc aus, der normalerweise zugunsten des PrPC liegt. Entstehen nun spontan Umfaltungen zu PrPSc oder werden solche Moleküle von außen zugefügt, agieren diese als
‚Kristallisationskeime’ (’seed’), wodurch sich das Gleichgewicht zugunsten von PrPSc verschiebt. Solche größeren PrPSc-Aggregate zerfallen in kleinere Produkte, die wiederum als neue Kristallisationskeime agieren (Jarret & Lansbury, 1993).
Das von Prusiner (1991) postulierte Heterodimermodell geht davon aus, dass eine
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Energiebarriere die spontane Umfaltung von PrPC zu PrPSc verhindert. Die Umfaltung wird erst nach der Anlagerung eines PrPSc-Moleküls an ein PrPC- Molekül initiiert und möglicherweise durch ein weiteres Protein (Protein X) als Kofaktor unterstützt. Nach der Umfaltung dissoziiert das neu gebildete PrPSc- Homodimer in PrPSc-Monomere und kann sich an weitere PrPC-Moleküle anlagern.
1.2. Das Prion-Protein
Wenige Jahre nachdem die Prion-Hypothese postuliert worden war, konnte tatsächlich ein körpereigenes Protein diesem Krankheitsgeschehen zugeordnet werden (Oesch et al., 1985). Es wurde folglich als ‚Prion-Protein’ bezeichnet.
Prion-Proteine sind unter den Säugetierspezies hochkonserviert, was für eine wichtige physiologische Funktion des Proteins sprechen kann. Dem Prion-Protein ähnliche Proteine wurden ebenfalls bei Hühnervögeln (Harris et al., 1991; Gabriel et al., 1992) und Fischen (Suzuki et al., 2002; Rivera-Milla et al., 2003) und sogar bei Hefen (Wickner, 1994) identifiziert. Allerdings konnte die Funktion des Prion- Proteins bisher nicht eindeutig identifiziert werden, da sogar transgene Mäuse und Rinder, denen dieses Protein fehlt, uneingeschränkt lebens- und leistungsfähig sind und auch sonst keine phänotypischen Veränderungen zeigen (Büeler et al., 1992; Manson et al., 1994; Richt et al., 2007). Es wird daher diskutiert, ob andere Proteine beim Fehlen des Prion-Proteins dessen Aufgaben übernehmen können.
Das Prion-Protein scheint einen Einfluss auf den Schlaf-Rhythmus (Tobler et al., 1996) sowie auf die Signalübertragung an GABAergen Synapsen zu haben (Collinge et al., 1994; Manson et al., 1995). Allerdings konnte dies von anderen Arbeitsgruppen nicht bestätigt werden (Herms et al., 1995; Lledo et al., 1996).
Weiterhin wurde eine Funktion als Bindungspartner für zweiwertige Kationen wie Kupfer diskutiert (Brown et al., 1997; Kuczius et al., 2004; Davies & Brown, 2008), wodurch das Prion-Protein zum Ionenhaushalt der Neuronen beitragen könnte.
Außerdem wird dem Prion-Protein eine Funktion in der Entwicklung und dem Erhalt bestimmter Zellfraktionen des Immunsystems zugeschrieben (Mabbott et al., 1997; Aude-Garcia et al., 2010). Zuletzt wurde ein Einfluss des Prion-Proteins auf die Entwicklung von Neuronen beschrieben (Linden et al., 2008). Die Bandbreite
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der diskutierten Funktionen deutet darauf hin, dass dem Prion-Protein eine wichtige Rolle beim Zusammenspiel von Signalmodulen an der Zelloberfläche zukommt, woraus die verschiedenen Einflüsse auf die Zellphysiologie und schließlich auf das Verhalten des jeweiligen Trägers resultieren. Das Prion-Protein wird in zahlreichen Organen exprimiert, die höchsten Konzentrationen sind jedoch in und auf Nervenzellen und Astrozyten nachweisbar.
Das maturierte Protein umfasst je nach Spezies 230-240 Aminosäuren. Es wird post-translational modifiziert, indem am N-Terminus eine 22 Aminosäuren lange Signalsequenz abgespalten wird. Am C-Terminus wird eine 20 Aminosäuren lange Sequenz abgespalten und durch einen Glykophospho-Inositol-Anker (GPI-Anker) ersetzt. Über diesen Anker ist die funktionelle Form des Proteins an die Zellmembran gebunden. Das Prion-Protein verfügt über zwei Bindungsstellen für Zuckerseitenketten an den Positionen 180 und 196 (bezogen auf Maus-PrP), sodass im Immunoblot drei Banden sichtbar sind: die unglykosylierte, die einfach- und die zweifach-glykosylierte Form des Proteins.
Die physiologische Form des Proteins, PrPC, und die krankheitsassoziierte pathologische Form, PrPSc, verfügen zwar über identische Aminosäuresequenzen, sie unterscheiden sich jedoch in ihrer Tertiärstruktur. Während PrPC überwiegend α-helikale Strukturen aufweist, enthält PrPSc vermutlich vier antiparallele β- Faltblatt-Stränge. Diese deutlich komplexere Struktur der Kernregion des Proteins resultiert in einer partiellen Resistenz gegenüber Protease-Verdau, was im Rahmen der diagnostischen Untersuchungen genutzt wird (siehe Kapitel 2.5.).
1.3. Zusammenhang zwischen Prionerkrankungen und anderen Proteinopathien
In der jüngsten Vergangenheit wurden mehr und mehr Parallelen zwischen den Prionenkrankheiten und anderen Proteinopathien aufgezeigt. Alle Krankheiten dieser Gruppe sind durch die Ablagerung fehlgefalteter Proteine im neuronalen Gewebe und dadurch bedingte Neurodegenerationen gekennzeichnet.
Insbesondere Morbus Alzheimer, bei dem das Aβ-Protein als Aβ-Fibrillen angereichert wird, Morbus Parkinson, bei dem das alpha-Synuclein in sogenannten Lewy-Körperchen abgelagert wird, und Chorea Huntington, bei dem
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das durch Mutation veränderte Huntingtin in amyloiden Ablagerungen nachgewiesen werden kann, werden hierbei genannt (Cushman et al., 2010). Im Gegensatz zu den Prionerkrankungen scheinen die anderen Proteinopathien jedoch per se nicht infektiös zu sein (Morales et al., 2010). Allerdings entwickelten transgene Mäuse, die das Aβ-Protein überexprimieren, nach Inokulation von Hirnextrakten Morbus Alzheimer- erkrankter Patienten eine deutliche Zunahme der amyloiden Strukturen und der Alzheimer-assoziierten pathologischen Veränderungen im Gehirn (Meyer-Luehmann et al., 2006). Ein funktioneller Zusammenhang zwischen dem Prion-Protein und dem Aβ-Protein wird bereits seit geraumer Zeit diskutiert (Gajdusek, 1989); es konnte inzwischen gezeigt werden, dass Alzheimer-assoziierte amyloide Plaques mit PrP-spezifischen Antikörpern angefärbt werden können (Velayos et al., 2009). Die genauen Mechanismen dieser Zusammenhänge werden allerdings in der Literatur kontrovers diskutiert.
1.4. Inaktivierung von TSE-Erregern
Alle Desinfektionsverfahren, die die Inaktivierung viraler Nukleinsäuren zum Ziel haben, bleiben bei der Inaktivierung der TSE-Erreger wirkungslos. Dazu zählt die UV-Bestrahlung und einfache Hitze-Einwirkung (Alper et al., 1967; Zlotnik &
Rennie, 1967). Dagegen haben Verfahren, die auf die Denaturierung von Proteinen abzielen, mehr Erfolg. Routinemäßig werden TSE-kontaminierte Gegenstände oder Materialien einer Hitze- und Druck-Behandlung im Dampfautoklaven (136 °C, 3 bar) unterzogen. Die Haltezeit sollte dabei mindestens eine Stunde betragen (Anonym 2003a); beim Vorliegen hoher TSE- Erreger-Konzentrationen sind 2 Stunden Haltezeit üblich. Alternativ können Gegenstände mit mindestens 1 M Natronlauge oder 2,5%
Natriumhypochloritlösung dekontaminiert werden, die Einwirkzeit beträgt hier mindestens eine Stunde.
