Einfluss von Muttermilch und Samenflüssigkeit auf die Hepatitis-C-Virus-Stabilität und -Infektiosität

einer gemeinsamen Einrichtung der Medizinischen Hochschule Hannover und des Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung Braunschweig, angefertigt im Rahmen der strukturierten Doktorandenausbildung StrucMed

Einfluss von Muttermilch und Samenflüssigkeit auf die Hepatitis-C-Virus -Stabilität und -Infektiosität

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von Julia Mareike Heyden

aus Celle

Hannover 2010

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 08.10.2013 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover

Präsident: Prof. Dr. med. Christopher Baum Betreuer: Prof. Dr. rer. nat. Thomas Pietschmann

PD Dr. rer. nat. Eike Steinmann Kobetreuer: PD Dr. med. Sandra Ciesek

Referent: Prof. Dr. med. Hans-Heinrich Wedemeyer Korreferent: Prof. Dr. rer. nat. Stefan Pöhlmann

Tag der mündlichen Prüfung: 08.10.2013

Prüfungsausschussmitglieder: Prof. Dr. med. Hans-Heinrich Kreipe Prof. Dr. med. Sebastian Suerbaum

Prof. Dr. med. Manfred Stuhrmann- Spangenberg

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung

1.1 Hepatitis C - Überblick ... 5

1.2 Diagnostik, Krankheitsverlauf und Therapie ... 7

1.3 HCV –Molekularbiologie ... 9

1.4 HCV-Modellsysteme ... 13

1.5 HCV in Verbindung mit Körperflüssigkeiten ... 14

1.5.1 Muttermilch ... 14

1.5.2 Samenflüssigkeit und Epigallocatechingallat ... 17

1.6 Themenstellung und Ziel der Arbeit ... 19

2. Materialien und Methoden

2.1 Materialien ... 20

2.1.1 Zellen ... 20

2.1.2 Medien ... 20

2.1.3 Antikörper ... 20

2.1.4 Plasmide ... 21

2.1.5 Puffer und Lösungen ... 22

2.1.6 Muttermilchproben ... 22

2.1.7 Spermaproben ... 23

2.1.8 SEVI ... 23

2.1.9 EGCG, EGC, ECG, EC ... 23

2.1.10 Lactoferrin ... 23

2.2 Methoden ... 23

2.2.1 Transformation von Bakterien ... 23

2.2.2 Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterienkulturen ... 24

2.2.3 In-vitro-Transkription ... 24

2.2.4 Auftrennung von DNA und RNA mittels Agarose-Gelelektrophorese ... 25

2.2.5 Konzentrationsmessung von Nukleinsäuren ... 25

2.2.6 Kultivierung von Säugerzelllinien ... 26

2.2.7 Kryokonservierung von Zellen ... 26

2.2.8 Bestimmung der Zelldichte ... 26

2.2.9 RNA-Transfektion ... 26

2.2.10 DNA-Transfektion mit Lipofectamin ... 27

2.2.11 Generierung von HCV-Pseudopartikeln ... 27

2.2.12 Immunfluoreszenz (IF)-Analyse ... 27

2.2.13 „Firefly“-Luziferase-Aktivitätsbestimmung ... 28

2.2.14 Histochemie und Virustitration (TCID₅₀) ... 28

2.2.15 Dichtegradient ... 29

3. Ergebnisse

3.1 Untersuchung des Einflusses von Muttermilch und seiner Komponenten auf die Stabilität und Infektiosität von HCV ... 30

3.1.1 Testung des Einflusses von Muttermilch auf Huh-7.5-Zellen ... 30

3.1.2 Überprüfung der Stabilität von HCV in Gegenwart von Muttermilch zu unterschiedlichen Zeitpunkten ... 33

3.1.3 Vergleich der Effekte von Muttermilch zu Milchproben anderer Spezies ... 35

3.1.4 Einfluss vorverdünnter Muttermilch auf HCVcc Infektiosität ... 37

3.1.5 Verhalten von Muttermilch bei unterschiedlich langer Vorinkubation in An- und Abwesenheit von HCVcc ... 39

3.1.6 Einfluss von verschiedenen Temperaturen und Schütteln auf Muttermilch und ihre Wirkung auf die HCV-Infektiosität ... 42

3.1.7 Lactoferrin ... 45

3.1.7.1 Einfluss von Lactoferrin auf die HCVpp-Infektiosität ... 47

3.1.8 LL37 und CRAMP ... 49

3.2 Erforschung des Einflusses von Samenflüssigkeit, seiner Komponenten und EGCG auf die Stabilität und Infektiosität von HCV ... 51

3.2.1 Einfluss von Sperma auf HCV ... 51

3.2.1.1 Stabilität von HCVcc in Anwesenheit von Sperma ... 51

3.2.1.2 Langzeitstabilität von HCV in Anwesenheit von Sperma ... 53

3.2.2 Auswirkung von SEVI auf die HCVcc-Infektiosität ... 54

3.2.3 Hepatitis-C-Virus und EGCG ... 57

3.2.3.1 Einfluss von EGCG auf die HCV-Replikation ... 57

3.2.3.2 Einfluss von EGCG und seinen Derivaten auf die HCVcc-Infektiosität ... 59

3.2.3.3 Einfluss von EGCG auf die HCVpp-Infektiosität ... 61

4. Diskussion

4.1 Untersuchung des Einflusses von Muttermilch und ihrer Komponenten auf die Stabilität und Infektiosität von HCV ... 63

4.1.1 Lactoferrin, LL37 und CRAMP ... 67

4.2 Erforschung des Einflusses von Samenflüssigkeit, seiner Komponenten und EGCG auf die Stabilität und Infektiosität von HCV ... 69

4.2.1 Einfluss von SEVI und EGCG ... 70

4.3 Ausblick ... 73

5. Zusammenfassung

6. Literaturverzeichnis

7. Anhang

7.1 Verzeichnisse ... 90

7.1.1 Abkürzungen ... 90

7.1.2 Abbildungen ... 93

7.1.3 Tabellen ... 94

7.2 Curriculum vitae ... 95

7.3 Danksagung ... 96

7.4 Eidesstattliche Versicherung nach § 2 Abs. 2 Nrn. 5 und 6 ... 97

nachgewiesen worden [10-13]. Weiterhin konnte von Alltagsgebrauchsgegenständen die zur Körperhygiene genutzt werden, wie zum Beispiel Zahnbürsten und Rasierklingen, HCV-RNA isoliert werden [14]. Ein dadurch erhöhtes Infektionsrisiko kann bislang nicht belegt werden [15]. So konnten Ciesek et al. kürzlich bestätigen, dass der Nachweis von HCV-RNA auf verschiedenen Oberflächen nicht mit der Infektiosität korreliert [8]. Hingegen konnte Geschlechtsverkehr mit Hepatitis C Virusträgern in mehreren Studien als Risikofaktor für eine Infektion festgestellt werden. Dennoch ist das Ansteckungsrisiko in monogamen Partnerschaften mit <1% sehr gering im Vergleich zu anderen Viren [16-21].

Die Übertragung durch Blutprodukte konnte nach Einführung diagnostischer Tests zum Nachweis von HCV-RNA im Jahre 1990/1991 entscheidend auf ca. 0,004 bis 0,0004% pro transfundierte Einheit reduziert werden [2]. Allerdings wird noch immer aufgrund von Hygienemängeln von Zwischenfällen zum Beispiel bei Hämodialyse- und Koloskopiepatienten berichtet. Auch die Infektionsausbreitung unter Patienten, insbesondere durch die mehrmalige Nutzung von Infusionen und intravenös verabreichten Medikamenten, wird beschrieben [22-26]. Weiterhin besteht im Rahmen der nosokomialen Infektion für medizinisches Personal die Gefahr der Nadelstichverletzung an mit HCV kontaminierten Kanülen. Das Risiko, daraufhin eine HCV-Infektion zu entwickeln, beläuft sich im Durchschnitt auf weniger als 1% und in Europa lediglich auf ca. 0,4% [27]. Am bedeutsamsten für die HCV-(Neu-) Infektion ist der intravenöse Drogengebrauch. Bedingt durch den Usus, das Spritzenbesteck mit anderen Konsumenten zu teilen, werden wahrscheinlich die meisten Neuinfektionen auf diese Weise verursacht [28]. In bis zu 30%

aller Fälle gibt es allerdings keinen eindeutigen Hinweis auf den Transmissionsweg [29].

Einen zusammenfassenden Überblick der diversen Ursachen der vor 1990 bzw. nach 1995 erworbenen HCV-Infektion gibt Abbildung 2 wieder.

chronischen Verlaufsform besteht in der Entwicklung einer Leberzirrhose einerseits und eines sich oft daraufhin entwickelnden hepatozellulären Karzinoms (HCC) andererseits. Weltweit sind 27% der Leberzirrhosen und 25% der hepatozellulären Karzinome auf eine ursprüngliche HCV-Infektion zurückzuführen [36]. So ist bei 2 bis 35% der Patienten im Krankheitsverlauf von 20 bis 25 Jahren mit einer Leberzirrhose zu rechnen [33, 37]. Bei denen an einer Leberzirrhose im Stadium Child A Erkrankten wiederum, beträgt die jährliche Inzidenz für ein HCC 4% [15]. Darüber hinaus werden mannigfaltige extrahepatische Manifestationen beschrieben. Für den Verlauf der chronischen Hepatitis C sind des Weiteren zahlreiche prognostisch ungünstige Faktoren wie Alter des Patienten, chronischer Alkoholkonsum, virale Koinfektionen und chronische Hämodialyse identifiziert worden [37-44].

Die Diagnostik der Hepatitis-C-Infektion beruht eingangs auf der biochemischen Überprüfung von Leberfunktionsparametern wie der Alanin-Aminotransferase (ALT), der Aspartat- Aminotransferase (AST), der Prothrombin-Zeit sowie u.a. der Albumin- und Globulin-Werte [2]. Befinden sich diese Werte außerhalb der Norm, so sind weiterführende Untersuchungen indiziert. Mittels eines Anti-HCV-Antikörpertests (ELISA) kann eine Infektion bestätigt werden. Allerdings werden Antikörper (Ak) nicht selten erst in der Zeit von sieben bis acht Wochen nach der Primärinfektion nachweisbar. Es empfiehlt sich daher, insbesondere zum Nachweis einer akuten HCV-Infektion, einen Test zum Nachweis von HCV-RNA beim Patienten durchzuführen. Eine Lebersonographie und –biopsie, die Bestimmung der Viruslast und des Genotypus‘, komplettieren schließlich das diagnostische Prozedere.

Bisher gelang es nicht einen Impfstoff gegen die HCV-Infektion herzustellen. Das ist der Grund dafür, dass man abgesehen von generellen hygienischen Maßnahmen zur Prävention, nur zum Zeitpunkt einer schon bestehenden Erkrankung intervenieren kann.

Ziel einer Therapie der akuten Hepatitis C ist es, möglichst frühzeitig in den Krankheitsprozess einzugreifen, um Chronifizierungen, und die damit verbundene Entwicklung einer Leberzirrhose und eines HCC, zu vermeiden. Es gilt dennoch zu beachten, dass bei zu frühem Therapiebeginn auch solche Patienten mit behandelt werden, bei denen die Infektion ansonsten spontan ausgeheilt wäre. Vorgeschlagen wird in diesem Stadium eine 24- wöchige Therapie mit Interferon alpha (IFN-α) oder pegyliertem Interferon alpha (PEG-IFN- α) [15].

Im chronischen Stadium der Krankheit wird die Therapie mit PEG-IFN-α durch das Guanosinanalogon Ribavirin ergänzt. Hierbei stehen die Vermeidung der oben genannten Folgen der Chronifizierung und die Viruselimination im Vordergrund [15].

Der Therapieerfolg wird schließlich durch die Normalisierung der Leberparameter, die Elimination der HCV-RNA im Blut und eine eventuelle Verbesserung der histologischen Befunde dokumentiert [15].

Die Therapie mit den diversen Medikamenten führt allerdings bei vielen Patienten zu starken Nebenwirkungen. Auch in der Wirksamkeit gibt es Unterschiede. So liegt die Ansprechrate bei den mit Genotyp-2- und -3-Infizierten bei ca. 80%, bei den mit Genotyp-1-Infizierten hingegen nur bei rund 50% [45-48].

1.3 HCV –Molekularbiologie

Das Hepatitis-C-Virus wird der Familie der Flaviviridae zugeordnet und ist innerhalb dieser das einzige Mitglied im Genus Hepacivirus [6]. Die HCV Isolate werden in sieben Genotypen eingeteilt (1-7), bei denen wiederum verschiedene Subtypen unterschieden werden (a,b,c usw.) [49-50]. Weltweit herrschen verschiedene Prädominanzen der Genotypen vor (zum Beispiel Genotyp 1 in den USA und Europa). Die Divergenz in ihrer Nukleotidsequenz beträgt bei den Genotypen ca. 30% und bei den Subtypen ungefähr 20% [51-52]. Die fehlende Korrekturlese-Aktivität der RNA-abhängigen RNA-Polymerase führt zu den genannten Unterschieden und ist letztlich der Grund dafür, dass ständig neue Virus-Mutanten entstehen können. Die zahlreich entstehenden Quasispezies, das heißt die gleichzeitige Existenz mehrerer Varianten des ursprünglichen Virus‘ in demselben Wirtsorganismus, ermöglichen es dem Virus langfristig sowohl der humoralen als auch der zellulären Immunantwort des Wirtsorganismus‘ zu entgehen.

Das HCV-Genom, bestehend aus einer ca. 9600 Nukleotide langen einzelsträngigen RNA positiver Polarität, kodiert für ein sich aus etwa 3000 Aminosäuren zusammensetzendes Polyprotein. Es wird von einem Kapsid (engl. core) umgeben, welches aus mehreren Core- Proteinen aufgebaut ist. Wie in Abbildung 3 dargestellt, kodiert das Genom am 5‘-Ende für eine nicht-translatierte-Region (5‘-NTR), welche zugleich eine interne Ribosomen Bindestelle (IRES) beinhaltet, gefolgt von einem offenen Leserahmen (ORF), der für die Struktur- ebenso wie die Nichtstrukturproteine kodiert, und eine NTR am 3‘-Ende (3‘-NTR). Auf die Spaltung

des Polyproteins hin entstehen die Strukturproteine, zu denen das Kapsid und die beiden Hüllproteine E1 und E2 gezählt werden. Diese bilden in ihrer Gesamtheit das Viruspartikel.

Das RNA-Genom wird schließlich in neue Viruspartikel verpackt. Außerdem entstehen die Nichtstrukturproteine (NS). Dazu zählen die Protease NS2 sowie die zum Replikationskomplex gehörenden NS3, NS4A/B und NS5A/B. Dabei spalten zelluläre Signalpeptidasen die Hüllglykoproteine und das p7-Protein sowie zusätzliche Signalpeptidpeptidasen das Core-Protein. Virale Proteasen (NS2-4A) hingegen spalten die Nichtstrukturproteine.

Die Protease NS3 und ihr für die Bindung an das endoplasmatische Retikulum (ER) wichtiger Kofaktor, NS4A, sind für die Genomreplikation essentiell. Das NS4B-Protein nimmt eine führende Rolle bei der Induktion der Replikation am Membran-assoziierterten Replikationskomplex („mebranous web“) ein [53]. Für die Assemblierung und/oder Freisetzung der HCV-Partikel scheinen NS5A und NS2 benötigt zu werden. Entscheidend für die Replikation ist darüber hinaus NS5B, welches als RNA-Polymerase fungiert. Das Protein p7 ist zwischen den Struktur- und den Nichtstruktur-Proteinen lokalisiert und scheint als Ionenkanal zu agieren, der bei der Partikel-Assemblierung und -Freisetzung eine wichtige Rolle spielt [54].Eine genauere Funktionsweise des Ionenkanals sowie der NS2- und NS5A- Proteine konnte allerdings noch nicht beschrieben werden.

Abbildung 3: Organisation und Prozessierung des HCV-Genoms. Das Genom wird sowohl am 5‘- als auch am 3‘-Ende von einer NTR flankiert. Dazwischen befindet sich der für die Struktur (C, E1, E2)- und die Nichtstruktur (N2-NS5B)-Proteine kodierende offene Leserahmen sowie der Ionenkanal p7. Nach der Translation und Prozessierung entstehen die Strukturproteine, die das Viruspartikel bilden und die Nichtstrukturproteine NS3-NS5B, die den Replikationskomplex bilden. Ein weiteres Nichtstrukturprotein, NS2, fungiert als Protease. (adaptiert nach Prof.T.Pietschmann, unveröffentlicht)

Der Hepatitis-C-Virus-Zelleintritt ist ein mehrschrittiger Prozess, welcher von der Interaktion der viralen Oberflächenglykoproteine E1 und E2 und multiplen Wirtszellfaktoren abhängt (vgl. Abbildung 4A). Hierbei interagiert das Virus zunächst mit sogenannten Anheftungsfaktoren, zu denen verschiedene Glykosaminoglykane und der Lipoproteinrezeptor niedriger Dichte (LDL-R) gezählt werden [55-57]. So sind der Scavenger Rezeptor Klasse B Typ1 (SR-B1) und das Tetraspanin CD81 in der frühen Phase des Zelleintritts unentbehrlich [58-59]. Bevor das Virus mittels Clathrin-abhängiger Endozytose schließlich in die Zelle aufgenommen wird [60], spielen die „tight-junction“-Proteine Claudin-1 (CLDN1) und Occludin (OCLN1) eine entscheidende Rolle [61-62]. Es konnte festgestellt werden, dass der Eintritt in die Zelle nur stattfindet, wenn alle vier Faktoren (SR- B1, CD81, CLDN1, OCLN1) anwesend sind [62].

Nach der Freisetzung der viralen RNA ins Zytoplasma, erfolgt die Replikation des genetischen Materials (vgl. Abbildung 4B). Dies geschieht an Membran-assoziierten

Replikationskomplexen („membranous webs“), die aus replizierender RNA, viralen Proteinen (NS3-NS5B) und zellulären Membrankomponenten bestehen [53, 63]. Sie befinden sich am rauen endoplasmatischen Retikulum (rER), wo die RNA-Translation initial von der HCV-IRES gesteuert wird. Vermutlich wird die Formierung der Viruspartikel von einer Interaktion des Core-Proteins mit zusätzlichen viralen Proteinen und genomischer RNA induziert [64-65]. Es wird darüber hinaus angenommen, dass die Knospung des Virions in das ER-Lumen hinein stattfindet [66], wo es auch seine Hülle mit den eingelagerten Glykoproteinen E1 und E2 erhält. Da allerdings intrazelluläre Viruspartikel eine andere Dichte aufweisen als extrazelluläre Partikel, wird vermutet, dass die HCV-Partikel während des Zellaustritts einen Reifeprozess durchlaufen, bei dem diese mit Lipoproteinen assoziieren [67-68], bevor sie schließlich über den sekretorischen Weg in den extrazellulären Raum entlassen werden.