Da diese Behandlungen äußerst materialunverträglich und teilweise stark korrosiv sind, wurden Anstrengungen zur Entwicklung alternativer Methoden, insbesondere zur Dekontamination chirurgischer Instrumente, unternommen. Dazu gehört unter anderem der Einsatz von Radiofrequenz (RF)-Gas-Plasma (Baxter et al., 2005),
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enzymatischer Proteolyse (McLeod et al., 2004) und Hochdruck (Garcia et al., 2004).
1.5. Diagnostische Möglichkeiten
Die Zielregion für die gemäß aktiven Überwachungsprogrammen vorgeschriebene Schnelltestuntersuchung bzw. für die diagnostische Untersuchung TSE- verdächtiger Tiere ist die Obexregion im Hirnstamm. Es konnte gezeigt werden, dass im Kern des Tractus solitarius, im Tractus spinalis nervi trigemini und im dorsalen Vaguskern (DMNV) bei BSE-infizierten Rindern der früheste Nachweis von Vakuolisierung und PrPSc-Ablagerungen gelingt (Wells et al., 1987; Wells et al., 1989). Auch bei TSE-infizierten kleinen Wiederkäuern gelingt der Nachweis in dieser Region schon früh. Diese Hirnregion ist darüber hinaus leicht zugänglich, da sie durch das Foramen occipitale entnommen werden kann, ohne den Schädel zu eröffnen.
Die bereits erwähnte partielle Resistenz des PrPSc gegenüber Protease-Verdau bildet die Grundlage für die meisten der heute angewandten diagnostischen Verfahren. Ein Verdau mit der unspezifisch hydrolysierenden Proteinase K führt zum vollständigen Verdau von PrPC, während PrPSc nur bis zu einer stammspezifisch definierten Spaltstelle zwischen den Aminosäurepositionen 89 und 103 hydrolysiert wird (Hope et al., 1999; 2000). Diese Unterschiede in der Lokalisation der Proteinase K-Spaltstelle kann zur Unterscheidung verschiedener TSE-Stämme, beispielsweise zur Unterscheidung zwischen einer Scrapie- und einer BSE-Infektion, genutzt werden. Der übrige komplex strukturierte Teil des Proteins ist für die Protease nicht zugänglich und bleibt daher erhalten. Mithilfe Prion-Protein-spezifischer Antikörper, die an C-terminal der Position 89 gelegene Epitope binden, kann dieses Fragment mittels immunologischer Methoden nachgewiesen werden. Während bei der Mehrzahl der zugelassenen TSE- Schnelltestverfahren das ELISA-Format zur Anwendung kommt, wird im Rahmen der Bestätigungsuntersuchung am nationalen Referenzlabor ein Immunoblotverfahren angewandt. Hierbei werden die den drei Glykosylierungsformen des Proteins entsprechenden Proteinbanden spezifisch
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angefärbt. Dieses Immunoblotverfahren nach Aufreinigung der Scrapie- assoziierten Fibrillen (SAF) ist eine der von der ‚World Organisation for Animal Health’ (O.I.E.) zugelassenen Bestätigungsmethoden (Anonym 2008). Weiterhin findet eine immunhistochemische (IHC) Färbung histologischer Präparate häufig Anwendung in der TSE-Diagnostik, wobei die TSE-spezifischen intra- und extrazellulären Ablagerungen auf Zellebene sichtbar gemacht werden. In Abhängigkeit vom jeweils vorliegenden TSE-Stamm zeigt sich ein typisches immunhistologisches Reaktionsmuster. Dabei können neben feingranulären Ablagerungen auch amyloide oder floride Plaques auftreten. Auch eine Analyse der histopathologischen Veränderungen kann Aufschluss über das Vorliegen einer TSE geben. Hierzu werden die stammspezifisch beschriebenen Zielgebiete, beispielsweise der Kern des Tractus solitarius, der Tractus spinalis nervi trigemini und der dorsale Vaguskern in der Obexregion des Rindes auf das Vorliegen von Vakuolen untersucht. Diese Methode ist stärker als die beiden zuvor genannten vom Frischegrad und der präparativen Qualität der Proben abhängig. Auch wurde inzwischen bekannt, dass in seltenen Fällen beim Rind die Vakuolisierung der Kerngebiete ausbleiben kann, obwohl eine BSE-Infektion vorliegt. Daher müssen bei einem BSE-verdächtigen Tier selbst beim Fehlen BSE-spezifischer histopathologischer Befunde andere Methoden wie IHC oder SAF-Immunoblot zur Abklärung des Verdachts durchgeführt werden. Zu Beginn der BSE-Überwachung im Vereinigten Königreich wurde routinemäßig eine elektronenmikroskopische Darstellung der Scrapie-assoziierten Fibrillen durchgeführt. Da aber inzwischen bekannt ist, dass auch diese Methode weniger sensitiv als die anderen zur Verfügung stehenden Methoden ist, kommt sie heute diagnostisch nicht mehr zur Anwendung.
Eine neuere Methode, die bisher allerdings nicht in der Routinediagnostik eingesetzt wird, basiert, analog zur Vermehrung von Nukleinsäuren mittels Polymerase-Kettenreaktion, auf der Vermehrung von fehlgefaltetem Protein durch die sog. PMCA- (‚Protein Misfolding Cyclic Amplification’) Reaktion (Saborio et al., 2001). Dazu werden Hirnpräparationen gesunder und kranker Tiere (am zuverlässigsten gelingt dies bisher im Hamstersystem) gemischt und über einen bestimmten Zeitraum bei 35 °C inkubiert. Während dieser Zeit bilden sich aus dem eingesetzten PrPC nach Anlagerung an PrPSc und nachfolgender Umfaltung in die
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pathologische Isoform neue PrPSc-Aggregate. Anschließend wird der Reaktionsansatz einer Ultraschallbehandlung ausgesetzt, wobei die größeren Aggregate gesprengt werden und dann wiederum als neue Kristallisationskeime wirken können. Diese Behandlung wird etwa 30 bis 35 Mal wiederholt, sodass auch minimale PrPSc-Mengen, die in die Reaktion eingesetzt wurden, so weit amplifiziert werden, dass sie mittels Immunoblot nachweisbar sind. Um die Sensitivität weiter zu steigern, können mehrere Zyklen dieses Ablaufs nacheinander geschaltet werden, wobei nach Abschluss eines jeden Zyklus frisches PrPC-Substrat zugegeben wird (Castilla et al. 2005a, Castilla et al. 2005b, Castilla et al. 2006). Mit Hilfe dieser Methode ist es möglich, geringste PrPSc- Mengen im Blut infizierter Hamster soweit zu amplifizieren, dass sie mittels Immunoblot eindeutig nachweisbar werden. Nach jüngsten Berichten gelingt diese Generierung von PrPSc sogar ohne Zugabe von frischem Hirngewebe Scrapie- kranker Hamster, und dieses neugebildete PrPSc war im Tierversuch für Hamster infektiös (Castilla et al., 2005b).
Zusammenhang zwischen Infektiosität und PrPSc-Gehalt
Obwohl zahlreiche Beobachtungen dafür sprechen, dass es sich bei dem TSE- Erreger tatsächlich um das infektiöse Prion-Protein handelt, lassen andere Daten Zweifel an einem direkten Zusammenhang zwischen dem Grad der PrPSc- Ablagerung im Gewebe und dem Infektionstiter aufkommen. Dies wurde eindrucksvoll bei einer experimentellen BSE-Infektion von C57Bl-Mäusen gezeigt, von denen nach der BSE-Infektion nur ein Teil der Tiere PrPSc-Ablagerungen im Gehirn aufwies, obwohl alle Tiere eindeutig klinisch erkrankt waren. Bei einer Subpassage gelang auch die Übertragung aus Gehirnen, in denen keinerlei PrPSc nachweisbar war (Lasmezas et al., 1997). Ähnliche Beobachtungen wurden bei eigenen Versuchen gemacht, als zur Charakterisierung transgener Mäuse, die das bovine Prion-Protein überexprimieren, ein Isolat für das Tierexperiment gewählt wurde, welches im Immunoblot besonders starke Proteinsignale aufwies. Es stellte sich heraus, dass der Erregertiter in diesem Isolat deutlich geringer war als in anderen Isolaten mit weniger starken Proteinsignalen im Immunoblot (Balkema- Buschmann und Groschup, eigene Beobachtung). Auch bei GSS-Patienten werden zwei phänotypische Varianten beobachtet, von denen die eine mit kaum
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nachweisbaren Vakuolisierungen oder PrPSc-Ablagerungen einhergeht (Piccardo et al., 2007). Direkte Rückschlüsse vom PrPSc-Gehalt auf den Erregertiter sollten daher nur in gut etablierten und untersuchten Erreger-Wirt-Systemen, wie beispielsweise dem hamsteradaptierten Scrapie-Stamm 263K in Syrischen Goldhamstern, gezogen werden, nicht jedoch bei der Charakterisierung von Feldisolaten.
Standardisierung der TSE-Schnelltestüberwachung
Nach dem Nachweis des ersten einheimischen BSE-Falls in Deutschland im November 2000 wurde unter größtem Zeitdruck eine flächendeckende BSE- Überwachung mittels BSE-Schnelltests eingeführt. Zum Zeitpunkt der Implementierung des BSE-Überwachungsprogramms in der EU gemäß Verordnung 999/2001 (Anonym 2001) waren nur einige wenige BSE-Schnelltests verfügbar, über deren diagnostische und analytische Sensitivität nur wenige Erfahrungswerte vorlagen. Zur Durchführung der Untersuchungen standen zunächst die staatlichen Untersuchungslabors, nach kurzer Zeit auch private Schnelltestlabors zu Verfügung. So nahmen am ersten deutschen BSE- Ringversuch 2002 mehr als 100 Untersuchungseinrichtungen teil, während am Ringversuch 2010 noch 21 Einrichtungen beteiligt waren. Jährlich werden seitdem mehr als 1 Millionen Rinder mittels Schnelltest auf das Vorhandensein einer BSE- Infektion untersucht, insgesamt sind allein in Deutschland bis Ende 2010 mehr als 20 Millionen Rinder untersucht worden.
Die erste Evaluierung von vier Schnelltests im Jahr 1999 wurde durch das Institut für Referenzmaterialien und -methoden (IRMM) in Geel, Belgien, durchgeführt; die Auswertung der Ergebnisse erfolgte im Auftrag der EU-Behörden zunächst durch eine wissenschaftliche Arbeitsgruppe, die später durch eine Arbeitsgruppe der Europäischen Agentur für Lebensmittelsicherheit (EFSA) abgelöst wurde. Hierbei wurde lediglich die korrekte Erkennung von 336 positiven und 1024 negativen Proben sowie von Verdünnungsstufen bis 10-5 einer BSE-positiven Probe überprüft (Anonym 1999). Im Jahr 2002 wurde eine zweite Testevaluierung durchgeführt, hieran nahmen die Testverfahren von fünf Herstellern teil. Beurteilt wurden die Spezifität anhand der Untersuchung von nur 152 negativen und 48 positiven Proben, sowie die analytische Sensitivität anhand der Untersuchung von
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Verdünnungsstufen bis 10-3 einer BSE-positiven Probe (Anonym 2002a). 2004 wurde eine weitere Evaluierung durchgeführt. Diesmal wurde zunächst eine Laboruntersuchung durchgeführt (Phase I), die die Untersuchung von 50 positiven und 150 negativen Proben sowie die Untersuchung von Verdünnungsstufen bis zu einer 1:200 Verdünnung einer BSE-positiven Probe umfasste. Von den zunächst zehn Testverfahren wurden neun Verfahren für die Phase II, eine Feldstudie, zugelassen. Diese Stufe umfasste die Untersuchung von 200 positiven und 10.000 negativen Proben, sowie zusätzlich 200 negative Proben, die einen schlechten Erhaltungszustand aufwiesen (autolytische Proben). Nach dieser dritten Evaluierung wurde für sieben Testverfahren eine EU-weite Zulassung erteilt (Anonym, 2004). Nach allen drei Evaluierungsstufen erhielten die Tests die Zulassung für die Schnelltest-Untersuchung von Rinderproben, sowie nach Implementierung eines TSE-Überwachungsprogramms 2002 automatisch auch für die Untersuchung von Proben kleiner Wiederkäuer.
1.6. Transmissible Spongiforme Enzephalopathien (TSE)
Der Krankheitskomplex der Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien umfasst eine Reihe von Erkrankungen bei Mensch und Tier, die unterschiedliche Ursachen haben können, jedoch ausnahmslos durch die Entwicklung neurodegenerativer Veränderungen und einen tödlichen Verlauf charakterisiert sind. Die Ursachen können spontaner, erblicher oder infektiöser Natur sein. Als Sonderformen sind auch die iatrogenen, also im Rahmen von medizinischen Behandlungen entstandenen, Infektionen zu nennen. Die Besonderheiten der Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien sind zum einen die Übertragbarkeit selbst spontan aufgetretener Erkrankungen und zum anderen die bis heute nicht vollständig geklärte Frage der Natur der zugrunde liegenden Infektionserreger.
11 1.6.1. TSE-Erkrankungen beim Tier
Scrapie
Die Scrapie oder Traberkrankheit von Schaf und Ziege wurde vor mehr als 250 Jahren erstmals beschrieben und ist somit die am längsten bekannte TSE (McGowan, 1922). Sie stellt eine Herdentiererkrankung dar, bei der die Erreger direkt oder indirekt von Tier zu Tier übertragen werden. Eine besondere Bedeutung bei der Übertragung scheint dem Geburtsgeschehen zuzukommen, wobei bis heute nicht abschließend geklärt ist, ob der Erreger hauptsächlich prä-, peri- oder postnatal auf die Nachkommen übergeht. Auch die horizontale Übertragung auf andere Herdenmitglieder durch Kontakte mit der infektiösen Nachgeburt spielt eine bedeutende Rolle bei der Krankheitsverbreitung. Klinisch ist die Scrapie geprägt durch veränderte Bewegungen mit trabartigem Gang (‚Traberkrankheit’) bis hin zur Ataxie sowie Juckreiz (englisch: ‚to scrape’) und dem charakteristischen Zittern (französisch: ‚la tremblante’), insbesondere sichtbar an den Lippen. Allerdings bleiben in der Praxis viele Scrapie-Fälle unentdeckt und werden erst postmortal nachgewiesen.
Beim Schaf wurden Mutationen im Gen für das Prion-Protein identifiziert, die die Empfänglichkeit für Scrapie- oder BSE-Infektionen beeinflussen. Diese sind zunächst die Positionen 136 (Alanin [A] oder Valin [V]), 154 (Arginin [R] oder Histidin [H]) sowie 171 (Glutamin [Q], Histidin [H] oder Arginin [R]). Aus der Kombination dieser drei Kodons ergeben sich 15 natürlich vorkommende Allele, die in fünf TSE-Risikogruppen unterteilt wurden (Anhang 1; Tabelle 1) und die als Grundlage für Scrapie-Resistenz-Zuchtprogramme gelten. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Träger des PrPARQ-Allels, die an Position 141 ein Phenylalanin [F] anstelle des Leucin [L] tragen (PrPAFRQ-Allel), besonders häufig an atypischer Scrapie (s.u.) erkranken (Moum et al., 2005; Goldmann et al., 2006;
Mitteilung 13). Daher wird im Fall des Nachweises von atypischer Scrapie zusätzlich diese Position analysiert.