A B

Abbildung 4: Modell des HCV-Zelleintritts (A) und des -Replikationszyklus‘ (B). A: Das Virus bindet zunächst an den LDL-Rezeptor. Danach wandert der Virus-Rezeptor-Komplex entlang der Zelloberfläche von der basolateralen Seite, wo es auf SR-B1 und CD81 trifft, zum „tight-junction“ Bereich. Dort befinden sich die Proteine Claudin-1 (CLDN1) und Occludin (OCLN1). Alle vier Rezeptoren sind für den Zelleintritt notwendig.

B: Das Virus wird über Rezeptor-vermittelte Endozytose aufgenommen. Nach der Freisetzung der viralen RNA ins Zytosol wird die Translation von der IRES am rER eingeleitet. Die Replikation findet an Membran- assoziierten Replikationskomplexen („membranous webs“) statt. Die Knospung des HCV-Partikels erfolgt vermutlich direkt in das ER-Lumen hinein, bevor die reifen Partikel über den sekretorischen Weg in den extrazellulären Raum freigesetzt werden. (nach [69])

1.4 HCV-Modellsysteme

Der Schimpanse ist bis dato das einzige in-vivo-Tiermodell, welches es zulässt, die Gesamtheit aller Faktoren, sowie die Pathogenese einer HCV-Infektion beim Menschen, zu untersuchen. Denn bisher ist nur dieses Tier für eine HCV-Infektion sowie dessen gesamten Lebenszyklus permissiv. Da der Schimpanse als Versuchstier ethisch umstritten ist, wird an der Entwicklung von Kleintiermodellen gearbeitet. So konnte zuletzt 2001 von Mercer et al.

die uPA-SCID Maus entwickelt werden, bei der humanes Lebergewebe implantiert wurde [70]. Auf Grund des fehlenden Immunsystems der Mäuse kann mit Hilfe dieses Kleintiermodells nicht das komplette Erscheinungsbild einer HCV-Infektion reproduziert werden. Zudem ist die Arbeit mit diesem Modell technisch höchst anspruchsvoll.

Nicht zuletzt auf Grund des Mangels an einem kompetenten in-vivo- als auch in-vitro-Modell gestaltete sich die Erforschung des Hepatitis-C-Virus‘ lange Zeit als äußerst unbefriedigend.

So tasteten sich die Forscher langsam an mögliche Methoden zur näheren Beleuchtung des HCV-Replikationszyklus‘ heran. Ein erster Meilenstein war die Etablierung eines autonom replizierenden subgenomischen Replikons aus dem HCV-Isolat Con1 (Genotyp 1b), die 1999 erstmals Lohmann et al. gelang [71]. Bei diesem System werden die Replikationskomplexe von den Nichtstrukturproteinen gebildet und die RNA-Replikation kann folglich untersucht werden. Nach der Identifizierung Zellkultur-adaptiver Mutationen in den Nichtstrukturproteinen und durch die Auswahl hoch permissiver Zellen wurde das Niveau der RNA-Replikation optimiert [72]. Die Entfernung des Replikons aus einer Zelllinie, durch die Therapie mit Interferon oder HCV-Inhibitoren, führte schließlich zu Zellklonen wie den humanen Hepatomazellen Huh-7.5, die eine noch effizientere RNA-Replikation ermöglichen [73]. Da die Strukturproteine fehlen, erfolgt keine Freisetzung von infektiösen HCV- Partikeln.

Einen nächsten wichtigen Schritt stellte die Entwicklung von retroviralen HCV- Pseudopartikeln (HCVpp), die die Hüllproteine E1 und E2 auf ihrer Oberfläche exprimieren [74-76], dar. Diese lassen die Erforschung der frühen Phase der HCV-Infektion und insbesondere des Viruszelleintritts zu, da dieser von den Hüllproteinen vermittelt wird. Der Einfluss von Lipoproteinen auf den Zelleintritt kann hingegen nicht mit diesem System analysiert werden, da die HCVpp nicht mit ihnen assoziiert sind. Produziert werden HCVpp durch Kotransfekion von 293T-Zellen, welche Expressionsvektoren enthalten, die für gag- pol-Proteine eines Lentivirus‘ kodieren.

Die Entdeckung eines HCV Stammes, der in Zellkultur Viren produzieren kann, war schließlich der entscheidende Durchbruch hinsichtlich der Erforschung der HCV- Pathogenese. Es war der Stamm JFH1 („japanese fulminant hepatitis 1“), der die erstmalige Kultivierung von sowohl in vivo als auch in vitro infektiösen HCV-Partikeln (HCVcell culture (HCVcc)) des Genotyps 2a zuließ [77-79]. Eine Effizienzsteigerung des Zusammenbaus und der Freisetzung von Viruspartikeln konnte von Pietschmann et al. durch die Herstellung der Chimäre Jc1 (Japanese Chimera 1) aus JFH1 und dem Virusisolat J6CF (Genotyp 2a) erzielt werden [80]. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass die in vitro produzierten HCV-Partikel sowohl im Schimpansen als auch in der uPA-SCID-Maus zu einer Infektion führen [77, 79].

Die durch Reisolation gewonnen Viren wiederum, erwiesen sich in Zellkultur als infektiös. So konnte das Verhalten von in vivo produzierten HCV-Partikeln erstmals erforscht werden.

Zur Quantifizierung einer durch HCVpp oder HCVcc erfolgten Infektion der Wirtszelle stehen, gegenüber den Wildtyp-Viren, Reporterviren zur Verfügung. Geeignete Reporter sind unter anderem das GFP (grün-fluoreszierendes Protein) und die „Firefly“-Luziferase [81-84].

Die Untersuchung der HCVcc-Partikel auf ihre Infektiosität und ihren Virustiter hin, ist mittels der TCID₅₀ (tissue culture infectious dose 50), der Luziferaseaktivität und der zusätzlich abschätzenden Immunfluoreszenz (IF)-Analyse möglich.

1.5 HCV in Verbindung mit Körperflüssigkeiten

1.5.1 Muttermilch

Humane Muttermilch ist in Zeiten der künstlich hergestellten Mutterersatzmilch nicht lebensnotwendig, aber dennoch essentiell für den Säugling. Auf Grund ihres Reichtums an Nährwerten, Vitaminen, Antioxidantien und mütterlichen Antikörpern, bietet sie dem Baby einen besonderen Schutz in den ersten Lebensmonaten. Auch im Vergleich zur Milch anderer Tiere, wie zum Beispiel der Stute, scheint die menschliche Muttermilch besonders viele Vitamine zu enthalten. Parallelen können hingegen zu der Kuhmilch gezogen werden, da hier hinsichtlich der Mineralstoffe und Vitamine keine signifikanten Unterschiede bestehen (vgl.

Abbildung 5).

Inhaltsstoffe/100ml Einheit Muttermilch Mutterersatz

milch¹ Kuhmilch Stutenmilch

Wasser g 87,5 90 87,2 89,7

Proteine g 1,31 1,24 3,3 2,2

Lipide g 4,03 3,6 3,8 1,5

Kohlenhydrate g 7 7,4 4,7 6,2

Mineralstoffe

Natrium mg 13 17 45 -

Kalium mg 47 68 141 64

Magnesium mg 3 5,7 12 9

Calcium mg 32 43 120 110

Phosphor mg 15 24 92 54

Eisen µg 58 67 59 65

Kupfer µg 72 0,05 7 30

Jod µg 6,3 14 6,1 -

Vitamine

Vitamin A µg 69 68 28 12

Thiamin B1 µg 15 8 37 30

Riboflavin B2 µg 38 14 180 30

Vitamin B6 µg 14 5 36 30

Vitamin B12 µg 0,05 24 0,41 0,3

Vitamin C mg 4,4 9,5 1,7 15

Vitamin D µg 0,07 0,93 0,17 -

Biotin µg 0,6 1,5 3,5 -

Folsäure µg 8,5 9,5 6,4 -

Niacin µg 170 59 90 140

Tabelle 1: Inhaltsstoffe von Muttermilch, Mutterersatzmilch(¹Pre Anfangsmilch; Milasan), Kuhmilch und Stutenmilch (nach Forschungsinstitut für Kinderernährung Dortmund und [7])

Es kann noch immer nicht mit Sicherheit gesagt werden, welches Risiko von einer HCV- infizierten stillenden Mutter ausgeht. Eine Studie ergab allerdings, dass sich die Infektionsraten der gestillten (8,3%) und der nicht-gestillten (9,5%) Säuglinge nicht signifikant voneinander unterschieden [85].Eine weitere Studie konnte nachweisen, dass eine Übertragung des Hepatitis-C-Virus‘ durch das Stillen bei asymptomatischen Patientinnen nicht erfolgte. Symptomatisch Infizierte hingegen, insbesondere solche mit einer hohen Viruslast, schienen in einigen Fällen das Virus auf ihr Kind übertragen zu haben [86]. Weit größer scheint im Vergleich dazu das Risiko einer durch das Stillen bedingten Weitergabe des

humanen-Immundefizienz-Virus‘ (HIV) zu sein. Literaturangaben zu Folge sind 40% der Fälle einer vertikalen Transmission von HIV-1 auf das Stillen zurückzuführen [87-88]. Trotz des Nachweises von HCV-RNA in Muttermilch wurden jedoch bislang keine Versuche dokumentiert, in denen in einem authentischen Rahmen die Stabilität oder Infektiosität des Virus‘ und die daraus resultierende potentielle Übertragbarkeit von HCV durch Muttermilch untersucht wurde.

Bisher ist die Datenlage zu der eventuellen Infektiosität von Muttermilch kontrovers. Den oben beschriebenen Studien zu Folge scheint aber kein immenses Risiko der Infektionsübertragung von dieser Körperflüssigkeit auszugehen. Ziel der Forschung ist es daher, mögliche antiviral wirksame Komponenten der Muttermilch zu identifizieren. So konnten dem Cathelicidin LL37, welches natürlicherweise in humaner Muttermilch enthalten ist, sowie seinem murinen Homolog CRAMP, zumindest diverse antimikrobielle Wirkungsweisen nachgewiesen werden [89-91]. Dieses Cathelicidin zählt zu dem Gen

„Cathelicidin antimicrobial peptide“ (CAMP). Über einen potentiellen antiviralen Effekt von LL37 ist allerdings bis dato nichts bekannt. Ein anderer denkbarer Faktor mit antiviraler Aktivität ist humanes Lactoferrin (hLf). Dieses der Familie der Transferrine angehörende Glykoprotein, ist wie LL37 ein natürlicher Bestandteil der Muttermilch. Es fungiert zum einen als Protease und zum anderen als Eisen bindendes Protein [92]. Die natürliche Konzentration von Lf in Muttermilch beträgt ca. 1 mg/ml und ca. 4 mg/ml im Kolostrum bzw.

ca. 0,1-0,4 mg/ml in Rindermilch [93-94]. Lactoferrin werden antibakterielle, antimykotische, antivirale, antiparasitäre, antiinflammatorische und antikanzerogene Wirkungen zugesprochen [92, 95-96]. Weiterhin soll Lf ein potenter Inhibitor von einigen nicht- beziehungsweise umhüllten Viren wie z.B. Rotaviren, Enteroviren und Adenoviren sein [96]. Eine Studie konnte belegen, dass Lf auf der Stufe der Virusfusion oder des Viruseintritts die HIV-1- Replikation teilweise inhibieren kann [97].

Ikeda et al. zeigten bereits 1998, dass bovines Lactoferrin (bLf) direkt mit dem Hepatitis-C- Virus interagiert und somit den Viruseintritt in die Zelle verhindert [98-99]. Sie kamen zu dem Ergebnis, dass das Virus durch Vorinkubation mit bLf (0,5 mg/ml) neutralisiert wird und damit eine protektive Wirkung gegenüber einer Infektion von humanen PH5CH8- Hepatozyten ausübt. Weiterhin wurde der Effekt von Kamel-Lactoferrin (cLf) auf die Infektiosität von HCV untersucht [100]. Auch hier stellten die Wissenschaftler fest, dass die Vorinkubation mit cLf (1 mg/ml) einen inhibitorischen Einfluss sowohl auf den Viruseintritt in die mononuklearen Zellen des peripheren Blutes (PBMC) als auch der HepG2-Leberzellen bewirkt. Darüber hinaus demonstrierten El-Fakharany et al. mittels einer Polymerase-Ketten-

Reaktion (RT-PCR), dass cLf in einer Konzentration von 1mg/ml die Replikation des Virus‘

in bereits infizierten PBMCs und HepG2-Zellen verhindern kann. Des Weiteren bindet bLf und hLf in vitro wahrscheinlich an das Hüllprotein E1, vor allem aber an das E2-Protein [101]. Dabei konnten bei der wissenschaftlichen Arbeit mit PH5CH8-Hepatozyten 33 Aminosäuren-Abkömmlinge des hLf identifiziert werden, die die spezifische Bindung an das E2-Hüllprotein bewirken [102]. Folglich kommt es zu einer Verhinderung der Infektion mit dem Virus. Vermutlich besitzt Lf darüber hinaus die Fähigkeit, die Infektiosität von HCV- und Vesikular-Stomatits-Virus (VSV) –Pseudopartikeln, die die HCV-Hüllproteine auf ihrer Oberfläche tragen, in humanen HepG2- und PH5CH8-Leberzellen dosisabhängig zu verringern [83, 103-104]. Insbesondere aber das E2-Protein scheint eine zentrale Rolle bei der inhibitorischen Aktivität des Lf einzunehmen.

Über die Effizienz einer Therapie mit bLf bei chronisch HCV-Infizierten sind bisher kontroverse Studien veröffentlicht worden. In klinischen Pilotstudien konnten auf der einen Seite einige positive Ergebnisse bei chronischen HCV-Patienten verzeichnet werden [105- 108]. Auf der anderen Seite erwies sich die Mono- beziehungsweise ergänzende Applikation von bLf in weiteren klinischen Studien als nutzlos, das heißt die Viruslast konnte nicht effizient verringert werden [109-110].

1.5.2 Samenflüssigkeit und Epigallocatechingallat

Der Geschlechtsverkehr mit HCV-Positiven konnte in zahlreichen Studien als Risikofaktor einer Infektion bestätigt werden (vgl. Abb. 2) [17-18]. Man nimmt an, dass die Gefahr mit zunehmender Zahl an Geschlechtspartnern, verletzungsträchtigen Sexualpraktiken [16, 111]

und bei homosexuellen Männern, besonders jene mit einer HIV-Koinfektion [112-114], steigt.

So gibt es Hinweise dafür, dass sich HCV-RNA in menschlichem Sperma befindet [10, 12-13, 115-117]. Außerdem gelang es 1992 Kotwal et al., virale Antigene in Spermaproben von nicht-A-nicht-B-Hepatitis-Patienten (NANBH) zu isolieren [118]. Allerdings sind auch gegenteilige Forschungsergebnisse publiziert worden, bei denen trotz Seropositivität für HCV-RNA kein Erbmaterial in der Samenflüssigkeit der Patienten nachgewiesen werden konnte [119-120]. Welche Rolle nun die Anwesenheit von HCV-RNA im Sperma bei der Infektionsübertragung einnimmt und welche Relevanz diese hat, konnte bisher nicht eindeutig geklärt werden.

Kürzlich wurden sich aus Fragmenten der in Samenflüssigkeit vorkommenden prostatisch- sauren-Phosphatase (PAP) bildende amyloide Fibrillen entdeckt. Diese Amyloidfibrillen, die sich aus den natürlich und reichhaltig präsenten Fragmenten (PAP 248-286) formen, werden

auch Semen-derived Enhancer of Virus Infection (SEVI) genannt. Münch et al. [121] konnten zeigen, dass SEVI gezielt HIV-Virionen erkennen und sowohl deren Anheftung an als auch die Fusion mit den Zielzellen fördern. Somit wird der Virustiter um einige Größenordnungen gesteigert. Die Korrelation von der HIV-Viruslast und dem Ausmaß der durch SEVI gesteigerten Infektiosität von Sperma waren dabei invers. SEVI wurde damit als Hauptakteur in der sexuellen HIV-Transmission, die klinisch die größte Relevanz hat, identifiziert.

Ebenfalls gelang es Hong et al. durch SEVI gesteigerte Infektionsraten von primärem prostatischen Epithel und Stromazellen mit dem xenotropen-Mäuse-Leukämievirus- verwandten Virus nachzuweisen [122].

Daten bezüglich einer möglichen Rolle von SEVI in der sexuellen Übertragung von HCV sind hingegen bislang nicht veröffentlicht worden.

Es ist darüber hinaus ein Antioxidans, das Epigallocatechingallat (EGCG) identifiziert worden, das möglicherweise einen inhibitorischen Effekt auf SEVI ausüben kann [123].

EGCG ist ein Catechin, das der Untergruppe der Polyphenole angehört. Es sind bisher drei Derivate von EGCG charakterisiert worden: Epigallocatechin (EGC), Epicatechingallat (ECG) und Epicatechin (EC). EGCG beansprucht den Hauptanteil der in grünem Tee enthaltenen Catechine. In der Literatur werden ihm antikanzerogene, antibakterielle und antivirale Effekte zugesprochen [124-125]. EGCG scheint in der Lage zu sein, native Polypeptidketten zu binden und so die Missbildung zu Amyloidfibrillen, die z.B.

neurodegenerative Erkrankungen wie Morbus Alzheimer oder Morbus Parkinson zur Folge hätten, zu verhindern [126]. Auch auf die sich in menschlichem Sperma bildenden Amyloidfibrillen (SEVI) hat EGCG wie oben erwähnt möglicherweise einen Einfluss. So fanden Hauber et al. im Kontext ihrer HIV-Forschungstätigkeit kürzlich heraus, dass es SEVI in seiner Aktivität inhibieren und zusätzlich abbauen kann. Dabei griff EGCG dosisabhängig in die Fibrillogenese ein. Die HIV-infektiositätssteigernde Wirkung von SEVI soll demnach durch EGCG vermindert werden [123].

Darüber hinaus konnte eine inhibitorische Aktivität von EGCG gegenüber der HCV NS3- Serinprotease nachgewiesen werden [127]. Weitere Erkenntnisse auf diesem Forschungsgebiet sind bisher allerdings nicht erlangt worden.

1.6 Themenstellung und Ziel der Arbeit

Bisher ist die Datenlage bezüglich der klinisch äußerst relevanten Gefahr einer HCV- Transmission durch Körperflüssigkeiten und der Nutzen eventueller natürlicher antiviraler Wirkstoffe wenig eindeutig. Zudem ist auf diesem Gebiet noch nicht viel bekannt. Daraus ließen sich folgende Fragestellungen für die vorliegende Arbeit formulieren:

1. Welches Risiko geht von der Muttermilch einer HCV-infizierten stillenden Mutter aus? Ist das Virus in der Muttermilch überhaupt stabil? Gibt es möglicherweise Faktoren in der Muttermilch, die die HCV-Infektiosität vermindern und somit antiviral auf das Virus wirken? Welche könnten diese sein?

2. Wie verhält sich das Virus in Anwesenheit von Samenflüssigkeit und SEVI? Kann die Infektiosität von Sperma, analog zu wissenschaftlichen Befunden bei HIV, durch die sich formenden Amyloidfibrillen gesteigert werden?

3. Welchen Einfluss kann EGCG auf die Infektiosität von HCV nehmen? Zeigt es antivirale Eigenschaften gegenüber dem Virus?