Nachdem homozygote Träger des PrPARR-Allels lange Zeit als absolut resistent gegenüber allen Arten von TSE-Erregern angesehen wurden, stellte sich heraus, dass solche Tiere durchaus experimentell (d.h. mittels intrazerebraler Inokulation) mit BSE- und Scrapie-Erregern infiziert werden konnten (Gonzales et al., 2005).
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Ein erster Bericht eines natürlich aufgetretenen Scrapie-Falls bei einem PrPARR- homozygoten Tier in Japan (Ikeda et al., 1995) ist umstritten, da er mangels Probenmaterials nicht unabhängig in einem zweiten Labor bestätigt werden konnte. Jedoch wurden kürzlich zwei Scrapie-Fälle bei homozygoten Trägern des PrPARR-Allels in Deutschland und Frankreich beschrieben (Groschup et al., 2007).
Insofern ist die Scrapie-Resistenz von Schafen dieses Genotyps nur relativ, aber nicht absolut.
Auch die Pathogenese der Scrapie-Infektion bei Schafen ist abhängig vom Genotyp der Tiere. Bei hochempfänglichen Tieren, insbesondere bei homozygoten Trägern des PrPVRQ- oder des PrPARQ-Allels, ist das lymphatische System schon sehr früh in die Pathogenese involviert, und es können in der Milz sowie in verschiedenen Körperlymphknoten PrPSc-Ablagerungen nachgewiesen werden (Schreuder et al., 1998; Heggebo et al., 2002; Heggebo et al., 2003; Langeveld et al., 2006). Bei PrPVRQ-homozygoten Lämmern, die in einer infizierten Herde geboren worden waren, wurden solche Depositionen schon bei nur wenigen Lebenswochen alten Lämmern beschrieben (Andreoletti et al., 2000). Es ist dabei durchaus möglich, dass PrPSc-Ablagerungen und Scrapie-Erreger im peripheren Nervensystem und in der Muskulatur vorhanden sind, noch bevor sie mittels TSE- Schnelltest im Hirnstamm nachgewiesen werden können. Dies konnte für experimentell oral infizierte Schafe des Genotyps PrPARQ gezeigt werden (Andreoletti et al., 2004). Die immunhistochemische Untersuchung peripherer Körperproben von Tieren mit negativem Schnelltestergebnis aus einer von klassischer Scrapie betroffenen Herde aus Sachsen-Anhalt machte dies ebenfalls deutlich. Hier wurde bei 40 der 169 untersuchten Tiere eine Scrapie-Infektion nachgewiesen, obwohl der PrPSc-Nachweis im Hirnstamm negativ ausfiel (Reckzeh et al., 2007).
Atypische Scrapie
Im Jahr 2002 wurde ein EU-weites aktives TSE-Überwachungsprogramm bei kleinen Wiederkäuern eingeführt, das die stichprobenartige Untersuchung von gesund geschlachteten sowie gefallenen Tieren mittels BSE-Schnelltest vorschrieb. In Folge stieg die Zahl der festgestellten Scrapie-Fälle in der EU sprunghaft an. Auch in Deutschland wurden anstatt der zuvor maximal vier durch
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passive Überwachung, also durch die klinische Untersuchung auffällig gewordener Tiere nachgewiesenen Fälle nun mehr als 30 Fälle pro Jahr festgestellt. Unter diesen vermehrt entdeckten Fällen waren allerdings auch Fälle mit abweichenden labordiagnostischen Charakteristika: nicht alle wurden von allen zugelassenen BSE-Schnelltests gleichermaßen zuverlässig erkannt. Darüber hinaus gab es deutliche Abweichungen in der Qualität und Quantität der immunhistochemisch feststellbaren PrPSc-Ablagerungen in verschiedenen Gehirnlokalisationen.
Schließlich besaß das im Immunoblot nachgewiesene PrPSc ein uncharakteristisches Bandenmuster (‚Profil’). Diese Fälle wurden demzufolge als atypische Scrapie-Fälle bezeichnet (Mitteilung 3). Ähnliche Fälle waren in 1998 in Norwegen aufgetreten und als Nor98-Fälle bezeichnet worden (Benestad et al., 2003). Hauptmerkmal der atypischen Scrapie-Fälle ist die deutliche Beteiligung des Kleinhirns, die sogar soweit gehen kann, dass PrPSc-Ablagerungen ausschließlich dort und nicht im Hirnstamm (Obex als übliche Zielregion für diagnostische Untersuchungen) auftreten. Auch das mittels Immunoblot nachweisbare PrPSc-Bandenprofil unterscheidet sich deutlich von dem bei der klassischen Scrapie, da mindestens fünf anstelle von drei Banden erkennbar sind, von denen die unterste Bande eine Molekularmasse von ca. 11 kDa hat. Analysen dieser Bande mittels Antikörper-Bindungs-Assay ergaben, dass es sich hierbei um die zentrale Region des Prion-Proteins handelt (Mitteilung 7).
Mittlerweile wurden atypische (bzw. Nor98-) Fälle in nahezu allen EU- Mitgliedsstaaten, sowie auf den Falkland-Inseln (Epstein et al., 2005), in den Vereinigten Staaten von Amerika (Cook, 2007) und in Kanada (Mitchell et al., 2010) nachgewiesen. Darüber hinaus wurde in Australien der Verdacht des Vorliegens von atypischer Scrapie bei einem Schaf geäußert (ProMED 2010) und die Krankheit wurde im Vereinigten Königreich in einer geschlossenen Herde von Schafen aus Neuseeland festgestellt, die seit dem Import unter strengen Hygienebedingungen gehalten wurden, die eine Infektion im Vereinigten Königreich ausschließen (Simmons et al., 2009). In Deutschland machen solche Fälle mehr als 80% der Scrapie-Fälle bei Schafen aus. In retrospektiven Untersuchungen konnten sogar zwei solche Fälle im Vereinigten Königreich bei im Jahre 1987 und 1989 unter klinischem Scrapie-Verdacht getöteten Schafen identifiziert werden (Webb et al., 2009; Bruce et al., 2007). Atypische Scrapie-Fälle
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wurden auch bei der Ziege beschrieben (Seuberlich et al., 2007). Zur Beantwortung der Frage, ob es sich bei atypischer Scrapie und Nor98 um denselben TSE-Stamm handelt, wurden verschiedene transgene Mauslinien, die das Prion-Protein des Schafes exprimieren, mit Isolaten aus verschiedenen EU- Mitgliedsstaaten infiziert. Nach Inokulation von PrPVRQ-deprimierenden transgenen Mäusen mit französischen und norwegischen Isolaten wurden die Inkubationszeiten in den Mäusen, sowie die stammtypischen Läsionsprofile in den Gehirnen der Mäuse verglichen. Diese Läsionsprofile werden anhand des Vakuolisierungsgrades in neun Regionen der grauen Substanz und vier Regionen der weißen Substanz ermittelt. Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den französischen und norwegischen Isolaten festgestellt (LeDur et al., 2005). Auch biochemische Untersuchungen sprechen dafür, dass es sich bei diesen atypischen / Nor98-Fällen um einen einzigen Stamm bzw. um Untergruppen dieses Stammes handelt (Arsac et al., 2007). Während es sich bei der klassischen Scrapie um eine eindeutige Herdenerkrankung handelt, treten atypische Scrapie-Fälle zumeist als Einzeltiererkrankung auf. Kürzlich wurde in einer von klassischer Scrapie betroffenen Herde bei einem Schaf das gleichzeitige Vorliegen von klassischer und atypischer Scrapie nachgewiesen (Mazza et al., 2010). In einigen Herden wurde atypische Scrapie bei mehr als einem Tier nachgewiesen, hierbei handelte es sich jedoch fast ausschließlich um sehr große Herden mit mehr als 1000 Schafen. Die Entstehung dieser Fälle ist noch ungeklärt.