Schließlich sollte mit der Abklärung der oben aufgestellten Fragestellungen ein sichererer Umgang mit diesen Körperflüssigkeiten gewährleistet und eine eventuell daraus resultierende sinkende Inzidenz der HCV-Infektion erzielt werden. Darüber hinaus galt es einen möglicherweise antiviral wirksamen Wirkstoff zu identifizieren, der in der Therapie einer bestehenden HCV-Erkrankung von Nutzen seien könnte.

2. Materialien und Methoden

2.1 Materialien

2.1.1 Zellen Bakterienstamm

E.coli DH5α Genotyp: fhuA2 Δ(argF-lacZ)U169 phoA glnV44 Φ80 Δ(lacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17

Säugerzellen

Verwendete Zelllinien

Huh-7.5 Durch IFN-α geheilte humane Hepatoma Replikon-Zelllinie mit einer Punktmutation im zellulären dsRNA-Sensor, dem durch Retinolsäure-induzierbaren Gen I (RIG-I) [52]

293T ATCC Nummer: CRL-1673. Embryonale Nierenzellen, die das SV40 „largeT“

Antigen exprimieren

2.1.2 Medien Bakterien

LB-Medium 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl; 100 mg/ml Ampicillin. Zur Verfestigung kann dem Flüssigmedium 1,5% Agar-Agar zugesetzt werden.

2.1.3 Antikörper Primärantikörper

Tabelle 2: Verwendete Primärantikörper

Antikörper Spezies Typ Bemerkungen

α-NS5A_JFH1 (9E10) Maus monoklonal 1:2000 IF; 1:2 TCID⁵⁰

1 Molecular Probes, Leiden, Niederlande; 2 Sigma, Taufkirchen

2.1.4 Plasmide

Tabelle 4: Verwendete Plasmide

Name Resistenz Beschreibung

pFK-Luc-JFH1/J6/XbaI/C- 846_dg

pFK-JFH1/J6/C-846_dg

pcDNA pcZ-J6

pcZ-VSV-Gwt pHit60

pRVF-luc

Ampicillin

Ampicillin

Ampicillin

Ampicillin

Ampicillin

Ampicillin

Ampicillin

Bicistronisches Plasmid zur in vitro

Transkription des HCV RNA Genoms über die T7-Polymerase. Dabei liegt F-luc im ersten Cistron, gefolgt von einer EMCV

Plasmid zur Generierung von Konstrukten voller Länge ohne Reporter

Expressionsplasmid (Invitrogen)

Plasmid zur Expression des HCV-Hüllproteins (J6-Genotyp 2a)

Plasmid zur Expression des VSV-Glykoproteins G

Retrovirales Verpackungsplasmid auf der Basis von MLV (murines Leukämievirus)

Retrovirales Transferplasmid auf der Basis von MLV. Enthält als Reporter die „Firefly“- Luziferase

Sekundärantikörper

Tabelle 3: Verwendete Sekundärantikörper

Antikörper Spezies Bemerkungen

α - Maus IgG1 α - Maus IgG²

Ziege Ziege

Alexa Fluor 488; 1:1000 IF HRP (horseradish

peroxidase); 1:200 TCID⁵⁰

2.1.5 Puffer und Lösungen

Natriumacetat-Essigsäure-Puffer (Acetatos): 75 ml 0,5 M Natriumacetat; 30 ml 0,5 M Essigsäure; ad 1 Liter Wasser

Carbazol-Lösung: 0,4 g 3-Amino-9-ethyl-carbazol in 125 ml N,N-Dimethylformamid

Cytomix: 120 mM KCl; 0,15 mM CaCl2; 10 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,6); 25 mM Hepes (pH 7,6); 2 mM EGTA; 5 mM MgCl₂; der pH-Wert der Lösung wurde mit KOH auf 7,6 eingestellt; vor Gebrauch wurde der Lösung 2 mM ATP (Titration auf pH 7,6 mit KOH);

5 mM Glutathion zugesetzt.

2 M Natriumacetat (NaOAc): 16,041 g NaOAc in 100 ml Wasser; pH 4,5 3 M Natriumacetat (NaOAc): 24,61 g NaOAc in 100 ml Wasser; pH 5,2

DNA Ladepuffer (Orange G): (10x Puffer) 16,5 ml 0,15 M Tris/HCL, pH 7,5; 30 ml Glycerol; 3,5 ml H2O + Orange G (0,25 g auf 100 ml, Sigma-Aldrich Cat. No. O-3756).

Luziferase Lysepuffer: 1% Triton-x-100; 25 mM Glycyl-Glycin (pH 7,8); 15 mM Magnesiumsulfat; 4 mM EGTA; bei 4°C lagern; vor Gebrauch 1 mM DTT frisch zusetzen.

Luziferase Testpuffer: 25 mM Glycyl-Glycin (pH 7,8); 15 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH7,8); 15 mM Magnesiumsulfat; 4 mM EGTA; vor Gebrauch 1 mM DTT und 2 mM ATP frisch zusetzen .

Luziferase Substratlösung: 1 mM Luziferinlösung in 25 mM Glycyl-Glycil-Lösung 1:5 mit 25 mM Glycyl-Glycin-Lösung verdünnen.

PBS (10-fach): 80 mM Di-Natriumhydrogenphosphat; 20 mM Natrium-di- Hydrogenphosphat; 1,4 M NaCl.

TAE (40-fach): 193,82 g Tris-OH; 65,62 g NaAc; 29,78 g EDTA im Wasser lösen; pH mit ca. 50 ml Essigsäure auf 8,3 einstellen und mit Wasser auf 1 l auffüllen.

Transkriptionspuffer RRL (5-fach): 400 mM Hepes (pH 7,5); 60 mM MgCl2; 10 mM Spermidin; 200 mM DTT.

0,5 % Triton-X/PBS: 5 ml Triton-X in 1 l 1 x PBS

2.1.6 Muttermilchproben

Die Versuche wurden mit drei unterschiedlichen Muttermilchproben (Muttermilch.1/.2/.3) von anonymen, HCV-negativen Spenderinnen durchgeführt. Als Mutterersatzmilch wurde die Pre Anfangsmilch der Marke Milasan verwendet. Stutenmilch: Haflinger, 18 Jahre alt;

Kuhmilch: Pool aus Milchproben von 20 Kühen der Rasse Holstein-Friesian; Biestmilch:

Holstein-Friesian, ca. 24 h nach dem Kalben. Die Lagerung aller Proben erfolgte bei -20°C.

2.1.7 Spermaproben

Es wurde mit Spermaproben von sowohl zehn unabhängigen anonymen HCV-negativen Einzelspendern als auch mit einem Spermapool, der sich aus 30 anonymen HCV-negativen Samenspendern zusammensetzte, gearbeitet. Die Bereitstellung des Materials erfolgte durch Prof. Münch (Virologisches Institut, Universitätsklinikum Ulm). Die Lagerung erfolgte bei -20°C.

2.1.8 SEVI

SEVI wurde in einem Aliquot in der Konzentration von 10 mg/ml von Prof. Münch (Virologisches Institut, Universitätsklinikum Ulm) zur Verfügung gestellt. Die Lagerung erfolgte bei 4°C.

2.1.9 EGCG, EGC, ECG, EC

Es wurden Präparate der Firma Sigma-Aldrich benutzt. Die Lagerung erfolgte bei 4°C.

2.1.10 Lactoferrin

Lactoferrin from human milk, approx. 90% SDS-PAGE; Lactoferrin from bovine milk, approx. 90% by SDS gel-electrophoresis.

Es wurden Präparate der Firma Sigma-Aldrich benutzt. Die Lagerung erfolgte bei 4°C.

2.2 Methoden

Alle Zentrifugationen ohne Angaben eines Rotors wurden in Eppendorf Tischzentrifugen durchgeführt. Es wurden die Modelle 5417C und 5417R verwendet.

2.2.1 Transformation von Bakterien

Es wurden 100 µl kompetente Bakterien mit 1 µl Plasmid-DNA für ca. 20 Minuten auf Eis lagernd inkubiert. Nach einem Hitzeschock von 1,5 Minuten bei 42°C wurden zu jedem Ansatz 500 µl LB-Medium pipettiert. Es folgte eine aerobe Inkubation für 45 Minuten bei 37°C. Danach wurden die Bakterien abzentrifugiert und das entstandene Pellet in 100 µl LB-

Medium resuspendiert. Anschließend erfolgte die Ausplattierung der Bakterien auf Selektivnährböden und deren Kultivierung bei 37°C über Nacht.

2.2.2 Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterienkulturen

Zur Präparation von 100 ml E.coli-Kulturen (Midi) wurde das NucleoSpin Plasmid Kit (Machery-Nagel, Düren) nach Angaben des Herstellers verwendet.

Es wurde die Übernachtkultur in 50 ml Falcons für zehn Minuten bei 4°C abzentrifugiert (6000UpM; Sorvall RCGPlus, Thermo; Rotor F13S-14x50cy (FiberLite PTI)). Das entstandene Pellet wurde zur Lyse der Zellen in 4 ml A1-Puffer resuspendiert. Anschließend wurden 4 ml des A2-Lysepuffers, und nach maximal fünf Minuten 4,8 ml des A3- Neutralisationspuffers hinzugegeben. Die darauffolgende Zentrifugation wurde für 20 Minuten bei 4°C (12000UpM; Sorvall RCGPlus,Thermo; Rotor F13S-14x50cy (FiberLite PTI)) durchgeführt. Der Überstand wurde abgenommen und auf vier NucleoSpin Plasmid Säulen aufgetragen. Das Lysat wurde zweimal mit je 500 µl des erhitzten (ca. 50°C) AW- Waschpuffers und einmal mit 700 µl des A4-Waschpuffers gewaschen. Die Elution der Plasmid-DNA erfolgte mit je 50 µl AE-Puffer (5mM Tris/HCL, pH 8,5).