Das Auftreten in Ländern, in denen das Fälle von klassischer Scrapie bisher nicht beobachtet wurden, sowie die relativ gleichmäßige Verteilung in den EU- Mitgliedstaaten bei gleichzeitig sehr unterschiedlicher Prävalenz der klassischen Scrapie (Benestad et al, 2008) lassen auf eine spontane Ursache schließen.
Allerdings ist die Häufigkeit der Fälle dabei erstaunlich hoch.
Vergleichende Analysen der pathologischen Veränderungen im Kleinhirn von mit atypischer Scrapie betroffenen Schafen aus Schweden und Norwegen ergaben darüber hinaus gewisse Ähnlichkeiten mit den bei der sporadischen Creutzfeldt- Jakob-Krankheit beschriebenen Charakteristika (Gavier-Widen et al., 2007). Diese Beobachtungen reichen jedoch nicht aus, um daraus auf einen kausalen Zusammenhang dieser beiden TSE-Erkrankungen zu schließen.
15 Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE)
TSE-Infektionen beim Tier sind erst nach dem Auftreten der ersten BSE-Fälle beim Rind in das breitere wissenschaftliche und in das öffentliche Interesse gerückt. Die ersten Fälle wurden 1985 im Vereinigten Königreich beobachtet (Wells et al., 1987). Als Ursache konnte schon sehr bald die unzureichende Erhitzung von Wiederkäuer-Fetten und -Proteinen bei der Herstellung von Wiederkäuer- Futterkonzentrat und Milchaustauschern identifiziert werden (Wilesmith et al., 1991). Allerdings konnte bis heute nicht abschließend geklärt werden, ob die eigentliche Ursache der BSE-Epidemie bei der Verwertung von Scrapie-infizierten Kadavern kleiner Wiederkäuer (Wilesmith et al., 1988; Wilesmith et al., 1991) oder bei der Verarbeitung von spontan an BSE erkrankten Rindern (Eddy, 1995) zu suchen ist. Seit 1985 wurden allein im Vereinigten Königreich mehr als 180.000 BSE-Fälle bei Rindern festgestellt. Nahezu alle Fälle wurden im Rahmen der passiven Überwachung, also nach dem Auftreten klinischer BSE-Symptome, nachgewiesen. Es wird daher davon ausgegangen, dass im Verlauf der Epidemie mehr als dreieinhalb Millionen Rinder mit dem BSE-Erreger infiziert worden sind (Donnelly et al., 2002), wobei die überwiegende Zahl der Tiere jedoch nicht das Alter erreichte, in dem es zum Ausbruch klinischer BSE-Symptome kam. Solche präklinischen BSE-infizierten Rinder sind in den 1980er und vor allem in den 1990er Jahren massenhaft im Vereinigten Königreich in die Lebensmittelkette gelangt. Nahezu acht Jahre nach dem Beginn der Epidemie traten in den übrigen EU-Mitgliedsstaaten vermehrt BSE-Fälle auf, die vermutlich auf den Export von Futtermitteln und Rinderprodukten aus dem Vereinigten Königreich zurückzuführen sind. Klinisch ist die BSE vor allem durch Bewegungsstörungen bis hin zum Festliegen, durch einen deutlichen Konditionsverlust sowie durch Übererregbarkeit durch optische, akustische oder taktile Reize gekennzeichnet.
In Deutschland wurde der erste autochthone BSE-Fall erst vergleichsweise spät, nämlich im November 2000, entdeckt. Bis dahin war man offiziell von einer BSE- Freiheit Deutschlands ausgegangen, was fatalerweise dazu führte, dass staatliche Maßnahmen zur BSE-Bekämpfung im Vergleich zu den übrigen EU- Mitgliedsstaaten erst spät eingeführt wurden, so dass die durch die Bekämpfungsmaßnahmen erzielte Reduzierung der jährlich gemeldeten BSE- Fallzahlen auch erst vergleichsweise spät einsetzte. Die höchste jährliche Zahl der
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BSE-Fälle wurde in Deutschland im Jahr 2002 mit 125 Fällen gemeldet, seitdem gehen die Zahlen zurück und in den Jahren 2008 und 2009 wurden nur noch jeweils zwei BSE-Fälle gemeldet. Im Jahr 2010 wurde bis November kein BSE-Fall in Deutschland festgestellt.
Die BSE-Pathogenese beim Rind verläuft grundlegend anders als die TSE- Pathogenese beim Schaf, da bei Rindern das lymphatische System wenn überhaupt, dann nur marginal involviert ist. Der einzige Nachweis von PrPSc gelang bisher in den Peyerschen Platten des distalen Ileums (Wells et al., 1998; Terry et al., 2003) und in den Tonsillen von experimentell oral infizierten Rindern (Wells et al, 2005). Alle anderen Untersuchungen der Milz und der Körperlymphknoten auf PrPSc-Ablagerungen sowie auf das Vorhandensein von Infektiosität verliefen mit negativem Ergebnis (Wells et al., 1998; Wells et al., 2005; Mitteilung 2).
Atypische BSE
Obwohl bis nahezu 20 Jahre nach der Feststellung der ersten BSE-Fälle angenommen wurde, dass es weltweit nur einen einzigen BSE-Stamm gibt, wurden 2004 unabhängig voneinander in Italien und Frankreich sogenannte atypische BSE-Fälle bei Tieren festgestellt, die mehr als acht Jahre alt waren.
Inzwischen wurden weltweit 60 Fälle atypischer BSE festgestellt. Die Mehrzahl der Fälle ist in Europa aufgetreten, es wurden aber auch Fälle in Kanada, Japan und in den Vereinigten Staaten von Amerika gemeldet (siehe dazu Tabelle 2 im Anhang I). Der erste Fall in Frankreich (Biacabe et al., 2004) war durch eine ca. 1 kDa höhere Molekularmasse der unglykosylierten PrP-Fraktion (H-Typ) gekennzeichnet. Der erste Fall in Italien (Casalone et al., 2004) war gekennzeichnet durch eine ca. 1 kDa niedrigere Molekularmasse der unglykosylierten PrP-Fraktion (L-Typ), durch ein verändertes Glykoprofil sowie durch den vermehrten Nachweis Plaque-artiger PrPSc-Ablagerungen in der immunhistochemischen Untersuchung (Bovine Amyloidotic Spongiform Encephalopathy; BASE). Das Glykoprofil beschreibt die Mengenverhältnisse der drei Glykosylierungsformen (unglykosyliert, einfach und zweifach glykosyliert, siehe dazu auch Kapitel 2.2.) des Prion-Proteins. Darüber hinaus war auch dieser Fall durch eine veränderte anatomische Verteilung der PrPSc-Ablagerungen
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gekennzeichnet, wobei anstelle der Obex-Region hier der Thalamus sowie das Riechhirn vorrangig betroffen waren.
Retrospektive Untersuchungen der bis heute bestätigten deutschen BSE-Fälle bei Tieren über acht Jahren ergaben auch in Deutschland je einen Fall des H-Typs und einen Fall des L-Typs. Auch für die atypischen BSE-Fälle besteht die Frage nach der Ursache und auch hier kann ein spontanes Auftreten nicht ausgeschlossen werden. Übertragungsversuche dieser beiden abweichenden BSE-Formen auf Wiederkäuer-PrPC-überexprimierende transgene Mäuse ergaben bereits erste Hinweise auf eine mögliche Ursache der BSE: Nach Passage des H- Typs in bovinen sowie in ovinen PrP transgenen Mäusen wurde nach Untersuchung der Gehirne dieser infizierten Mäuse im Immunoblot wieder das atypische Bandenprofil beobachtet (Beringue et al., 2006). Nach Passage des L- Typs ergab zwar die Untersuchung der Gehirne der bovinisierten transgenen Mäuse das atypische Bandenprofil, in den Gehirnen der ovinisierten transgenen Mäusen wurde hingegen das Bandenprofil der klassischen BSE beobachtet (Beringue et al., 2007). Eine erste Passage dieses Isolates in konventionellen, nicht-transgenen Mäusen (C57Bl und RIII) führte zwar zu keiner nachweisbaren Infektion bei diesen Tieren, nach Subpassage zeigten jedoch auch diese Mauslinien das Bandenprofil der klassischen BSE (Capobianco et al., 2007). Es ist daher nicht auszuschließen, dass sich diese atypische und möglicherweise spontane BSE-Form nach Passage in verschiedenen Spezies zur wesentlich weiter verbreiteten klassischen BSE-Form entwickelt haben könnte.
Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Inkubationszeit nach Infektion von humanisierten transgenen Mäusen, die das empfängliche 129MM Allel (Methionin an Position 129 des Prion-Proteins, siehe dazu Kapitel 2.6.2.) tragen, mit zwei L-Typ (BASE)-Isolaten mit 595 und 649 Tagen (Kong et al., 2008) im Vergleich zur Inkubationszeit von >756 Tagen nach Infektion desselben Mausstammes mit klassischer BSE (Gambetti, 2006) deutlich verkürzt war. Da diese BASE-Fälle beim Rind nur vergleichsweise geringe PrPSc-Konzentrationen im Obex aufweisen, könnten daraus in Ausnahmefällen bei der Schnelltest- Untersuchung falsch-negative Ergebnisse resultieren, mit der Folge, dass das Fleisch solcher Tiere in die Lebensmittelkette gelangt. Um die Erregerverteilung in den verschiedenen Geweben von mit atypischer BSE infizierten Tieren näher zu
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analysieren, wurden am Friedrich-Loeffler-Institut deshalb Rinder-Infektionsstudien mit den beiden deutschen Isolaten durchgeführt (siehe dazu Kapitel 3.4.).
Ein Zusammenhang zwischen möglicherweise spontan auftretenden atypischen BSE-Fällen und sporadischen CJK-Fällen (sCJK) wird derzeit diskutiert.
Untersuchungen zur Pathomorphologie und zum proteinbiochemischen Profil der ersten L-Typ-Fälle in Italien zeigten eine deutliche Übereinstimmung mit sCJK- Fällen (Typ 2) bei Patienten, die das heterozygote Methionin/Valin-Allel auf Position 129 des Prion-Proteins tragen (Casalone et al., 2004). Dieser Hinweis bestätigte sich allerdings nach Untersuchung der Proteinase K-Resistenz des akkumulierten PrPSc nicht, da hierbei deutliche Unterschiede zwischen L-Typ BSE und sCJK Typ2 sichtbar wurden (Comoy et al., 2008).
Im Zuge der intensivierten Überwachung von klinisch BSE-verdächtigen Rindern im Vereinigten Königreich in den 1990er Jahren wurden dort bei Tieren über sechs Jahren einige Fälle beobachtet, bei denen die BSE-Untersuchungen zwar ein negatives Ergebnis ergaben, die histopathologische Untersuchung aber dennoch eine neuronale und axonale Degeneration und bei der Hälfte der Fälle auch eine Vakuolisierung der grauen Substanz unter anderem in Bereichen des Thalamus und Hippocampus ergab. Diese Erkrankung wurde als idiopathische Hirnstamm- neuronale Chromatolyse (engl.: idiopathic brainstem neuronal chromatolysis;
IBNC) bezeichnet (Jeffrey, 1992). Neuere Untersuchungen von Proben solcher Tiere mit hochsensitiven Methoden ergaben nun Hinweise darauf, dass es sich auch hierbei um eine Prionerkrankung handeln könnte, da in allen Fällen immunhistochemisch eine PrP-Ablagerung im Gehirn (in den meisten Fällen im Hirnstamm, aber auch -wie bei atypischer Scrapie- in der Molekularschicht des Kleinhirns) nachweisbar war. Darüber hinaus konnte nach einem milden Proteinase K-Verdau auch im ELISA- oder Westernblot-Verfahren akkumuliertes PrP detektiert werden. Daher wird vermutet, dass bei dieser Erkrankung eine Form des PrP angereichert wird, bei der die Protease-Resistenz noch weniger ausgeprägt ist als bei der atypischen Scrapie (Jeffrey et al., 2008). Zur experimentellen Übertragbarkeit dieser Erkrankung liegen bisher keine Erkenntnisse vor.
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Feline Spongiforme Enzephalopathie (FSE) und BSE in zoologischen Gärten Nur wenige Jahre nach dem Auftreten der ersten BSE-Fälle wurden, wieder zunächst im Vereinigten Königreich, die ersten Fälle von Feliner Spongiformer Enzephalopathie (FSE) bei Haus- und Zookatzen (Aldhous, 1990; Leggett et al., 1990; Wyatt et al., 1991; Peet & Curran, 1992; Willoghby et al., 1992) sowie Fälle von BSE bei in zoologischen Gärten gehaltenen Wiederkäuern (Kirkwood et al., 1990) festgestellt. Biochemische Untersuchungen der Molekularmasse und der Glykosylierungsprofile des abgelagerten PrPSc, sowie die Bestimmung der Läsionsprofile in mit diesen Isolaten infizierten Mäusen konnten diese Erkrankungen eindeutig mit dem BSE-Erreger in Zusammenhang bringen (Fraser et al., 1994). Wenige Zeit später wurden FSE-Fälle auch bei Hauskatzen in Norwegen (Bratberg et al., 1995), Liechtenstein und der Schweiz beschrieben. In Frankreich wurde FSE bei einem Geparden nachgewiesen (Lezmi et al., 2003).
2007 wurde der erste Fall von FSE bei einem in einem niederländischen Zoo geborenen und ab dem zweiten Lebensjahr in einem deutschen Zoo gehaltenen 14- jährigen Geparden festgestellt (Eiden et al., 2010). Insgesamt wurden bisher weltweit mehr als 100 Fälle von FSE bei Haus- und Wildkatzen beschrieben.
Chronic wasting disease (CWD)
Eine weitere TSE-Erkrankung, die sich unter natürlichen Bedingungen rasch in einer Population ausbreitet, ist die Chronic Wasting Disease (CWD) bei Hirschen in Nordamerika (Williams & Young, 1980; Williams & Young, 1992; Spraker et al., 1997). Besonders betroffen sind Weißwedelhirsche, Rothirsche, Maultierhirsche und Wapiti-Hirsche. CWD wurde kürzlich erstmals bei einem Elch festgestellt (Baeten et al., 2007). Die ersten CWD-Fälle wurden in den 1960er Jahren im US- Bundesstaat Wisconsin beobachtet, seitdem hat sich die Erkrankung rasant auf zahlreiche weitere Staaten ausgebreitet und stellt heute im gesamten mittleren Westen der USA bis nach Kanada eine ernste Bedrohung für Gatterwild sowie freilebende Wildwiederkäuer dar. In Deutschland scheint CWD nicht vorzukommen. Im Rahmen eines zwischen 2004 und 2006 durchgeführten Pilotprojektes wurden mehr als 7000 Hirnstammproben von Reh- und Damwild sowie von Rothirschen untersucht, hierbei wurde kein Fall von CWD festgestellt (Schettler et al., 2006). Da über das Vorkommen von CWD in der Europäischen
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Union keine weiteren Angaben vorliegen, wurde gemäß der aktualisierten Version der EU-Verordnung 999/2001 zunächst für die Jagdsaison 2007/2008 ein EU- weites Überwachungsprogramm für freilebende und für in Gefangenschaft gehaltene Rot- und Weißwedelhirsche eingeführt (Anonym 2007a). In jedem Mitgliedsstaat war eine vorgegebene Anzahl an Tieren beider Gruppen zu untersuchen. Für Deutschland wurde die Stichprobengröße auf jeweils 598 Tiere festgelegt. Da die Untersuchungszahlen bis zum Ende der Jagdsaison 2007/2008 in zahlreichen Mitgliedsstaaten bei weitem nicht erfüllt werden konnten, wurde dieses Überwachungsprogramm bis Ende der Jagdsaison 2009/2010 verlängert.
Insgesamt wurden in 21 Mitgliedsstaaten nahezu 13.000 Proben untersucht (davon 1.877 in Deutschland) und es wurde kein Fall von CWD nachgewiesen (Anonym 2010a).
Das zoonotische Potential dieser TSE-Form wird als gering eingeschätzt. Dies ist zum einen darin begründet, dass bisher kein epidemiologischer Zusammenhang zwischen dem Verzehr von Fleisch CWD-kranker Zerviden und dem Auftreten von CJD-Erkrankungen beobachtet wurde. Intrazerebrale Übertragungsexperimente von Hirnmaterial CWD-kranker Zerviden auf human-PrP transgenen Mäuse führte darüber hinaus nicht zur Entwicklung der Erkrankung in diesen Tieren (Sandberg et al., 2010).
Transmissible Enzephalopathie der Nerze (Transmissible Mink Encephalopathy;
TME)
Mitte des vergangenen Jahrhunderts traten auch TSE-Fälle bei in Pelzfarmen gehaltenen Nerzen, vor allem in den USA, aber auch in Russland und anderen osteuropäischen Staaten auf (Hartsough & Burger, 1965; Marsh, 1976; Marsh et al., 1991; Dukur et al., 1986). Auch hier ist ein Zusammenhang zwischen der Verfütterung von TSE-kontaminiertem Fleisch und dem Auftreten von Krankheitsfällen erkennbar. Nachdem lange Zeit angenommen wurde, dass TME durch die Verfütterung von Scrapie-kontaminiertem Fleisch ausgelöst wurde, liegen nun Hinweise darauf vor, dass ein Zusammenhang zwischen TME und einer Form atypischer BSE (L-Typ) bestehen könnte, da die biologischen (Übertragbarkeit und Inkubationszeit in transgenen Mäusen) und biochemischen Eigenschaften dieser beiden TSE-Formen überzeugende Ähnlichkeit aufweisen
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(Baron et al., 2007). Dies bestätigt die Beobachtung, dass TME hauptsächlich in Pelzfarmen der USA auftrat, in denen das Fleisch und die Organe sogenannter
‚Downer Cows’ von Milchfarmen verfüttert wurde. Der Begriff ‚Downer Cow’
beschreibt Rinder, die aus den verschiedensten Gründen zum Festliegen kommen.
Eine TSE-Infektion wurde allerdings seinerzeit bei keinem der zur Fütterung von Nerzen verwendeten und untersuchten Tiere nachgewiesen (Marsh & Hartsough, 1988; Marsh & Hadlow, 1992).
1.6.2. TSE-Erkrankungen beim Menschen
Beim Menschen treten spontane, infektiöse und familiäre TSE-Formen auf. Etwa 80 % der humanen TSE-Fälle treten spontan, d.h. ohne erkennbaren Zusammenhang mit äußeren oder inneren Faktoren auf. Zu den infektiösen TSE- Formen gehört die Kuru, die iatrogen (also im Rahmen ärztlicher Behandlung) übertragenen Creutzfeldt-Jakob-Fälle sowie die mit dem BSE-Erreger im Zusammenhang stehende Variante der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit. Die familiären TSE-Formen sind schließlich auf Mutationen an bestimmten Positionen des Prion- Proteins zurückzuführen. Diese machen etwa 10 % der humanen TSE-Fälle aus.
Kuru
Diese Erkrankung ist hauptsächlich in den 1950er und 1960er Jahren bei den Fore-Indianern auf Papua-Neuguinea aufgetreten (Gajdusek & Zigas, 1957; Zigas, 1970) und wurde durch kannibalistische Totenkulte übertragen. Nachdem dieser Zusammenhang aufgedeckt und die Ausübung dieser Riten durch die australische Territorialverwaltung verboten wurde, kam es zu keinen Neuinfektionen. Ein Zusammenhang zwischen dieser Erkrankung und der Gruppe der transmissiblen spongiformen Enzephalopathien wurde beinahe zufällig schon im Jahr 1959 während einer Kuru-Ausstellung in London entdeckt, die von dem langjährigen Scrapie-Forscher W. Hadlow besucht wurde und dem die Ähnlichkeit dieser beiden Erkrankungen auffiel. Der bisher letzte Kuru-Patient erkrankte und verstarb nach einer jahrzehntelangen Inkubationszeit erst im Jahr 2004 (Collinge et al., 2006).
22 Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJK)
In den 1920er Jahren beschrieben die Ärzte Hans-Georg Creutzfeldt und Alfons Jakob die ersten Fälle der nach ihnen benannten Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (Creutzfeldt, 1920; Jakob, 1921). Neben den spontanen Fällen, die mit einer Inzidenz von etwa 1:1 000 000 auftreten, wurden weltweit bisher mehrere Hundert Fälle von iatrogener CJK beschrieben. Hauptursache für die Übertragung waren hierbei Dura-mater-Transplantationen von unerkannt CJK-kranken Spendern, sowie die Gabe von Wachstums- und Sexualhormonen, die aus Organen von CJK- erkrankten Verstorbenen gewonnen worden waren (Brown et al., 2006). Familiäre CJK-Fälle können beispielsweise bei Mutationen an den Positionen 102, 178 und 200 des Prion-Proteins auftreten (Kovacs et al., 2002).
Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom (GSS)
Die GSS-Fälle werden aus historischen Gründen von den familiären CJD-Fällen unterschieden, obwohl auch bei ihnen genetische Faktoren, d.h. Mutationen im Prion-Protein, ursächlich für ihre Genese sind. Besonders häufig ist hierbei die Position 102 betroffen (Wadsworth & Collinge, 2007). Klinisch sind CJK und GSS nicht sicher unterscheidbar.
Familiäre Schlaflosigkeit (Fatal Familial Insomnia; FFI)
Die FFI, die erst 1986 erstmals beschrieben wurde (Lugaresi et al., 1986) wurde zunächst nicht mit der Gruppe der TSEs in Zusammenhang gebracht. Erst einige Zeit später wurde erkannt, dass sie im Zusammenhang mit Mutationen im Prion- Protein an der Position 178 steht (Medori et al., 1992).
Variante Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (vCJK)
Zehn Jahre nach dem Auftreten der ersten BSE-Fälle im Vereinigten Königreich wurden erste Fälle einer bis dahin unbekannten Form der CJK beobachtet. Diese als vCJK benannte Erkrankung tritt meist in einem wesentlich früheren Lebensalter als die CJK auf und konnte durch biochemische Untersuchungen sowie Untersuchungen zur Stammdifferenzierung mittels Maus-Bioassay eindeutig mit dem BSE-Erreger in Verbindung gebracht werden. Bis Oktober 2010 sind im Vereinigten Königreich 171 vCJK-Fälle aufgetreten, weitere Fälle wurden in
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Frankreich, Irland, Italien, den Niederlanden, Portugal und Spanien, sowie den USA, Kanada, Japan und Saudi-Arabien beobachtet. Insgesamt wurden bisher weltweit 218 Fälle gemeldet (Anonym 2010b). Alle Patienten, bei denen es zur klinischen Ausprägung der Erkrankung kam, trugen das PrP-Allel, welches an Position 129 homozygot mit einem Methionin belegt ist. In Deutschland ist bis dato kein Fall von vCJK aufgetreten.
Protease-sensitive Prionopathien
In der jüngsten Vergangenheit wurden Fälle von TSE-Erkrankungen beim Menschen beschrieben, die sich in der klinischen Manifestation, in den histopathologischen und immunhistochemischen Befunden und in den biochemischen Eigenschaften des akkumulierten PrP von den bisher bekannten CJK-Formen unterscheiden. Diese Fälle waren ausnahmslos bei homozygoten Trägern der Aminosäure Valin an Position 129 des Prion-Proteins aufgetreten.