2.2.3 In-vitro-Transkription

Zunächst mussten die für die in-vitro-Transkription benötigten Transkripte hergestellt werden. Hierzu wurden 10 µg der Plasmide (Jc1 Genom; Jc1 Genom mit „Firefly“Luziferase) für eine Stunde mit MluI (NEB) linearisiert. Es folgte eine DNA Aufreinigung mittels Phenol/Chloroform-Extraktion. Dafür wurde die DNA mit 0,1 Volumen 3 M Natriumazetat (pH 6,0) vermischt und zweimal mit 1 Volumen Phenol, gesättigt mit Tris- Ethylendiamintetraessigsäure, und einmal mit 1 Volumen Chloroform extrahiert. Die DNA Fällung erfolgte durch Zugabe von 2,5 Volumen 100% Ethanol und einer Inkubationszeit von 20 Minuten bei -20°C. Die DNA wurde anschließend für 20 Minuten bei 20.000 x g und 4°C zentrifugiert. Daraufhin wurde die gefällte DNA mit 80% Ethanol gewaschen, an der Luft getrocknet und in 65 µl RNAase-freiem Wasser in Lösung gebracht.

Das Gesamtvolumen von 100 µl des Transkriptionsansatzes für die in-vitro-Transkription setzte sich zusammen aus 20 µl 5x RRL-Transkriptionspuffer, 12,5 µl einer 25 mM rNTP Lösung, 100 U RNasin (Promega), 65 µl aufgereinigter und linearisierter DNA-Lösung und 60 U T7-RNA-Polymerase (Promega). Der Ansatz wurde für zwei Stunden bei 37°C inkubiert, anschließend wurden 30 U der T7-Polymerase hinzupipettiert, gefolgt von einer

weiteren zweistündigen Inkubation bei 37°C. Schließlich wurde die Transkriptionsreaktion durch die Zugabe von 7,5 U RNase-freier DNase (Promega) und einer erneuten Inkubation von 30 Minuten bei 37°C beendet. Daraufhin wurden 60 µl 2M Natriumazetat (pH 4,5), 440 µl RNase-freies Wasser und 400 µl wassergesättigtes Phenol zugegeben. Der Ansatz wurde für zehn Minuten auf Eis inkubiert. Die Lösung wurde anschließend für zehn Minuten bei 20.000 x g und 4°C zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde dann in ein neues Reaktionsgefäß überführt und die RNA nach Zugabe von einem Volumen Chloroform extrahiert. Die Fällung der RNA wurde schließlich durch die Zugabe von 0,7 Volumen Isopropanol erzielt und diese durch Zentrifugation von zehn Minuten bei 20.000 x g bei Raumtemperatur abzentrifugiert.

Das entstandene Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen, an der Luft getrocknet und in 50 µl RNase-freiem Wasser aufgenommen. Die Konzentration der RNA wurde, wie unter 2.2.4 beschrieben, bestimmt und die Intaktheit der in-vitro-Transkripte durch Agarose- Gelelektrophorese überprüft.

2.2.4 Auftrennung von DNA und RNA mittels Agarose-Gelelektrophorese

Das Prinzip der Agarose-Gelelektrophorese zum Nachweis von DNA bzw. RNA besteht in der Größenauftrennung ihrer Fragmente im elektrischen Feld. Es wurden hierzu Agarosekonzentrationen von 1% benutzt. Die Agarose (Invitrogen, Karlsruhe) wurde in 1 x TAE-Puffer kurz aufgekocht und anschließend auf ca. 50°C abgekühlt. Die Gele wurden vor dem Gießen mit je 0,01 ml Ethidiumbromid (Stocklösung 10 µg/ml; Roth) auf 100 ml Agaroselösung versetzt. Zu den Proben wurde 1/6 Volumen 6 x Ladepuffer (Orange G;

Sigma-Aldrich, Taufkirchen) hinzugefügt. Zur vergleichenden Bestimmung der Anzahl und der Größe der Fragmente wurde ein entsprechender Marker mit bekannten Bandengrößen mit aufgetragen (Lambda-DNA/Eco130/, Fermentas GmbH, St.Leon-Rot). Die Elektrophorese wurde in 1 x TAE-Puffer bei 120 Volt durchgeführt. Die Visualisierung der DNA-Fragmente bzw. der RNA erfolgte unter UV-Licht mit einer Wellenlänge von 320 nm und deren Dokumentation mit dem Gel iX Imager (UV-Systeme, Intas, Göttingen).

2.2.5 Konzentrationsmessung von Nukleinsäuren

Die Bestimmung der Konzentration von DNA und RNA erfolgte photometrisch mittels eines Photometers bei 260 nm in einer Quarzküvette. Dabei entspricht 1 OD260 50 µg/ml doppelsträngiger DNA und 1 OD260 40 µg/ml RNA. Als Referenz für die Messung diente das entsprechende Lösungsmittel.

2.2.6 Kultivierung von Säugerzelllinien

Alle in dieser Arbeit benutzten Zelllinien wurden in DMEM cplt Medium bei 37°C in einer H2O-gesättigten 5%-igen CO2 Atmosphäre kultiviert. Die Subkultivierung der Zellen erfolgte entsprechend ihres Wachstumes alle zwei bis vier Tage. Dazu wurde bei konfluenten Zellen das Kulturmedium abgenommen, die Zellen mit sterilem 1 x PBS gewaschen und mit 0,05%

Trypsin/0,02% EDTA-Lösung (Gibco; verdünnt mit sterilem PBS) trypsiniert. Nach einer kurzen Inkubationszeit von ca. fünf Minuten konnten die Zellen durch Abklopfen vom Kulturgefäßboden gelöst und in frischem Kulturmedium aufgenommen werden. Die Zellen wurden daraufhin in geringerer Dichte in ein anderes Kulturgefäß ausgesät.

2.2.7 Kryokonservierung von Zellen

Ungefähr 10⁶ Zellen wurden in Suspension für fünf Minuten bei 100 x g (Heraeus Multifuge 1SR; Thermo) pelletiert. Die sedimentierten Zellen wurden in Kryolösung (45ml FKS + 5ml DMSO) aufgenommen und auf -80°C abgekühlt. Nach ein bis zwei Wochen wurden sie für die dauerhafte Lagerung zu -150°C überführt.

Um die zuvor kryokonservierten Zellen wieder in Kultur zu bringen, wurden diese zunächst in einem Wasserbad bei 37°C aufgetaut, dann in Medium überführt und bei 100 x g (Hereaus Multifuge 1SR; Thermo) für fünf Minuten sedimentiert. Schließlich konnten die Zellen in Medium aufgenommen und in Zellkulturgefäße überführt werden.

2.2.8 Bestimmung der Zelldichte

Um die Dichte der Zellen in einer Suspension zu bestimmen, wurde eine Neubauer Zählkammer (LO-Laboroptik, Friedrichsdorf) benutzt. Eine Probe der Zellsuspension wurde in die Zählkammer gegeben und die Anzahl der Zellen in 16 Zählquadraten bestimmt. Das Volumen zwischen Zählkammer und Deckglas beträgt über 16 Quadrate 0,1 µl. Der gezählte Wert multipliziert mit 1 x 10⁴ ergibt somit die Anzahl der Zellen pro ml.

2.2.9 RNA-Transfektion

Mittels der Elektroporation wurden die in-vitro-Transkripte in Huh-7.5-Zellen transfiziert.

Dafür wurden die Zellen mit 1 x PBS gewaschen, mit 0,05% Trypsin/0,02% EDTA abgelöst und in DMEM cplt Medium aufgenommen. Die Zellzahlbestimmung erfolgte mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer. Das benötigte Zellvolumen wurde für fünf Minuten bei 1000 UpM

zentrifugiert, dann mit 1 x PBS gewaschen und erneut für fünf Minuten bei 1000 UpM zentrifugiert. Das Pellet wurde in einer Konzentration von 1,5 x 10⁷ Zellen/ml in 400 µl Zytomix resuspendiert. Die Zellsuspension wurde mit 5 oder 10 µg RNA in eine Elektroporationsküvette (0,4 cm Spaltbreite, BioRad, München) überführt und mit einem Gene-Pulser (BioRad) bei 975 µF und 270 Volt elektroporiert. Die Zellsuspension wurde schließlich je nach Experiment in 10 bis 16 ml Medium aufgenommen und ausgesät. Der Zellkulturüberstand wurde nach 48 und 72 Stunden abgenommen und filtriert (Porengröße:

0,45 µm) und je nach Experiment, z.B. zur Herstellung eines Virusstocks, aufkonzentriert (Amicon (Jc1-luc) bzw. Zentricon (Jc1 wt); Millipore).

2.2.10 DNA-Transfektion mit Lipofectamin

Die Durchführung der Transfektion mit Lipofectamine 2000 (Invitrogen) erfolgte gemäß Herstellerangaben.

2.2.11 Generierung von HCV-Pseudopartikeln

293T-Zellen wurden mit den Plasmiden pHit60, pRVF-luc und VSV-Gwt im Verhältnis 1:1:1 mit Hilfe von Lipofectamin nach Angaben des Herstellers für die Generierung von MLV- basierten VSV Pseudopartikeln transfiziert. Für die Erstellung MLV-basierter HCV Pseudopartikel wurden die Plasmide pHit60, pRVF-luc und ein Plasmid mit den HCV Hüllproteinen des Isolates J6, ebenfalls im Verhältnis 1:1:1 eingesetzt. Die Inkubation der Zellen erfolgte bei 37°C und 5% CO₂. Nach 48 Stunden Inkubationszeit wurden die Zellkulturüberstände abgenommen, filtriert (Porengröße 0,45 µm) und zur Infektion von Huh- 7.5 Zielzellen benutzt.

2.2.12 Immunfluoreszenz (IF)-Analyse

In eine 24-Napf-Platte wurden Huh-7.5-Zellen in einer Dichte von 4 x 10⁴ Zellen/Napf auf Deckgläschen ausgesät. Die Zellen wuchsen für ein bis zwei Tage, bevor sie mit 400 µl 3%

Paraformaldehyd für zehn Minuten bei Raumtemperatur fixiert wurden. Vor der Fixierung wurden die Zellen einmal mit 1 x PBS, nach der Fixierung dreimal mit 1 x PBS gewaschen.

Es erfolgte die Permeabilisierung der Zellen mit 0,5% TritonX-100/PBS. Die diversen Primärantikörper wurden gemäß den Verdünnungen in Tabelle 2 verdünnt. Eine unspezifische Antikörperbindung wird durch die Zugabe von 5% Ziegennormalserum verhindert. Nach

einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur erfolgten drei Waschungen mit 1 x PBS und die Zugabe des an Fluoreszenzfarbstoffe gekoppelten Sekundärantikörpers (vgl. Tabelle 3), verdünnt in 1 x PBS mit 5% Ziegennormalserum. Es folgte eine Inkubationszeit im Dunkeln von 30 Minuten, dann eine einmalige Waschung mit 1 x PBS und die Färbung der Zellkerne mit DAPI (4,6-diamino-2-phenylindol-Dihydrochlorid, Molecular Probes). Dazu wurde die DAPI-Lösung 1:3000 (1:300 in H₂O, dann 1:10 Verdünnung in PBS) verdünnt und die Zellen mit der Lösung für eine Minute im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die auf Deckgläschen fixierten Zellen dreimal mit PBS und einmal mit Wasser gewaschen, um dann, in Fluoromount-G (Southern Biotechnology Associates) eingebettet, auf Objektträgern fixiert zu werden. Die Immunfluoreszenz-Aufnahmen wurden schließlich an einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus IX 81) durchgeführt.

2.2.13 „Firefly“-Luziferase-Aktivitätsbestimmung

Zellen, die mit HCVcc oder HCVpp infiziert worden waren, wurden mit 1 x PBS gewaschen, in unterschiedlichen Volumina von Lyse-Puffer aufgenommen (für 6-Napf -Platte: 1ml; für 12-Napf-Platte: 350 µl; für 96-Napf-Platte: 35 µl) und bei -20°C eingefroren. Die Zelllysate wurden auf Eis aufgetaut. Bei der 6-bzw. 12-Napf-Platte wurden 100 µl des Lysats mit 360 µl des Probenpuffers versetzt. Mittels eines Luminometers (Lumar LB9507, Berthold) erfolgte die Aktivitätsbestimmung. Nach Injektion von 200 µl 200 mM Luziferinlösung wurde das Substrat von der „Firefly“-Luziferase umgesetzt und die Freisetzung der Photonen für 20 Sekunden gemessen. Bei der 96-Napf-Platte wurden 20 µl des Lysates für die Aktivitätsbestimmung im Mikroplattenluminometer (Berthold Microplate Reader LB 960 Centro XS³; Berthold Technologies DLReady) verwendet. Die Injektion von Probenpuffer und Luziferinlösung erfolgten innerhalb des Gerätes.

2.2.14 Histochemie und Virustitration (TCID50)

Dem Verfahren liegt das Protokoll von Lindenbach et al. [128] zur Virustiterbestimmung zu Grunde. Pro Napf einer 96-Napf-Platte wurden 200 µl einer Huh-7.5-Zellsuspension mit 5 x 10⁴ Zellen/ml ausgesät und für 24 Stunden bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Die filtrierten und konzentrierten Überstände der zuvor transfizierten Huh-7.5-Zellen wurden in einer Verdünnungsreihe titriert, wobei sechs Näpfe der naiven Huh-7.5-Zellen pro Verdünnung (1:10) infiziert wurden. Nach 72 Stunden wurden die Zellen mit eisgekühltem Methanol fixiert und für mindestens 20 Minuten bei -20°C gelagert. Das Methanol wurde anschließend

entfernt, die Zellen kurzzeitig an der Luft bei Raumtemperatur getrocknet und dann einmal mit 1 x PBS gewaschen. Es folgte die fünfminütige Permeabilisierung der Zellen mit 50 µl 0,5 % TritonX-100/PBS pro Napf. Daraufhin wurden die Zellen einmal mit 1 x PBS gewaschen, um dann für 45 Minuten mit dem Primärantikörper gegen NS5A (vgl. Tabelle 2) bei Raumtemperatur zu inkubieren. Die Zellen wurden anschließend dreimal mit 1 x PBS gewaschen, um dann für eine Stunde bei Raumtemperatur mit dem HRP-gekoppelten Sekundärantikörper α-Maus IgG (vgl. Tabelle 3) zu inkubieren. Es schlossen sich erneut drei Waschgänge mit 1 x PBS an. Zur Detektion wurde das HRP-Substrat aus 5 ml Acetatos, 1,5 Carbazol-Gemisch und 20 µl Wasserstoffperoxid angesetzt und mit einer Porengröße von 0,45 µm gefiltert. Es wurden 30 µl des Substrates pro Napf für die ca. 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur verwendet. Die Reaktion wurde mit Wasser gestoppt. Da NS5A- exprimierende Zellen rot gefärbt werden, konnten diese unter dem Lichtmikroskop identifiziert werden. Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte statistisch nach der Methode von Kärber und Spearman [129-130].

2.2.15 Dichtegradient

Zwei Tage nach der Elektroporation von HCV-RNA in Huh-7.5-Zellen, wurden die daraufhin produzierten infektiösen Partikel (HCVcc) geerntet, gefiltert (Porengröße: 0,45 µm) und konzentriert (Amicon). Ein Milliliter des Ansatzes wurde so unter einen 0, 10, 20 und 30%

Iodixanol Schritt-Gradienten (Optiprep; Axis-Shield, Oslo, Norwegen) geschichtet, dass sich ein Endvolumen von 40% ergab. Dieser wurde hergestellt aus CSM („cell suspension medium“), bestehend aus 0,85% (wt/vol) NaCl und 10 mM Tricine-NaOH (pH 7,4). Die Gradienten wurde für 16 Stunden bei 30.000 x g und 4°C zentrifugiert (Sorvall Ultra WX80;

Rotor TH-641). Die Fraktionen (neun à 1 ml) wurden vom Grund der Röhrchen (12 ml PET Röhrchen; Thermo) geerntet und zur weiteren Infektion von Huh-7.5-Zellen in An- oder Abwesenheit von SEVI verwendet. Die Dichte der Fraktionen wurde mit einem Refraktometer bestimmt. Die Lagerung der Fraktionen erfolgte bei -80°C.

3. Ergebnisse

3.1 Untersuchung des Einflusses von Muttermilch und seiner Komponenten auf die Stabilität und Infektiosität von HCV

Bisher sind in der Literatur, trotz zahlreicher Studien zum Nachweis von HCV-RNA in humaner Muttermilch, keine Angaben zu der eigentlichen Stabilität des Hepatitis-C-Virus‘ in Gegenwart von Muttermilch gemacht worden. Es scheint allerdings so zu sein, dass das Virus nicht oder nur sehr selten durch das Stillen von der Mutter auf ihr Kind übertragen wird [3].

Es stellt sich somit die Frage anheim, welche Gründe es für dieses Phänomen gibt und ob es vielleicht Faktoren in der Muttermilch gibt, die eventuell eine inhibitorische Wirkung auf das Virus haben. Bis dato wurde gezeigt, dass das Eisentransporterprotein Lactoferrin, das einen natürlichen Bestandteil der Muttermilch darstellt, vermutlich einen Einfluss auf die HCV- Infektiosität hat [83, 99-100, 102-104]. Ebenfalls sind CAMP, welchen zahlreiche antimikrobielle Eigenschaften nachgewiesen wurden [89-91], in Muttermilch enthalten. Über deren potentielle antivirale Wirkung ist hingegen nichts bekannt.

Erst seit kurzem steht ein HCV-in-vitro-System zur Verfügung, welches die authentische Simulation der Virustransmission zulässt. Daher dienten die im folgenden Teil meiner Arbeit durchgeführten Experimente der erstmaligen realitätsnahen Untersuchung der Stabilität des Virus‘ unter verschiedenen Konditionen der Muttermilchpräsenz. Darüber hinaus wurde versucht, die beobachteten Effekte näher einzugrenzen und die verantwortliche(-n) Komponente(-n) der Muttermilch zu identifizieren.

3.1.1 Testung des Einflusses von Muttermilch auf Huh-7.5-Zellen

Zu Beginn wurde der Effekt von Muttermilch auf Huh-7.5-Zellen getestet. Dies diente dem Zweck eventuelle Fehlinterpretationen von Versuchsausgängen zu vermeiden, die eine infektionsmindernde Wirkung allein von Muttermilch suggerieren. Dabei könnte jedoch der Effekt schon auf die durch Vorinkubation mit Muttermilch veränderten Hepatozyten zurückzuführen sein. Es sollte somit untersucht werden, ob gewisse Komponenten aus der Muttermilch durch die Leberzellen aufgenommen werden, die dann einen Einfluss auf HCV ausüben. Huh-7.5-Zellen wurden auch für alle weiteren Versuche mit Muttermilch verwendet.