Aufgrund der verminderten Resistenz des PrP gegenüber Proteaseverdau wurden diese Erkrankungen zunächst als ‚Protease-sensitive Prionopathien’ (PSPr) bezeichnet (Gambetti et al., 2008). Kurze Zeit später wurden vergleichbare Fälle auch bei Trägern des Valin/Methionin hemizygoten PrP-Allels und des homozygoten Methionin-Allels auf Position 129 beobachtet, hierbei war die Protease-Resistenz des akkumulierten PrP etwas weniger reduziert als bei den zuvor beschriebenen Fällen. Die Bezeichnung dieser TSE-Form wurde daher auf
‚verschieden protease-sensitive Prionopathie’ (engl.: variably protease-sensitive Prionopathy) adaptiert (Zou et al., 2010). Das bei diesen Fällen im Westernblot erkennbare Bandenmuster zeigt Ähnlichkeit mit dem bei atypischer Scrapie beschriebenen Muster, allerdings beträgt die Molekularmasse der kleinsten Fraktion hier 7 kDa anstelle der bei atypischer Scrapie erkennbaren Proteinfraktion von 11 kDa. Ob ein Zusammenhang zwischen diesen TSE-Formen besteht, ist noch nicht bekannt. Die experimentelle Übertragbarkeit dieser Erkrankung wird ebenfalls zurzeit noch untersucht.
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1.7. Pathogenese der TSE-Erkrankungen bei Mensch und Tier
Bei der ‚natürlichen’ Infektion von Tieren mit TSE-Erregern wird im Allgemeinen von einer oralen Aufnahme ausgegangen. Nach Aufnahme in das lymphatische System des Darmes, insbesondere der Peyerschen Platten des distalen Ileums, können verschiedene Wege der Erregerverbreitung beschritten werden. Welchen Weg der Erreger nimmt, scheint hauptsächlich vom jeweiligen TSE-Stamm, jedoch auch vom betroffenen Wirt abzuhängen. Dazu seien hier einige Beispiele genannt.
Scrapie bei kleinen Wiederkäuern
Der Grad der Einbeziehung des lymphatischen Systems in die Erregerverbreitung hängt beim Schaf vom jeweiligen PrP-Genotyp ab. Bei hochempfänglichen Genotypen sind schon sehr früh in der Inkubationszeit PrPSc-Ablagerungen in den lymphatischen Organen und den peripheren Nerven nachweisbar (van Keulen et al., 1996; Andreoletti et al., 2000, Groschup et al., 1996), dagegen gelingt dieser Nachweis bei weniger empfänglichen Genotypen erst deutlich später. Bei einigen Genotypen (PrPVRQ/ARR und PrPARR/ARR) scheint das lymphatische System gar nicht in die Erregerverbreitung involviert zu sein (van Keulen et al., 2008b; Jeffrey et al., 2002). Anders verhält es sich bei der atypischen Scrapie, denn hier scheint das lymphatische System überhaupt nicht involviert zu sein (Benestad et al., 2003;
Mitteilung 4; Nentwig et al., 2007; Vidal et al., 2008).
BSE bei kleinen Wiederkäuern
Nach experimenteller oraler BSE-Infektion von Schafen erfolgt die Erregerverteilung ähnlich wie nach einer Scrapie-Infektion (Foster et al., 1996;
Bellworthy et al., 2005; van Keulen et al., 2008a). Dies bedeutet, dass theoretisch auch die Muskulatur von BSE-infizierten kleinen Wiederkäuern PrPSc und Infektiosität enthalten kann, bevor die Infektion durch Untersuchung des Hirnstamms mittels BSE-Schnelltest nachweisbar ist. Um die mögliche Verbreitung solcher Feldinfektionen von kleinen Wiederkäuern mit dem BSE-Erreger zu erfassen und mögliche Fälle aus der Nahrungskette zu entfernen, wurde 2005 ein EU-weites Überwachungsprogramm initiiert, welches eine molekulare Typisierung aller TSE-Fälle bei kleinen Wiederkäuern vorschreibt (Anonym 2005a). Obwohl
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seit Einführung dieser Untersuchung EU-weit mehr als 3000 Proben untersucht wurden, wurde bisher eine solche Feldinfektion mit dem BSE-Erreger nur bei einer Ziege in Frankreich nachgewiesen (Eloit, 2005). Eine weiterer TSE-Fall bei einer Ziege in Schottland gab in der histologischen Untersuchung Hinweise auf das Vorliegen einer BSE-Infektion (Jeffrey et al., 2006).
BSE beim Rind
Bei BSE-infizierten Rindern scheint der Erreger ausschließlich nervale Verbreitungswege zu nutzen, während das lymphatische System offensichtlich nicht involviert ist. Die BSE-Pathogenese verläuft damit grundlegend anders als die TSE-Pathogenese beim Schaf. Der einzige Nachweis von PrPSc im lymphatischen System des Rindes gelang bisher in den Peyerschen Platten des distalen Ileums (Wells et al., 1998; Terry et al., 2003; Mittelung 2) und in den Tonsillen von experimentell oral infizierten Rindern (Wells et al, 2005). Alle anderen Untersuchungen der Milz und der Körperlymphknoten auf PrPSc- Ablagerungen sowie auf das Vorhandensein von Infektiosität verliefen mit negativen Ergebnissen (Wells, 2003; Mitteilung 2; van Keulen et al., 2008b).
Nähere eigene Untersuchungen dazu werden im Kapitel 3.2. beschrieben.
Zur Pathogenese der beiden atypischen BSE-Formen H-Typ und L-Typ BSE ist bisher wenig veröffentlicht. Nach einer intrazerebralen Infektion von Rindern mit L- Typ BSE wurde PrPSc und Infektiosität bei Tieren im klinischen Stadium der Erkrankung in verschiedenen peripheren Nerven nachgewiesen. Diese Untersuchungen verliefen bei Geweben des lymphatischen Systems dagegen negativ (Iwamaru et al., 2010). Eigene Untersuchungen hierzu werden im Kapitel 3.4. dargestellt.
26 2. Eigene Arbeiten
2.1. Grundlagen der durchgeführten Untersuchungen
Im Rahmen der hier besprochenen Arbeiten wurden biochemische und tierexperimentelle Untersuchungen der bis heute bekannten BSE- und Scrapieformen (klassisch und atypisch) durchgeführt. Dazu wurden transgene Mäuse entwickelt und charakterisiert, die das Prion-Protein des Rindes bzw. des Schafes tragen. Infektionsversuche an solchen hochsensitiven Mäusen ermöglichen Aussagen über den Erregergehalt in verschiedenen Geweben sowie über die Höhe von Speziesbarrieren. Des Weiteren wurde am Friedrich-Loeffler- Institut ein oraler BSE-Infektionsversuch mit Rindern durchgeführt, in dessen Verlauf zu definierten Zeitpunkten nach der Infektion Tiere getötet und seziert wurden, so dass Proben von allen relevanten Organsystemen und Körperflüssigkeiten zur Verfügung stehen. Auch eine intrazerebrale Infektion von Rindern mit beiden atypischen BSE-Formen wurde durchgeführt und auch hier wurden alle Tiere bzw. Tierkörper unter TSE-sterilen Bedingungen beprobt. Die biochemischen, histologischen und immunhistochemischen Untersuchung dieser Proben sowie die Durchführung von Maus-Bioassays in den oben erwähnten transgenen Mäusen ergab Aufschlüsse über die Erregerverteilung und die BSE- Pathogenese in BSE-infizierten Rindern (klassische und atypische BSE). Darüber hinaus wurden atypische BSE-Isolate in transgene und nicht-transgene Mäuse sowie Hamster inokuliert, um Erkenntnisse über die Stabilität dieser BSE-Formen zu gewinnen.
Eine weitere Untersuchungsreihe beschäftigte sich schließlich mit der Tenazität der TSE-Erreger im Boden. Hierzu wurde exemplarisch der Hamster-adaptierte Scrapiestamm 263K verwendet.