Für den Versuch wurden mindestens 7 h zuvor ausgesäte Huh-7.5-Zellen in einem Verhältnis von 1:10, 1:100 und 1:1000 mit Muttermilch einer Spenderin (Muttermilch.1) für 16 h (Abb.

5D) bei 37°C in einer 5%-igen CO2-Atmosphäre inkubiert. Anschließend wurden die Zellen einmal mit 1 x PBS gewaschen, mit frischem Medium (DMEM cplt) versorgt und mit infektiösen HCVcc (Jc1 Wildtyp (Jc1 wt)) infiziert. Als Kontrolle dienten Huh-7.5-Zellen, die nicht mit Muttermilch vorinkubiert wurden. Der in der Kontrolle erreichte Virustiter ist in Abbildung 5B als rote Linie wiedergegeben. Mittels eines seriellen Verdünnungsassays wurde der Virustiter schließlich analysiert. Die Angabe des Titers erfolgt als „tissue culture infectious dose 50%“ (TCID50/ml). Dabei beschreibt TCID50 die Verdünnung, bei der 50%

der jeweils sechs unabhängig inokulierten Zellkulturnäpfe mindestens ein Infektionszeichen zeigen. Der Nachweis wurde durch histochemisches Anfärben des HCV-NS5A-Proteins erzielt. Das experimentelle Prozedere ist modellhaft in Abbildung 5A und das Versuchsergebnis in Abbildung 5B dargestellt.

In dem Versuch ließ sich gegenüber den nicht mit Muttermilch vorbehandelten Zellen eine Titerreduktion von vergleichsweise einer Zehnerpotenz in der 1:10-Verdünnung sowie eine minimale Verminderung in den Verdünnungen von 1:100 und 1:10000 beobachten.

3.1.2 Überprüfung der Stabilität von HCV in Gegenwart von Muttermilch zu unterschiedlichen Zeitpunkten

Da kein signifikanter Effekt der Muttermilch auf die Hepatozyten verzeichnet werden konnte, sollte die Langzeitstabilität von HCV in Gegenwart von Muttermilch in einem nächsten Schritt überprüft werden. Dazu wurden filtrierte und aufkonzentrierte HCVcc (Jc1 wt) zusammen mit Muttermilch einer Spenderin 1, 2, 3, 4 und 7 Tage in einer 1:10 Verdünnung bei Raumtemperatur (RT) inkubiert und anschließend zur Überprüfung des Virustiters mittels TCID50 titriert. Der Nachweis infizierter Zellen gelang mit Hilfe einer HCV-Histochemie (Abbildung 6A).

Dabei waren die Zellen in der ersten und damit niedrigsten Verdünnungsreihe so stark geschädigt worden, dass sie bei der Auswertung nicht mehr zu visualisieren waren. Dieser resultierende Wert ist in den Abbildungen 6B und 6C mit „Zytotoxizität“ angegeben. In den höheren Verdünnungen konnte ebenfalls keine Infektion der Huh-7.5-Zellen festgestellt werden, so dass eine effiziente Infektion naiver Huh-7.5-Zellen in Anwesenheit von Muttermilch nach 24 h nicht mehr möglich zu sein scheint (vgl. Abb. 6B).

Um diese Aussage zu überprüfen und die Vergleichbarkeit aller drei Muttermilchproben zu gewährleisten, wurden erneut HCVcc (Jc1 wt) zusammen mit jeweils einer Muttermilchprobe für 24 h bei Raumtemperatur in der gleichen Verdünnung inkubiert und schließlich mittels TCID₅₀ titriert (vgl. Abb. 6C). Es konnte der gleiche Effekt wie im vorherigen Experiment beobachtet werden: Die Zellen in der ersten Verdünnungsreihe waren zu Grunde gegangen und bei den weiteren Verdünnungen konnte keine Zellinfektion detektiert werden. Da das Ergebnis für alle drei Muttermilchproben zutraf, kann von einer Vergleichbarkeit der Proben untereinander ausgegangen werden.

In beiden Experimente diente eine Inkubation von Medium (DMEM cplt) mit HCVcc zu gegebenen Zeitpunkten als Kontrolle. Der Virustiter war in beiden Versuchen mit ca. 10⁵ TCID50/ml (Abb. 6B) bzw. 10⁶ TCID50/ml (Abb. 6C) erwartungsgemäß hoch.

3.1.3 Vergleich der Effekte von Muttermilch zu Milchproben anderer Spezies

Es sollte im weiteren Verlauf getestet werden, ob sich die humane Muttermilch hinsichtlich des Einflusses auf HCVcc von der artifiziellen Mutterersatzmilch und der Milch anderer Säuger, wie der Kuh oder der Stute, unterscheidet. Da die Zusammensetzung dieser Körperflüssigkeit von Tier zu Tier verschieden ist (vgl. Tabelle 1), ist es möglich, dass jene jeweils andere als die bis dato beobachteten Auswirkungen auf die Stabilität des Virus‘

aufweisen.

Es wurden hierfür zusammen mit HCVcc (Jc1 wt) jeweils gleiche Mengen von einer Muttermilchprobe, Mutterersatz-, Kuh-, Stuten- und Biestmilch (Kolostralmilch der Kühe) in einem Verhältnis von 1:10 für 24 h bei RT inkubiert. Anschließend erfolgten die Infektion von naiven Zielzellen und der Nachweis des Infektionsausmaßes mittels HCV-Histochemie (vgl. Abb. 6A).

Wie in Abbildung 7 dargestellt, kann bei humaner Muttermilch und Stutenmilch keine Infektion nachgewiesen werden. Hingegen lässt sich bei der Mutterersatzmilch lediglich eine Infektiositätsminderung von weniger als einer halben Zehnerpotenz und bei der Kuh- bzw.

Biestmilch von ca. 1 bis 1,5 Zehnerpotenzen beobachten. Alle Milchproben zeigten dennoch eine vergleichbare Zytotoxizität von 1 x 10² bis 1 x 10³. Die rote Linie in Abbildung 7 repräsentiert die Kontrolle des Versuches, die wiederum durch Inkubation von DMEM cplt- Medium zusammen mit HCVcc erfolgte.

Abbildung 7: Einfluss von Milchproben unterschiedlicher Säugetiere und Mutterersatzmilch auf die HCV- Stabilität. HCVcc (Jc1 wt) wurden zusammen mit den Proben im Verhältnis 1:10 für 24 h bei RT inkubiert und dann zur Infektion von naiven Zielzellen benutzt (TCID₅₀/ml). Bei Muttermilch.1 und Stutenmilch kann keine Infektion mehr detektiert werden. Hingegen zeigen die Proben von Mutterersatz-, Kuh- und Biestmilch eine geringe Infektionsreduktion von 0,5-1,5 Zehnerpotenzen. Die Mediumkontrolle ist als rote Linie angegeben. Die y-Achse zeigt die Infektiosität in TCID₅₀/ml.

3.1.4 Einfluss vorverdünnter Muttermilch auf HCVcc Infektiosität

Mit dem Ziel, die bislang beobachteten Effekte weiter einzugrenzen und somit herauszufinden, ob der Faktor, der zur Infektionsreduktion führt, von der Konzentration abhängig ist, wurde jeweils eine Verdünnungsreihe (1:10; 1:100) der drei Muttermilchproben in 1 x PBS angesetzt. HCVcc wurden anschließend wie gewohnt in einem Verhältnis von 1:10 mit den vorverdünnten Muttermilchproben versetzt und bei RT für 24 h inkubiert, bevor sie zur Zielzelleninfektion gebraucht wurden (vgl. Abb. 6A). Zur vergleichenden Bewertung wurde jeweils eine Kontrolle der unverdünnten Muttermilch und eine Kontrolle mit DMEM cplt-Medium (angezeigt als rote Linie) bzw. 1 x PBS (Kontrolle (PBS)) mitgeführt. Eine Bewertung des Infektionsausmaßes gelang mit Hilfe der TCID₅₀.

In Abbildung 8 wird deutlich, dass in einer Verdünnung von 1:10 keine Infektion gemessen werden kann, sondern nur die schon in anderen Experimenten mit unverdünnter Muttermilch beobachtete Zytotoxizität. In einer Verdünnung von 1:100 hingegen kann bei allen drei Muttermilchproben wieder eine Infektion in Abwesenheit von Zytotoxizität detektiert werden.

Das Infektionsausmaß ist gegenüber den Kontrollproben dennoch um ca. 2 Zehnerpotenzen (Muttermilch.1) beziehungsweise ca. 3,5 Zehnerpotenzen (Muttermilch.2) beziehungsweise ca. 1-1,5 Zehnerpotenzen (Muttermilch.3) reduziert.

A

B

C

Abbildung 8: Einfluss vorverdünnter Muttermilch auf HCVcc-Infektiosität. Unverdünnte und in 1 x PBS vorverdünnte Muttermilch.1 (8A), Muttermilch.2 (8B) und Muttermilch.3 (8C) wurden für 24 h bei RT mit HCVcc (Jc1 wt) inkubiert. Als Kontrolle diente die Inkubation mit DMEM cplt (rote Linie) und 1 x PBS (Kontrolle (PBS)). Anschließend wurden naive Huh-7.5-Zellen infiziert und der Virustiter mittels Histochemie nachgewiesen. Eine 1:10-Vorverdünnung zeigt keinen Unterschied zu unverdünnter Muttermilch (A-C). Bei einer Vorverdünnung von 1:100 hingegen kann Infektiosität in Abwesenheit von Zytotoxizität detektiert werden.

Es besteht allerdings immer noch eine Infektionsreduktion von 2 Zehnerpotenzen (8A) bzw. 3,5 Zehnerpotenzen (8B) bzw. 1-1,5 Zehnerpotenzen (8C). Auf der y-Achse ist die Infektiosität in TCID₅₀/ml aufgetragen.